壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的调节作用研究.pdf

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1、壳雅始糖R H m # H n 月A 壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的调节作用研究 摘要 糖尿病( D M ) 足由于胰岛素分泌量绝对或相对不足引起具有遗传性， 属于常见的内分泌代谢疾病之一，l 播床上通常农现为慢性山糖升高和典型的“三 多少”症状。 甲壳素广泛存在于甲壳纲动物( 如虾和蟹等) 、昆虫的甲壳和真菌( 如酵母、 霉菌等) 中，是一种N 一乙酰D 葡萄糖胺的多聚糖。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化 产物，为白色固体，形状无定形，呈现半透明、略带珍珠光泽，是一种具有多种 生物活性的碱性多耱。对甲壳素和壳聚糖的分子结构进行修饰，得到不同结构的 水溶性壳聚糖衍生物。可使它们的性能得到改进，满足特殊

2、需要。大分子量的壳 聚糖经过降解可以得到分子量较低的壳聚糖产物即低聚合度壳聚糖，这类产物 较壳聚糖有更好的水溶性，并且更加利于机体吸收利用，具有更广泛的应用价值。 本论文以大分子量的壳聚糖为原材料，通过化学合成方法和生物酶降解法制 各了低脱乙酰度的低聚壳聚糖、磺酸化壳聚糖和羧甲基甲壳素，通过测定它们的 相关理化性质，了解三种壳聚糖衍生物的结构。 在动物水平上，以全雄W i s t a r 大鼠为研究对象，通过一次性腹腔注射链脲佐 菌素建立糖尿病大鼠模型，将造模成功的大鼠随机分为正常对照组和模型对照 组，每日分别灌胃一定体积的蒸馏水：低脱乙酰度壳聚糖组( 2 0 0 m g k g ) 、磺酸

3、化壳聚糖组( 2 0 0 m 啦g ) 、羧甲基甲壳素组( 2 0 0 m 卧g ) ，每日分别对大鼠灌胃 三种壳聚糖衍生物。连续灌胃4 5 天后测定空腹血糖变化和糖耐量改变，同时测 定大鼠体重变化，血脂，肝脏、脾脏、肾脏和胰腺的脏器指数，对大鼠胰腺、肾 脏和肝脏进行病理组织学切片观察。 在细胞水平上，以胰岛D 细胞为研究对象，三种壳聚糖衍生物为实验材料， 采用常规细胞培养方法培养R N m 5 f 胰岛细胞系，壳聚糖衍生物设定5 个浓度梯 度( 6 25 m g L 、1 2 5 m g ，L 、2 5 0 m g L 、5 0 0 m g ，L 和】0 0 0 m g ，L ) 并且设定空

4、白对 照组，通过M 丁T 法检测不同培养时间( 4 9h 、9 6h 、1 4 4h ) 胰岛1 3 细胞的增殖 隋况，并计算细胞增殖率( p r o l i f e r a t i o nr a t e ，P R ) ：A I A o x1 0 0 ，实验重复3 次。 实验结果及结沦如下： 1 低脱乙酰度壳聚糖、羧甲基甲壳素、磺酸化壳聚糖的理化性质如下，水分含量 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 些! ! ! ! ! ! ! 分别为59 、5 4 7 、5 , 6 4 ，扶分吉量分别为10 6 、l0 9 、】8 7 3 6 ，脱乙 酰度分别为4 85 3 、1 02 3 、3

5、 75 3 ；羧甲基甲壳豢的羧化度为9 86 5 ，磺酸 化壳聚椭的磺酸化度为8 83 红外光谱删定结果显示，低脱已酰度C T 8 在3 4 4 0 c m 。、1 6 5 0c m 。、1 5 5 7c m 、1 0 7 1c m 。具有特征性吸收峰：C M C 在3 4 4 3c m 一、 1 6 4 9c m 。、1 4 l7c m 。、1 0 6 9c m 1 具有特征性吸收峰；磺酸化壳聚耱在1 2 3 2 c m 。、 7 9 9 c m 。处有特征哦收峰，均具有良好的水溶解性。 2 糖尿病大鼠灌胃4 5 天后，三种壳聚糖衍生物对空腹血糖均有不同的降低作用， 其中低脱乙酰度壳聚糖组和

6、羧甲基甲壳素组的降糖效果较好，3 0d 时出现显著 性差异( P M w1 2 0 0 0 “ 肝素2 1 0 0 0 “ M w 5 4 0 0 0 。 硫酸酯化壳聚糖具有抗肿瘤、抗病毒的功能等1 1 6 17 1 。S h a r o n V V 等人证明 了磺酸化壳聚糖具有增强免疫力、抑制病毒感染的功能，可以通过抑制H I V - I 逆 g m 物“ # R 病 H m * * 作R 转录酶的活性及控制H J v - I 的复制半衰j I | 浓度为7 1 a g m l ，柬防治_ ；! = 滋病毒l I I V 的感染。增加H I V - I 的复制半衰期浓度对H I V 1 蛋白

7、的合成速率起到加速降低的 作用，同时抑制单纯疱疹病毒I 币I 以及劳台氏白血璃病毒。H o r t o n D 和J u s tE K 研究汪明了氮基上接枝了硫酸根的壳聚糖衍生物对于白I 缸病有显著的抑制作川 1 19 1 。另外，l s h i h a r aC 等人2 0 2 1 锰明了羧甲基甲壳素不具有抑制单纯疱疹病毒、 仙台病毒和弗兰德鼠白血病病毒的作用但是硫酸酯化的甲壳素具有抗病毒活 性，由此可见接枝的硫酸基团发挥了抑制病毒的功能。 硫酸酯化壳聚糖具有免疫功能，M u r a t aJ1 2 2 啪S a i k i1 1 2 3 1 通过比较肝索和硫酸 酯化的壳聚糖对肿瘤的抑制作用

8、，详细地研究了它的作用机理硫酸酯化壳聚糖 可以抑制生成诱导肿瘤产生的的血管，肿瘤的营养源被切断，阻止了肿瘤的转移 对癌扩散的抻制率达到8 0 8 5 ，优于肝素的是没有任何副作用e l332 0 酰化和N 酰化壳聚糖 甲壳素和壳聚糖可以同酸酐、酰卤( 主要是酰氯) 等多种有机酸的衍生物发 生反应，不同分子量的芳香族或腊肪族酰基引入多糖链。壳聚糖发生N 一酰化反应， 产生N 一乙酰壳聚糖即甲壳素，是一种非常有用的反应。若用丙酸酐、丁酸酐、己 酸酐代替乙酸酐，则可得到相应的酰化产物1 。用二酸酐( 丁二酸酐、顺丁烯二 酸酐、邻苯二酸酐等) 作为酰化剂，得到壳聚糖的酰胺酸衍生物，它们的溶解性 增强，

9、溶剂范围更广泛，包括水、稀碱、稀酸和一些有机溶剂等，并且显示了良 好的吸湿性和保水性# 5 。2 6 I 。 13 4 低聚合度壳聚糖 大分子量的壳聚糖经过降解，可以得到分子量较低的壳聚糖产物即低聚合度 壳聚糖，这类产物较壳聚糖有更好的水溶性，并且更加利于机体吸收利用，具有 更广泛的应用价值，并已经成为了人们普遍关注和重点研究的领域。制各低聚合 度的壳聚糖、甲壳素的方法主要有酸水解法、氧化法和生物酶降解法。 】3 4 1 酸水解法 常见的酸水解法主要包括咀下几种；盐酸法、磷酸法、乙酸法和氢氟酸法。 酸性水溶液中的壳聚糖不能够稳定存在糖苷键断裂导致糖链发生水解，形成一 些分子量大小不等的糖链片断

10、，过度水解可以生成单糖。由于酸水解法水解程度 不易控制，在制各寡糖的时候，纯化困难，产物主要是单糖和顾糖混合物，很难 壳聚糖衔生物埘糖尿病太鼠m 稽的* 节作用”究 针对性得到所需的活性寡糖，产品质量较低，限制了酸水解方法的推广应用。 1342 氧化法 目前研究较多的氧化降解法主要为过氧化氢洼。覃彩芹等1 2 7 1 证明，以盐酸等 强酸为介质，卜r 浓度较高，结合到壳聚糖的糖链氨基上，形成R N H 3 + 的缺电子 体系，使H2 0 2 主要进攻B - ( 1 4 ) 糖苷键，由于氧化糖苷键断裂壳聚糖分子链降 解。此方法的工艺较简单，易于规模化生产，但是由于水解过程破坏了壳寡糖分 子结构，

11、可产生副产物，产品的品质较低。另外，氧化降解法还有次氯酸钠法和 过硼酸钠法等。 13 43 生物酶降解法 生物酶降解法为利用专一性或非专一性生物酶降解甲壳素或壳聚糖的一种 绿色环保的方法，近年来对此法的研究逐渐增多。由于整个降解过程耒加入其他 反应试剂反应条件温和几乎没有副反应，因此具有较广泛的应用研究价值。 常用的工具酶主要包括溶菌酶、脂肪酶等非专一性的水解酶以及壳聚糖酶和甲壳 素酶等专一性的水解酶目前已经可以规模化生产。 甲壳素酶( C h i t i n a s e ) 可以专一性水解线性结构的乙酰氨基葡糖苷键，得到 最终水解产物为二糖，分布广泛，在细菌和放线菌等微生物、植物组织及动物消

12、 化系统中均有发现，相比壳聚糖酶( C h i t i s a n a s e ) ，甲壳索酶的降解速度较慢。因 为当壳聚糖溶解于烯酸溶液时，更容易与壳聚糖酶发生水解反应，最终水解产物 也是二糖，可以进一步被氮基葡萄糖酶水解为氮基葡萄糖。 1 4 甲壳素、壳聚糖及其衍生物与糖尿病 近年来，国内外关于甲壳素和壳聚糖缓解糖尿病相关症状的研究逐渐增多。 据文献报道，在治疗糖尿病方面，甲壳素、壳聚糖及其衍生物主要发挥以下几个 方面的作用： 1 41 调节血糖的作用 众所周知，治疗糖尿病重点在于有效控制和降低血糖。有研究表明壳聚糖 可以明显降低四氧嘧啶诱导的糖尿病模型大鼠的血糖浓度，同时增高大鼠血清胰

13、岛素含量【“I ；郑铁生等1 2 9 1 研究表明，对于四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠，龙虾 壳聚糖可以明显降低其血糖水平并且改善糖耐量：壳聚糖安全无毒副作用，与口 壳聚糖口I 生物“糖雠璃 鼠m 糖的调节作用究 服化学降糖药十f 1 比较，具有较好的降糖效果”：K o n d o 等研究认为壳聚糖可以通 过提高胰岛柔受体的敏感性达到降m 糖效果】。以L 研究结槊表明壳聚糖具有调 节血糖的功效。 另有研究显示，接枝共聚了新的化学基团的多糖衍q ：物也可以降血糖，如肝 素和低分子量的壳聚糖等的硫酸酯化衍生物均具备降低血糖的活性3 2 - 3 3 1 ：李绪 亮、焦庆才I ”I 等研究证明硫酸酯化的

14、茯苓多糖具有防止肾功能衰竭的功效，可以 防治腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾衰竭。 l42 抗氧化作用 异常的自由基代谢对于糖尿病以及并发症产生异常严重的影响主要包括 册：( 1 ) 在体内，葡萄耱和蛋白质反应生成了A m a d o r i 产物，并最终产生A G E s 可结台其受体，在酶促反应下其受体结构与功能发生改变，产生大量自由基：( 2 ) 出现糖尿病及其并发症的原因之一是由于激活了多元醇的通路，如糖尿病性白内 障是由山梨醇激活导致的；( 3 ) 造成胰岛细胞损伤原因之一是：自由基代谢异常 导致转录因子N F 一。B 被A G E s 激活，进而生成大量N O ；( 4 ) N A D P

15、H 氧化酶的 活化是由于蛋白激酶C 活性的升高，进而引发自由基生成。 研究表明1 ，因为胰岛细胞中的S O D 和G S I I P x 等台量较少、活性较低很 容易受到自由基的损伤，所蚍当体内活性氧浓度的增高和胰岛素合成分泌的信号 通路受到影响时，胰岛B 细胞受到直接和间接损伤。此外，自由基通过激活多 种信号通路，导致胰岛素受体及底物发_ 二磷酸化反麻体内分泌的胰岛素量减少， 引发胰岛素抵抗。 143 调节血脂的作用 研究表明，由于壳聚糖带有正电荷，可以有效阻止胆固醇和甘油三酯的消化 吸收，并促进机体排出这些物质，有效减少了胆固醇和脂肪的体内积累，如将壳 聚糖加入高脂肪混合肥料的大鼠饲料中饲

16、喂2 周后，对照组的粪便中脂肪含量 明显低于实验组口8 州。饲喂雄鼠添加了2 5 壳聚糖的高脂肪混合饲料2 0 天， 雄鼠体内胆固醇含景降低了2 5 3 0 不仅没有影响雄鼠摄食和正常生长，而 且可以有效防止发生脂肪肝。当S T Z 诱导的1 l 型糖屎病模型大鼠的血液胆固醇 含量增高时，由于壳聚糖能够吸收胆汁酸并使胆固醇免遭胆固醇酶的催化，降低 了大鼠血液内的胆固醇浓度【“I ；杨铭锌等I “1 进行体外模拟消化过程的实验表明， m $ # W R m R m 镕* # 月R 胆汁酸：壳聚糖= 8 ：】时，壳聚糖可以较好地发挥络合胆汁酸、阻止机体吸收脂 肪的功能：带有J 。电荷的壳臻糖促进机

17、体吸收胆固醇和胆汁酸，排出来被吸收的 脂肪，同时吸附食物中带负电的脂肪，从而使血脂含量降低I “J ：王淑玲等1 4 ”也 证明了血清胆固醇和甘油三酯含量可以随着血糖降低而明显下降。另外有研究 认为壳聚糖结构中的氨基通过静电桥联作用吸附游离脂肪酸具有降脂作。 15 本论文研究目的 由于壳聚糖为一种天然生物大分子多糖，具有多种生物活性及良好的生物相 容性无毒副作用，近年来，有关于壳聚糖在降低血糖、抗肿瘤、降血脂、防感 染、增强免疫力等方面的作用研究不断增多。 本实验制备了三种壳聚糖衍生物，通过测定它们的相关理化性质，初步了解 三种壳聚糖衍生物的结构。在动物水平上以全雄W i s t a r 大鼠

18、为实验对象，通过 一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型，连续灌胃给药4 5 天，每1 5 天 测定一次空腹血糖和并于4 5 天时测定大鼠糖耐量变化，研究三种壳聚糖衍生物 对糖尿病模型大鼠血糖的调节作用：在细胞水平上，以K I N m 5 f 胰岛B 细胞系为 研究对象，检测三种糖对胰岛细胞体外增殖的作用，为壳聚糖衍生物调节糖尿病 大鼠血糖提供了理论依据。 壳聚糖衍生物w 糖屎确 鼠J m 轱的调* 作用q f 究 第二章壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠血糖的影响 壳聚糖是种具有生物活性的天然碱性多糖，性质稳定且安全可靠，对人体 无毒副作用，近年来有关壳聚糖对掂尿病治疗的研究逐渐增多。已有文献报道

19、， 低分子量壳聚糖4 5 4 7 1 、甲壳低聚糖“I 、壳寡糖1 4 9 1 均可以调节糖尿病大鼠的血糖水 平。本实验制备了三种壳聚糖衍生物，对其物理化学性质进行测定，以雄性W i s t a r 大鼠为实验动物，链脲佐菌素一次性腹腔注射造模，定量灌胃治疗，4 5 天后，研 究了三种壳聚耱衍生物对于糖尿病犬鼠空腹血糖、葡萄糖耐量及血脂的影响，并 通过石蜡组织切片、HE 染色观察了肝脏、肾脏和胰腺组织的病理学变化。 21 壳聚糖衍生物的理化性质的测定 2 1 1 材料、试剂和仪器 实验材料 3 种壳聚糖衍生物：磺酸化壳聚糖、低脱乙酰度壳聚糖、羧甲基甲壳素均为本实 验室制各并纯化。 实验试剂 冰

20、醋酸，N a O H ，盐酸，浓硝酸( 9 5 A R ) ，明胶等均为国产分析纯 实验仪器 电热恒温干燥箱( D H G 一9 0 5 3 一A 型号)上海精密实验设备有限公司 真空干燥箱( D Z F 6 0 5 0 型号)上海精密实验设备有限公司 超纯水器( 2 0 0 0 D 型号)北京长风仪器仪表公司 棱光可见分光光度计( 7 2 3 N 型号) 上海精密科学仪器有限公司 电子分析天平( A L l 0 4 型号) 梅特勒一托利多仪器有限公司 傅里叶变换红外光谱仪( F I I R 4 8 0 0 S 型号) 日本岛津研究所 离心机( R S 一2 0 1 1 1 型号)湘仪离心机仪

21、器有限公司 D H 计( P H S 一3 C 型号) 上海精密实验设各有限公司 磁力搅拌器( 9 5 2 型号) 上海安亭电子仪器厂 冷冻干燥机 美国 2 l2 实验方法和步骤 壳聚稚m 一# 物”锗屎捕太融m 藉作用研究 2 12 1 溶解性删定 将定量的样品溶于蒸馏水配成】浓度，观察其水溶解性。 2 122 水分测定 称量瓶干燥到恒重，精确称取】克样品均匀平铺在瓶底。将干燥至恒重的 称量瓶置于L O S 恒温干燥箱，瓶盖半开，干燥3 小时，干燥后的称量瓶和样 品置于干燥嚣冷却到恒温，称重后再于1 0 5 恒温干燥箱干燥O5h ，重复此种操 作直至前后两次的称重结果之间的差异小于0 0 0

22、 2g 即为恒重，计算样品前后的 失重，即为样品水分含量： W IW 2 水分( ) = W 1 一W o W o ：1 0 5 烘干至恒重的称量瓶的质量( g ) w 】：1 0 5 烘干前样品和称量瓶的质量( g ) W 2 ：1 0 5 烘干后样品和称量瓶的质量( g ) 2 12 3 灰分测定 洗净、烘干的坩埚置于5 5 0 2 0 的马福炉中，充分灼烧0 5h ，将坩埚 从马福炉中取出后室温冷却约l 一2m i n ，置于干燥器中冷却0 5h ，冷却完毕后 进行称重。重复以上灼烧、冷却、称量过程，一直到前后两次称重的差异小于 0 0 0 0 5g 为恒重。 在已经灼烧至恒重的空坩埚中

23、称取2 5g 已经干燥至恒重的样品置于5 8 0 的马福炉中，充分炽烧灰化4h r ，待灰化完毕马弗炉降温至1 0 0 ，将坩蜗小 心取出，空气中冷却约1 m i n ，称重。再次放入5 8 0 马福炉中灼烧1h r ，冷却， 称重。重复以上操作直至前后两次称重之差小于0 0 0 Ig 为恒重。按照下式计算 灰分： w z W o 灰分( ) = w I w o W o ：已经干燥至恒重的空坩埚的质量( g ) W I ：坩埚加干燥样品的质量( g ) 糖m 生物列糖R H I n 诘的婀t ”月“ R W 2 ：灰化后坩埚加灰分的质量( g ) 2l2 4 样品脱已酰度、鞍化度发硫酸根含量的

24、测定 ( 1 ) 磺酸化壳聚糖和低脱乙酰度壳聚糖的脱乙酰度测定 称取样I 拈0 Ig ( 精确至0 0 0 0 2g ) 置于1 0 0 m l 的三角烧瓶中加入I5 m l 0 l m o 儿的盐酸溶液于室温搅拌至样品完全溶解用O1m o l L 标准N a O Ha q 酸 碱滴定样品溶液，同时用数字酸度计测定并记录p H 随标准N a O H 溶液体积的变 化，采用一阶微商法找出两个突跃点。另外取一份相同的样品，于1 0 5 恒温 干燥箱中烘干至恒重，并测定水分含量。 按照下式计算脱乙酰度： ( V 2 一V I ) X Cx00 1 6 f 1 一D 1x00 9 9 4 v l ：第

25、一突跃点消耗的标准N a O H 滴定液的体积，m h v 2 ：第二突跃点消耗的标准N a O H 滴定液的体积，m h c ：标准N a O H 标准滴定液的浓度，m o l L ： ：样品的质量，r a g ； D ：样品的水分含量： O0 1 6 ：与l m ll m o l L 盐酸标准溶液相当的氨基量，卧 00 9 9 4 ：理论氨基含量： ( 2 ) 羧甲基甲壳素羧基取代度及脱乙酰度测定 称取质量为0 1g 的羧甲基甲壳素( 精确至0 0 0 0 2g ) 加入1 5 m l03 m o l L 盐酸溶液，室温搅拌使之充分溶解，搅拌的同时用0Im o Y L 的标准N a O H

26、 溶液 滴定溶液用数字酸度计记录混合溶液的P H 值变化，直到p H 1 1 ，停止滴定， 并记录标准N a O H 滴定液体积与p H 值之间的对应关系，运用一阶微商法寻找三 个突跃点。另称取一份相同的样品，于1 0 5 恒温干燥箱烘干至恒重，测定样 品的干燥失重。 取代度计算公式： 壳粜枯m 生物目糖尿嗡 鼠m 错的调H 作用研究 DSf ) = 2 0 3 A V I ( Wx f lD 18 0xA V l C + 4 2x A V 2 xC 2 0 3 ：乙酰氨基葡萄糖残基的相对分子质量； A V I ：第一和第二突跃点之间消耗的标准N a O H 滴定液的体积之差，m A V 2

27、：第二和第三突跃点之间消耗的标准N a O H 滴定液的体积之差，m C ：标准N a O H 滴定液的浓度，m o l L ； w ：样品的质量，m g ； D ：样品的干燥失重，： 8 0 ：羧甲基钠的相对分子量； 4 0 ：乙酰基的相对分子量： 脱乙酰度的测定： D D ( ) = ( 8 0 DS + 1 6 j ) x 一V 2xC WX ( I D ) A V 2 ：第二和第三突跃点之间消耗的标准N a O H 滴定液的体积之差，m h c ：标准N a O H 滴定液的浓度，m o l L ； w ：样品的质量，m 昏 D ：样品的干燥失重，： 8 0 ：羧甲基钠的相对分子量；

28、1 6 1 ：氨基葡萄糖残基的相对分子量： ( 3 ) 磺酸化壳聚糖的硫酸根( S 0 4 2 - ) 含量测定( 明胶比浊法【s 1 - 5 4 1 ) 溶液配制： 明胶溶液：0 2 5g 明胶于6 0 一7 0 溶解于5 0 m l 水中，4 过夜保存； B a C 2 明胶溶液：0 2 5g B a C l 2 溶解于5 0 m L 明胶溶液中，4 保存，静置 过夜： 4 0 0p g m l 硫酸盐标准液：精确称取1 0 5 干燥4h 的硫酸钾，定容至所需 浓度： 稀盐酸：盐酸I m L 加水稀释至3 0 m l 壳R 糖葑J 生物列饴R 病人鼠m 糖的调作用研究 标准曲线的制作： 分

29、别取枷、濉硫酸钾溶液0 0 ，0 2 0 4 0 , 6 ，08 ，10 mJ ，加水至25 mJ ，依 次加入稀盐酸05 m l ，B a C l 2 叫胶溶液2 0 m l ，混匀，2 5 放置2 0 r a i n ，以水为 参比在5 3 2n m 处测定吸光度做标准凹归曲线，纵坐标为吸光度值，横坐标 为硫酸根含量。 样品测定： 确称取样品2 0m 口，加入5m l 浓盐酸和I5m l 浓硝酸，于电炉上用凯氏定 氨湿化法消化约1h ，至溶液微黄。将消化被定容至5 0 m l ，取25 m l 消化液测定， 其他操作同上，测定其吸光度值，按照标准曲线计算样品中的S 0 4 2 - 含量，并

30、计 算样品磺酸化度。 2 】2 ，5 磺酸化壳聚糖的娄肝素性质段抗凝血性质的检测 对所配制的磺酸化壳聚糖溶液进行甲苯胺蓝变色实验，用于测定其是否具备 类肝素结构。 全凝血时间的测定：实验分为3 组，空白对照组( 生理盐水) 、肝素钠对 照组和S C T S 组。用采血针( 两头针孔) 取兔耳动脉血2m 1 避免气泡、组织液 以及溶血的产生，沿管壁注入已加入了2 0 0u l 待检测抗凝剂的采血试管中，轻轻 倒立试管使血液与试剂混匀，将试管浸入3 7 水浴锅中恒温水浴。计时开始时 刻为血液刚刚进入试管时，当血液离体3 分钟后，每隔1 0s 轻斜试管混合血液一 次，动作幅度要轻，角度约等于3 0

31、度，尽量避免血液与试管壁大规模接触。血 液凝固时间为试管内的血液不再流动，记录该时间段为全凝血时间。 肝素钠溶液：1 2 5U 肝素钠溶解于2m 】蒸馏水； S C T S 溶液：1 25 m gS C T S 溶于2 0 m l 生理盐水。 2126 壳聚糖衍生物红外光谱分析 3 种壳聚糖衍生物经K B r 压片，F T 1 R 红外光谱仪在4 0 0 0 4 0 0c m + 1 范围内 扫描测定。 2 13 蛮验结果 2 13 1 理化性质结集 经过实验测定，低脱乙酰度壳聚糖( C T S ) 、羧甲基甲壳素( C M C ) 和磺酸 化壳聚糖( S C T S ) 三种样品的水溶性、水

32、分含量、灰分含量、脱乙酰度、羧化 A # m 目# g 自 H m 糖日m n “ 度以及磺酸化度等物理化学性质如表所示 表2 一I 各样品表征及理化性质结果 T a b2 - 1C h a r a c t e r sa n dp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r l yo fs a m p l e s 213 2 S C T S 类肝索性质和抗凝血性质测定结果 磺酸化壳聚糖溶液中加入甲苯胺蓝溶液出现了蓝紫色沉淀，说明它具各了类 肝素结构。 表2 - 2 凝血实验结果 T a b2 2R e s u l t so f l h eo n h o g o

33、 n a le x p e r i m e n t 213 3 壳聚糖衍生物的红外光谱分析 3 种壳聚糖衍生物的红外光谱如图所示 A ：C M CB ：C T SC ：S C T S 图2 1 壳聚糖衍生物的红外光谱圈 F i g2 l T h eF W I Ra n a l y s i ss p e c t r u mo f c h i t o s a nd e r i v e n i v e s 由图中可以看出，C M C 在3 4 4 3c m 1 6 4 9c m l ，】4 1 7e m l ，1 0 6 9c l n l 具有 特征性吸收峰：C T S 在3 4 4 0c m 一，

34、1 6 5 0c n l 。，1 5 5 7c m l ，1 0 7 1c f f l “具有特征性 ilE一 R 糖衍m 镕 M m * W * n 用“ 究 吸收峰：S C T S 在3 5 2 4c m ，1 6 3 2c m 。1 2 3 0c m l ，8 0 2c n l 1 具有特征性吸收峰 表2 3 壳聚糖衍生物的红外光谱分析结果 T a b2 3I Rr e s u l t sf o rc h i t o s a nd e f i v e r t i v e s 波戥( c m 。、功能团波数( c m 。)功能团波数( c m )功能闭 3 4 4 0 - N HO H ，

35、N H C O C H 、C = O1 6 5 0NJ I C O C H 3 ，C = ON H C o C I - 1 tC - O 15 5 7 - O S O t ，SO 1 0 7 IC 一一o H 2 2 壳聚糖衍生物对糖尿病大鼠的影响 22 1 材料、试剂和仪器 ( 1 ) 实验材料： 低脱乙酰度壳聚糖( 实验室制各，D D = 4 85 3 ) 羧甲基甲壳素( 实验室制备，D D = 1 02 3 ，羧化度= 9 86 5 ) 磺酸化壳聚糖( 实验室制各，D D = 3 75 3 磺酸化度= 8 83 ) ( 2 ) 实验动物 封闭群纯系全雄W i s t a r 大鼠6 0

36、只，购自山东鲁抗医药股份有限公司( 清洁 级t2 0 0 2 0 9 ) ，大鼠饲养环境：保证充足的饮食饮水，定期更换洁净塑料鼠笼， 室温18 2 2 光照周期为明亮、黑暗各1 2h ，室内通风良好，氨浓度小于2 0 p p m ，相对湿度为4 0 7 0 适应性饲养一周以适应环境。 ( 3 ) 实验试剂 盐酸= 甲双胍( M e f f o r m i n ) ：深圳海王药业有限公司 链厥佐菌素( S t r e p t o z o t o e c i n S T Z ) ：美国S i g m a 公司 葡萄糖：上海第四试剂厂生产，A R 级 血糖测定试剂盒、甘油三酯试剂盒、总胆固醇试剂盒、

37、高密度脂蛋白胆固醇 试剂盒：购自南京建成生物二r _ 程研究所 ( 4 ) 实验仪器 自动酶标仪( R T - 2 1 0 0 型号) 美国R a y t o 霄杜公司 电热恒温干燥箱( D H G 一9 0 5 3 一A 型号)上海精密实验设备有限公司 R 镕m # 糖犀病人斟m 糖H 作用“ 究 台式冷冻离心机( M I R O2 2 R 型号) 轮转式组织切片及( R M 2 0 15 型号) 生物组织包埋机( K D B M 型号) 公司 222 实验方法 22 2l 糖尿病大鼠建模 德国H e t t i c hM I I G R O 公司 E 海徕卡仪器有限公司 浙江省金华科迪仪器

38、设备有限 ( 1 ) 01m o l L 柠檬酸缓冲液的配制 A 液：柠檬酸( F W ：2 1 0 1 4 ) 2 lg 溶于1 0 0 m l 三蒸水； B 液：柠檬酸钠( F W ：2 9 4 1 0 ) 29 4E 溶于1 0 0 m l 三蒸水： 用时各取A 、B 液5 0 m l 混合，调节p H = 42 45 ，剩余A 、B 液4 冰箱存放。 ( 2 ) 链腮佐菌素溶液( S T Z ) 的配制 快速分装S T Z 粉末lg 于小管( 干燥、避光) ，溶于经高压灭菌( 1 2 0 ， 2 0 r a i n ) p H = 42 的柠檬酸缓冲液中，浓度为1 ，冰浴低温保存。 (

39、 3 ) 大鼠糖尿病建模 大鼠建模前1 2 小时禁食不禁水，一次性腹腔注射6 0m g k gp H = 42 的无菌 1 S T Z 柠檬酸钠缓冲液，正常组大鼠按各自体重注射相同剂量0 1 m o l L 的柠檬 酸钠缓冲液。三天后，实验大鼠采血前5 小时禁食不禁水1 5 “，通过尾静脉采血测 定空腹血糖值( F a s t i n gp l a s m ag l u c o s e ，F P G ) ，半定量法测定尿糖，以F P G 1 67 m m o l L 、尿糖= 卅，并且出现糖尿病典型临床症状“三高一少”的大鼠为造模 成功。 2222 大鼠分组及实验方法 造模成功的大鼠被随机分为

40、6 组，每组9 只，分别为正常对照组( N o r m a l ) ， 阴性对照组( D M ) ，二甲双胍组( M e t ) ，低脱乙酰度壳聚糖组( C T S ) ，羧甲基 甲壳紊组( C M C ) 磺酸化壳聚糖组( S C T S ) 。 各组大鼠的受试方法及灌胃剂量如下表所示： 表2 - 4 大鼠分组段灌胃剂量 T a b2 - 4G r o u pa n dd o s eo fr a t s 壳糖衔# W 日# * m # H ”月R 2223 指标观察 ( 1 ) 大鼠生活状态观察： 每日观察大鼠的生活状态是否正常每日定时更换垫料保证清洁干净环境， 并且定时称重，根据体重变化调

41、节灌胃用量。 ( 2 ) 三种样品对造模大鼠空腹血糖( F a s t i n gp l a s m ag l u c o s e ，F P G ) 的调节 每隔1 5d ，所有大鼠禁食不禁水5h ，尾静脉采血，3 0 0 0r r a i n 离心1 0 r a i n ， 分离血清，葡萄糖氧化酶试剂盒法测空腹血糖值( F P G ) ，记录太鼠血糖变化。4 5 天时计算实验前后大鼠空腹血糖上升百分率。 血糖上升百分率= ( 灌胃4 5d 血糖值一灌胃前血糖值) 灌胃前血糖值x1 0 0 ( 3 ) 三种样品对模型大鼠屎糖的影响 每隔1 5d ，半定量试纸法测大鼠尿糖。 ( 4 ) 三种样品

42、对模型大鼠糖耐量的影响m 1 连续灌胃4 5d 后，全部大鼠进行口服萄萄糖耐量实验( o r a lg l u c o s e t o l e r a n c e ， O G T T ) ：禁食5 l 】r 次1 3 早晨灌胃给药1 5 2 0 m i n 后，按体重2 0g k g 灌胃葡萄 糖水溶液，分别于给糖后0h r ，05h r ，2 】1 r 尾静脉取血，葡萄糖氧化酶法测定血 糖值Oh P G 0 5 h P O ，2 h P G ，记录血糖值随时间变化，并做曲线，计算各时间点 血糖曲线下面积( a r e au n d e r t h ec 1 1 r u e ，A U C )

43、。以糖尿病模型对照组糖耐量曲线下 面积为1 0 0 ，分别计算各实验组糖耐量曲线下面积百分率。 曲线下面积( A U C ) 用几何面积相加法计算： A U C = 1 2x ( 0 h P G + 05 h P G ) x05 + 1 2x ( 2 h P G + 05h P G ) x l5 壳幂糖衔生物”话屎自J 、鼠t 扪糟的日作用研究 z02 5x ( 0 h P G + 4o05 h P G + 3o2 h P G ) ( 5 ) 三种样品对模型大鼠血脂的影响 连续灌胃4 5d 后，禁食不禁水5h ，尾静脉取血，离心取血清( 3 0 0 0r r a i n ，1 0 m i n

44、) ，测定血清中甘油三酯( T G ) 、高密度脂蛋白胆固醇( H D L ) 和总胆固醇( T C ) 的含量。 ( 6 ) 三种样品对模型大鼠器官系数的影响 连续灌胃4 5d ，取血后，将各组大鼠处死解剖取肝、脾、肾和胰腺4 种器 官，立即称重，并计算器官质量与体重之比器官质量( g ) 体重( k g ) ，即器 官系数。 ( 7 ) 大鼠脏器的病理组织切片学观察”I 连续灌胃4 5d ，取血后，处死各组大鼠，解剖，立即取胰腺、肝脏、肾脏， 生理盐水冲洗表面血液，在冰盘上将组织切成台适大小组织块，做石蜡组织切片， 并于光学显微镜下观察其病理学组织结构变化。 胰腺组织切片 A 、固定：用锋

45、利的刀片于近胰尾处取合适大小组织块避免挤压组织，尽量保 留组织原形状立即投入新鲜配制的B o u i n 溶液中固定2 4h ，换入7 5 乙醇溶解 洗去苦味酸的颜色。 B 、脱水：为避免脱水过程中组织过度收缩需用浓度逐级升高的拂度乙醇一次 脱水。3 0 _ 5 0 _ 6 0 _ 7 0 _ 8 0 _ 9 0 _ 9 5 1 、1 1 _ 无水乙酵、 l l ，各6 0 m i n 。 C 、透明：组织在二甲苯申的时间不能过长，否则将导致组织过度收缩使组织碎 裂。二甲苯无水乙醇混合渡( 1 ：1 ) 2 0 m i n _ 二甲苯J 、I l ，各1 0r a i n 。 D 、浸蜡：一般

46、组织浸蜡时间l 、J J 各6 09 0 m i n ，须经2 3 次浸蜡才能完成。 二甲苯石蜡混合液( 1 ：1 ) 1h _ 石蜡l 、I I ，各l5h 。 E 、包埋：先将溶化的石蜡倒入包埋盒内，用加温的镊子将浸蜡彻底的组织块放 入，包埋石蜡温度不可高于6 2 ，用石蜡包埋成规整的长方形块状物，蜡块大 小以满足切片需要、便于切片机固定和切片为宜。 F 、切片：组织块经固定、脱水、浸蜡、包埋后制成蜡块，稳固置于切片机上即 可开始切片，厚度为5 7 “m 。 R 槽# I 生物对糖R 璃 鼠m 糖的日# * 月究 G 、展片：摧片温度控制在4 3 以内，烤片温度为3 7 ，过夜。 H 、苏

47、术精、伊红染色( H E 染色) 脱蜡：石蜡组织切片置于二甲苯I 、l I 各15m i n ，待载玻片J 瑚石蜡脱去将其浸 入二甲苯：酒精= 】：1 的混合溶液中5 m i n ： 复水：石蜡组织切片分别浸入无水乙醇】、I I _ 9 5 1 、I l _ ，9 0 _ ，8 0 一7 0 _ 6 0 _ 5 0 7 。醇，各级酒精中停留Im i n ，浸入蒸馏水约2 r a i n ： 核染：石蜡组织切片浸入H a r r i s 苏木精染色l5 m i n ，自来水冲洗多余的染液； 分化：将切片浸入1 盐酸酒精分化约3 0s ： 蓝化：切片于自来水中洗涤蓝化1 0 m i n ； 脱水：

48、切片逐级酒精脱水，依次浸入5 0 _ 7 0 一8 0 _ 9 0 乙醇各2m i r a 质染：切片浸入1 伊红酒精溶液染色1 0m i n 。 继续脱水：质染完毕后将切片依次浸入9 5 J 、1 1 乙醇叶无水乙醇I 、1 1 逐级 脱水，各级酒精中停留3r a i n ： 透明：脱水后的切片依次浸入二甲苯：乙醇= I ：l 混合液3 m i n ，二甲苯1 、I I5 m i n 。 封片：石蜡组织切片透明结束后从二甲苯巾移出，含有组织的一面朝上，将适 量的中性树胶滴加迅速滴加在切片中央，盖玻片轻轻封片，避免气泡产生。 将封片的组织切片置于4 0 烘箱中烘干后干燥保存。 肝脏组织切片 取各组大鼠同一肝叶的相同部位，修块1 0 9 性甲醛固定液固定2 4h ，脱 水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色步骤同上述，由于肝脏组织较为致密，透明、 浸蜡及染色的时间较胰腺组织略有调整。 肾脏组织切片 取各组大鼠左肾的四分之一，l O 中性甲醛固定液固定2 4h ，脱水、透明、 浸蜡、包埋、切片、染色步骤同上述。相比胰腺组织和肝脏组织，肾脏组织较易 染色，染色时间略有调整。 ( 8 ) 数据统计分析 全部数据采用S P S S I 】0 软件进行统计学处理，P a i r e d - S a