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1、性类固醇激素及温度对胡子鲇性分化的影响 摘要 胡子鲇是我国南方大面积养殖的淡水经济鱼类，其适应性强，营养价值高，肉质细嫩具有 重要的经济价值。但胡子鲇达到上市规格时，雌性胡子鲇正处于性腺发育阶段，腹部膨大，其 生殖腺占体重的比例远高于雄性，导致雌鱼价格低于同等规格的雄鱼。因此，单雄或高比例雄 性胡子鲇的养殖可以有效地加快群体生长速度，提高产量及经济效益。本实验采用组织学方法 对胡子鲇性腺分化进行研究，旨在掌握其性腺分化规律，为诱导性分化研究提供依据；用1 7 a 甲基睾酮( 1 7 a - M T ) 、1 7 p - 雌二醇( 1 7 B - E 2 ) 和温度( 2 4 “ C 、2 8
2、、3 2 “ C ) 处理2 日龄胡子鲇 一个月，观察其对生长、成活率、雄性率、性腺分化和F o x l 2 表达的影响，为胡子鲇的单性育 种提供一条新途径。其结果如下： l 胡子鲇性腺分化的研究 早期性腺分化的形态特征明显不同，从性腺分化开始，未来发育为卵巢的性腺横切面变宽， 呈梨状，体积快速增大；而未来发育为精巢的性腺前端尖，中间稍突，后端里细长的柄状，增 生不明显。此外，胡子鲇卵巢分化时间明显早于精巢。水温( 2 6 a - 1 ) 时，卵巢分化最早开始 于出膜后1 6 日龄，其标志为卵巢腔的出现。出膜后1 8 日龄，卵原细胞开始通过有丝分裂快速 增殖，出膜后2 2 日龄，进入成熟分裂阶
3、段。精巢分化最早开始于出膜后3 0 日龄，标志为精小 叶和输精管的形成。出膜后3 0 目龄，精原细胞开始大量增殖，成熟分裂最早发生于出膜后4 0 日龄。 21 7 a M T 对胡子鲇幼鱼生长发育及性分化的影响 1 7 a M T 低( 5 0 1 t g L ) 、中浓度( 1 0 0 p 扎) 浸浴处理2 日龄胡子鲇幼鱼3 0 d ，对其成活率 及生长无影响，高浓度2 0 0 v e L ) 1 7 a - M T 抑制其生长发育( 尸 O0 5 ) ，而1 7 a M T 中、高浓 度诱导产生雄性率分别为7 0 * 0 和7 6 ，显著高于对照组( P 己烯雌酚( D i e t h y
4、 l s t i l b e s t r 0 1 ) ) 雌二醇( 1 7 脚s t x a d i 0 1 ) 雌酮( O e s t r o n e ) 雌三醇( O e s t r i 0 1 ) ：常用雄激素的强度顺序如下：米勃酮( m i b o l e r o n e ) 1 9 - 乙炔基睾丸酮 ( 1 9 - n o r _ e l h y n y l t e s t o s t e m n e ) 1 7 a - 甲基睾丸酮( 1 7 a - m e t h yt e s t D s t e r o n e ) 睾丸激素 ( r e ：s t o s t e r o n e
5、) 。在人工合成的雌、雄激素中，分别以1 7 1 3 - 雌二醇( 1 7 肛E 2 ) 和1 7 小甲基睾酮 ( 1 7 a M T ) 应用最为广泛，且效果最好【叫。 丝耋里壁堡耋些兰鐾翌塑王墅丝坌些竺兰翌 目前存在多种激素处理方法，主要包括急性和慢性两大类，其中急性激素处理方法中注射 法 6 7 1 和浸浴法【6 8 j 较常见，慢性处理方法中投喂法m 1 和埋植法1 7 0 1 应用范围较广。投喂药饵法只 需在饵料中添加一定量的激素，适合于已经开口摄食的鱼类I ”I ：浸泡法适用于冷水性鱼类， 将激素溶于水体中持续性或阶段性浸泡胚胎或开口摄食前的鱼类，有时可获得1 0 0 的单性 鱼1
6、 7 2 n 4 1o 慢性处理方法一般应用于性逆转的式样中。在研究鱼类性别分化的实验中，考虑到 操作的简便性，般会采用投喂药饵法。1 7 a M T 和1 7 1 3 E 2 口服的处理时间一般需连续投喂数 月，有效诱导剂量大约为5 - - 5 0 0a g g 饲料，浸泡法的有效剂量约5 0 1 0 0 0 峙几，需一次或多 次浸泡“”。但值得注意的是，处理方法、鱼的种类以及使用的激素的不同会直接影响诱导药 物的剂量范围，而且，激素的有效剂量也与激素处理时性腺的发育状况有关 7 6 - 7 8 】。 一般来说，在鱼类性腺分化的敏感期，用一定浓度雌激素诱导，可以得到全雌性或高比例 雌性鱼：用
7、一定浓度雄激素诱导，可以得到全雄或高比例雄性鱼。如P a r k 等用4 0 1 x g g 的1 7 B 雌二醇处理出膜后3 2 0 d 的黄颡鱼( P e l t e o b a g r u s 向l v i d r a c o ) ，获得全雌黄颡鱼1 7 “。姚道霞 用2 0 p p m 的雌二醇处理出膜1 0 d 后的黄颗鱼，雌性率达到8 36 t G I 。然而，大量实验证明， 外源激素处理对性别分化的影响，除了正常的性分化外，还可能使性腺出现畸形，如卵巢与精 巢组织共存( 兼性鱼) 、精巢中出现卵巢腔、性腺导管发育不全或消失、性腺萎缩和生殖细胞 数目减少或退化( 不育鱼) 、性腺发
8、育抑制等I ”】。虹鳟( O n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 经外源性雄激 素诱导雄性化后精巢畸形，没有输精管，但解剖后却发现有正常精子啪I ：牙鲆( P a r a l i c h t h y s o l i v a c e u s ) 经外源性雌激素诱导雌性化后导致不育【州。A n d e r s e n 等坤报道了斑马鱼( D a H i o ，I e r o ) 暴露到2 6 0 - - 1 0 0 0 n g L 甲基睾酮中。出现了显著的雄性化，同时出现一定比例的兼性鱼。 然而迄今为止，外源性激素影响鱼类性别决定和性分化的机制还不清楚，但推测外源
9、激素， 可能促使或抑制性别相关基因的转录与表达。雌二醇( E 2 ) 处理可以上调南方鲇脑中C y p l g b 表达水平，也可以上调性腺中C y p l g a 表达水平1 2 ”。可导致脑中C y p l 9 表达增加。B a r o n 等f 。3 I 对虹鳟的研究表明，雄激素首先抑制而x 眩、C y p l 9 a l a 等卵巢分化相关基因，随后抑制早期卵 子发生相关的重要基因，诱导其雄性化。K o b a y a s h i 等1 8 5 1 报道，用一定浓度的E 2 ，适时诱导雄 性罗非鱼胚胎或幼体，抑制D m r t lr n R N A 的表达，促进了C y p l 9m
10、R N A 和F o x l 2m R N A 的表 达，得到了高比例的雌性罗非鱼。相反，W a n g 等1 5 3 1 报道用芳香化酶抑制剂( F a d r a z o l e ) 和雌 激素受体拮抗剂( T a m o x i n f e n ) 适时处理罗非鱼胚胎或幼体，可上调D m r t l 、下调F o x l 2 和C y p l g a 的表达，得到高比例雄性罗非鱼。分化型鱼类经激素处理后表型性别可能会发生永久性改变， 因为在性腺发育早期，性g 基因的作用是短暂的，一旦完成了性腺的性别分化，它们就隐匿或 失活阻J ，但在雌雄同体或未分化的物种中由于性别基因一直到性腺发育的后
11、期还可以激活 因此较为复杂。 132 温度对鱼类性别的影响 自1 9 8 1 年C o n o v e r 和K y n a r d 首例报道了月银汉鱼( M e i n d i a m e i n d i a ) 的性别受温度和基 奎堡童查芏兰旦型兰查型鎏圭兰竺鎏兰 因双重调节l 蜘，在不同温度下获得了不同的性地。同对指出鱼类的性别除基因型性别缺定 ( G S D ) 机制以外，还存在着温度( T S D ) 或环境性别决定( E S D ) 机制。迄今，至少在8 科 有颌鱼类和一种无颌鱼类观察到温度对性别的影响【删，证明了温度依赖性性别决定( T S D ) 在 鱼类中广泛存在，而且在一些
12、极端温度下，温度甚至能凌驾于基因型之上而导致性别转变。 现有的研究数据表明，温度对鱼类性别的影响可归纳为三种不同的反应模式# n ：在定 的温度范围内，( 1 ) 温度增加提高雄鱼比例：( 2 ) 温度增加提高雌鱼比例；( 3 ) 中间温度产生 平衡性比，低温或高温均提高雄鱼比例。在爬行类，一般中间温度利于雄性的产生，而低温或 高温有利于雌鱼的产生，但是，对于不同的鱼类或个体，温度处理可能得到不同的结果，但大 多数情况下，在一定范围内增加温度( 2 3 2 9 “ C ) 可提高雄性鱼苗的比例1 6 + S 7 4 8 】。温度调节爬 行类性别分化，可能是通过对雌二醇生物合成、芳香化酶活性以及
13、类固醇受体的影响来调节， 而鱼类同样可能是通过上述方式影响性别比例。将鲤鱼( C y p r i n u sc a r p i o ) 孵化温只改变5 温度，但是其雌二醇的分泌量却发生2 0 倍以上的变化御】。同样孵化温度的提高使日本褐牙鲆 和尼罗罗非鱼出现雄性化，这种效应与抑制P 4 5 0 a r o mm R N A 表达而较低的雌二醇水平密切相 关1 9 0 I ，而抑制芳香化酶活性可以降低遗传性为雄性( 基因型为Y Y ) 的尼罗罗非鱼在高温下 产生的雌性化效果t 9 2 。莫桑比克罗非鱼( 7 j l a p i a M o s s a m b i c a ) 、舌齿鲈( D i
14、c e n t r a r c h u s 缸 r 酊) 、 斑点叉尾鲴( 1 c t a l u r u s p u n c t a t u s ) 等，随着孵纯温度升高，雌性比例上升，而反之雄性比例 上升。然而，半滑舌鳎( C y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s G a n t h e r ) 、泥鳅( M i s g u r n u s a n g “i l l i c a u d a t u s ) 及大鳞昌泥鳅( P a r a m f s g u r n u s 幽6 ，) 删淞) 在性腺发育期间，随着孵化温度升高雄性个体所占 比例升高 9
15、 3 - 9 9 1 。温度对性比的影响，一般限定在胚胎、仔稚鱼期的几天或几周之内，大致与形 态学上的性腺分化期和激素诱导有效期相同，但温度依赖性性别决定( T S D ) 的不稳定期也可 能短于性腺组织学上的分化期1 9 ”。 1 4 本实验的研究目的及意义 胡子鲶( C l a r i a s f u s c u s ) 又称塘虱鱼，属鲶形目( S i l u r i f o r m e s ) 、胡子鲶科( C I a f t i d a e ) 、 胡子鲶属，是我国南方大面积养殖的淡水经济鱼类。其适应性强，营养价值高，肉质细嫩，具 有重要的经济价值。目前，胡子鲶已在广东、广西、福建形成
16、规模化养殖，市场潜力巨大，是 养殖户致富的有效养殖对象。胡子鲶性腺发育属非同步多次产卵类型，繁殖能力强，性成熟年 龄为1 0 - 1 2 B 龄，一年可繁殖3 _ 4 次。当养殖胡子鲶达到上市规格时，雌性胡子鲶正处于性腺发 育阶段，腹部膨大，其生殖腺占体重的比例远高于雄性，导致雌鱼比同等规格的雄鱼价格低2 3 刃公斤。此外，在同等养殖条件下。雌雄胡子鲶生长速度存在显著差异，雄鱼生长速度远远 高于雌鱼。而我国台湾地区，养殖户为提高经济效益，在养殖过程中常进行雌雄鱼分养，导致 养殖成本、人力资源等方面的浪费。在国内外，对胡子鲶鱼的研究仅局限于胡子鲶的养殖技术， 体色的改变，对胡子鲇性腺分化的相关研
17、究未见报道。 本研究以胡子鲶为研究对象，通过石蜡切片技术，在组织学方面对胡子鲶鱼的性腺分化进 7 竺耋垦墼堡耋竺堡星翌型二墅垡坌些塑墅堕 行观察- 确定性腺分化时间。在性腺分化前，用1 7 c t - M T 浸浴法、1 7 B E 2 投喂法、不同温度对 胡子鲶幼鱼进行处理，持续一个月。观察其对胡子鲇生长、成活率、雄性率、性腺分化、F o x l 2 表达的影响。为胡子鲶全雄或高比例雄性化育苗研究提供依据，从而节约养殖成本、提高商品 鱼质量和价格。促进广东省重要优势品种的开友和应用，提高我国在鱼类性别检测和性别控制 方面的的科研水平，推动我国鱼类单性育种技术的研究进程。 2J3 实验仪器厦工
18、具 毛笔，恒温水浴锅，保温箱，修蜡刀片，干燥箱，镊子，解剖刀术块，磨刀石，托盘，酒 精灯，染色缸，打火机，滤纸，载玻片，盖玻片，冰箱。 G Z X - 9 0 7 0 M B E 数显鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂 R M 2 2 4 5 切片机德国徕卡( 1 e i k a ) 公司 数显恒温水浴锅常州市华普达教学仪器有限公司 2 14 所用试剂及配制 2 14 I 所用试剂 脱水剂( 9 5 2 L 醇) ，固定剂( B o u i n 氏液) ，染色剂( 苏木精、伊红) ，封固剂( 中性树脂) ， 包埋剂( 石蜡) ，透明剂( 二甲苯) 。 2 1 42 溶液配制 埃利希苏术素
19、的配制： 将苏木精( 2 9 ) 溶解于9 5 乙醇( 3 0 m 1 ) 中，再加入冰醋酸( 1 0 m L ) 后搅拌。当苏木精溶 解后将9 5 乙醇( 9 0 m L ) 和甘油( 1 0 0 m L ) 倒入并摇动容器。 将硫酸铝钾( 钾矾) 在研钵中研碎并加热、然后溶解于水中，直至瓶底出现钾矾结晶为止， 然后逐滴加入上述染液中。 将混合液放在暗处通风处，并经常摇动以促使氧化成熟，时间约为7 周，加入02 9 碘酸钠 可促进其成熟。 B o u i n 氏液配制： 性类固醇激素及温度对胡子鲇性分化的影响 将7 5m L 2 5m L 福尔马林( 3 7 0 0 , , - 4 0 0
20、0 的甲醛水溶液) 、苦味酸饱和水溶液( o9 0 P 12 ) 及 5 m L 冰醋酸混匀。固定液与样品的体积比应不小于1 0 ：1 。 其它溶液配制： 1 伊红染液：伊红1 矿9 5 乙醇9 9 m L l 酸性酒精：浓盐酸l m L + 7 0 乙醇9 9 m L 1 碱性酒精：氨水l m L + 7 0 乙醇9 9 m L 2 15 材料的收集与实验步骤 2 15 1 材科收集 从出膜后2 日龄开始，2 2 0 日龄每日随机取8 尾，2 1 5 0 日龄每日随机取6 尾。全鱼 B o u i n 氏液固定。 215 2 石蜡切片步骤： 组织_ 7 0 乙醇A ( 1 2 h ) _ 7
21、 0 乙醇B ( 3 0 m i n ) _ 8 0 乙醇( 3 0 m i n ) 呻9 0 乙醇( 2 5 m i n ) _ 9 5 乙醇A ( 2 0 m i n ) _ 9 5 乙醇B ( 2 0 r a i n ) 一无水乙醇A ( 2 0 m i n ) _ 无水乙醇B ( 2 0 r a i n ) 呻1 2 酒精二甲苯( 4 0 m i n ) _ l ，3 酒精二甲苯( 4 0 r a i n ) _ 二甲苯A ( 2 0 m i n ) _ 二甲苯B ( 2 0 m i n ) 呻1 2 石蜡二甲苯( 4 0 r a i n ) _ 1 3 石蜡二甲苯( 4 0 r a
22、i n ) _ + 5 8 石蜡A ( 2 h ) _ 5 8 石蜡B ( 2 h ) 呻包埋叶切片( 06 O8 m ) _ 贴片_ 展片一烘片( 3 7 、6 0 r a i n ) 一二甲苯A ( 4 0 r a i n ) _ 二 甲苯B ( 3 0 r a i n ) _ 1 2 酒精二甲苯( 1 0 m i n ) _ 无水乙醇A ( 5 r a i n ) 一无水乙醇B ( 5 m i n ) _ 9 5 乙醇( 5 r a i n ) _ 8 5 乙醇( 5 m i n ) 一呻7 0 乙醇( 5 m i n ) 一苏木精染色( 3 0 m i n ) _ 蒸馏水( 2 次)
23、叶酸酒精( Is e c ) _ 蒸馏水_ + 碱酒精( 3 0 s e c ) _ 蒸馏水一7 0 乙醇( 5 m i n ) _ 8 5 乙醇( 5 m i n ) _ 伊红染液( 2 r a i n ) _ 蒸馏水_ 9 5 乙醇( 5 r a i n ) 一无水乙醇A ( 5 r a i n ) _ 无水乙醇B ( S t a i n ) _ 1 ，2 酒精二甲苯( 5 m i n ) _ 二甲苯A ( 1 0 m i n ) 叫二甲苯B ( 1 5 r a i n ) _ 封片_ 显微摄影观察。 2 2 结果 221 胡子鲇早期性腺的发生与分化 3 日龄胡子鲇( 全长62 a ：03
24、 m m ) ，肾管下方可观察到1 个生殖脊( 图I ：1 ) 。5 日龄胡子鲇 ( 全长93 0 l m m ) ，左右两个生殖嵴伸入腹腔( 图1 ：2 ) 。8 日龄胡子鲇( 全长2 08 士0 2r a i n ) ， 部分胡子鲇的性腺横切面变宽，里梨状，其内各含有1 2 个原始生殖细胞( P G C ) 。P G C 体 积大、界限明显，与其他细胞存在明显细胞间隙。胞质呈弱嗜酸性，细胞核大且透亮，约占细 胞体积的1 2 2 3 ，核内一被染成深蓝色的核仁体积快速增大( 图l ：3 ) ；另一部分胡子鲇的 性腺横切面则前端尖，中间稍突，后端呈细长柄状。增生不明显( 图1 ：4 ) 。1
25、0 日龄( 全长 1 83 ：+ - 01m m ) 横切面呈梨状的胡子鲇性腺，体细胞开始迅速增殖，体积增大( 图1 ：5 ) ；而横 切面呈梭状的性腺，体细胞增殖不明显，体积微增( 凰16 ) 。 2 22 胡子鲇，F 巢的分化 1 2 日龄觇子鲇( 全长2 29 士O2 m m ) ，性腺发育较快，其内P G C 数目无明显增加，在性腺 1 0 查塞兰盔兰竺坚望! 兰查型竺圭耋堡堡兰 柄部出现一个组织突( 图2 ：1 ) 。1 3 日龄胡子鲇( 全长2 33 02 r a m ) ，P G C 迅速增殖，组织突 增大，并向腹部弯曲( 图2 ：2 ) 。1 4H 龄胡子鲇( 全长2 36 O
26、1r m 3 3 ) ，组织突继续生长，即将 与腹面性腺融合( 图2 ：3 ) 。1 6 同龄胡子鲇( 全长2 84 02m m ) ，原始卵巢腔形成( 图2 ：4 ) 。 1 8 日龄胡子鲇( 全长3 2 铷2 呻) ，在生殖上皮及附近基质中出现卵原细胞。此细胞呈圆形。 卵径1 4 1 6 t u n ，胞质较少，嗜碱性。核较大，桉径8 1 2 岬，染色较浅( 图2 ：5 ) 。2 2 口龄 胡子鱼5 ( 全长4 25 圭o 1m m ) ，卵巢内现大量初级卵母细胞。初级卵母细胞体积明显大于卵原细 胞，呈卵圆形，胞质嗜碱性，被苏木精染成蓝紫色，核内出现3 5 个核仁，核径2 2 2 8 t
27、u n ， 卵径3 0 4 0 岬( 图2 ：6 ) 。初级卵母细胞的出现标志着卵巢细胞学分化的开始。 降于： 5 霞 2 ， k 图I 胡子鲇早期性腺的发生与分化 F 嘻l b 巾g o n a d d e v e l o p m e n t a n dd i f f e r e n t i a t i o n o f C l a r i a s f u s c , s lm 膜后3 日示生殖蝌( O R ) ( A g o a a do f 3d a y sa n Hh a t c h i n g s h o w l n 8 8 。i t a lr i d g e ) ：2 l 膜后5n
28、+ 殖崎( G R ) ( A g o n a do f 5d a y sa 晒h a t t i n g s h o w i n 9 8 i t a lr i d g e ) 3I l l m E8I i ；娘始生镕细胞( P G C ) ，( G o n a d 螂c 呲c l g h td a y sa n h a t c h i n g s h o w i n gp r i 帅r d i a l 鲫叫l i n t h eg l t a lr i d g e ) ：4 m 腱后8 | | 、镕嵴( G R ) ( Ag o n a do f 8d a y s 姐日h a t c h i
29、 n g s h o w i n g 肛n l t a l d 磬) 5 出膜目I O 日，月件祝增人的原始性脾( P G ) 目M 始生M 镕胞( P G C ) ，( G r o w l n gp r i m a r yg o n a d 锄d 砷删e 洲捌J 妇d 炉枷蚴嘴) ，引o f j 斛性腻w 、删性骆( P 0 ) ( G w w i q g d m 删p 1 1 唧g 删1 0 d 啪曲自 v ， 一芷 ；j - f 缈 好一 燮 6 圈2 胡子鲇卵巢分化过程 F 罾2 P r o c t s s o f t h e o v a r y d k r 蛐妇雠日o f C a r
30、 i a s f u 删s 1m 膜后1 2 q m 织突( 1 D ) ( G o n a d 栅c I I _ R 1 2d a y sa f I 口h a m h i n g _ 女“M n g g 呲o u t 目r o , , a h ) ：2 I I I 膜日1 3U 、4 伸K 的组擐突( T o ) ，( G o n a d 由岫肼1 3d a y sa 腑h a t c h i n g , 女ge L o n g a t e du s s 咖t g r o v a h ) ，3 m 麒后1 4U ，示目J 将融 的组织突( 1 D )( G o n a d m1 4 d a
31、y sa 舡rh a t c h i n g , s h o w i n g “a r e f u s i n g t o f b 删一c 州i t y ) ：4I l l 膜后1 6 “ 巢腔( O C ) ，( G o n a d m m d u m 】6d a y s a O c rh a t c h i n g , s h o w i n go v a r i v i t y ) ，5l I l 媵1 8U 示卵坂细胞( O G )( G o n a d 姗1 8d a y sa f t e rh a 【c h i n g , s h o w i n g0 0 9 0 n i u m
32、) mI l l 膜后2 2r 1 “初级卵母细胞( o o ) ，( G o m K ia n l e t 砒2 2d a y sa t i e r h a t c h i n g , s h o w i n go o c eJ 2 23 胡子鲇精巢的分化 胡子鲇精巢分化时期晚于卵巢，其主要特征为精小叶及输出管的形成以及生殖细胞的分 裂。1 2 只龄胡子鲇( 全长2 29 = L O2 m r n ) ，原始性腺的细胞开始有丝分裂，性腺增大，但无组 彭 突出现( 图3 ：1 ) 。1 6 同龄胡子鲇( 全长2 8 4 士o2 m m ) ，性腺继续增大( 图3 ：2 ) 。2 2 闩龄胡 子
33、鲇( 全长4 25 如1m m ) ，切片中可见精原细胞4 i 定向地分散于问质细胞之问，精原细胞体积 图3 胡子鲇持巢分化过程 舸I z 3 P m c e 缸o f t h e 懈恤d l i f e m 6 - 6 0 no f C L a r 蛔，酏删$ l1 2U 龄性腺，求体积伸K 的埠始性腺( P G ) ，( G m ”呜e l b o w e dp , l r n , y 印n 耐1 2d a y s m H h a t c h i n g ) ，21 6 日龄性辣w c 体积增人的瞒皓性腺( P G ) ，( G r o w i n gp r i m m ，g o n 1
34、6 d 郇a 腑h a l c h i n g ) 32 2 於性辣示精朦细胞，( G o n a d 咖础鹋2 2d a y s 船h a t c h i n g s h o w i n g m 。s p 押T 嗍o n m ) ：43 0 I I 龄性腺，d 输精管( s D ) 精鳆细胞( S G ) ( A g o n a do f 3 0d q s a 日 h a | c h l n g , s h o w l n g5 p a ”鲥cd u c t s 锄d s P 邪皿o g 皿m ) ：5 柏【1 特性腺示机精母缃胞( s c ) ( G o n a ds 咖c 帆4 0 d
35、a y sa 肚r h a t c h i n g , s h o w i n g “qs p o q ) 2 3 讨论 2 3 】胡子鲇早期性腺的发生与分化 原始生殖细胞( P C , C ) 进入生殖嵴以后是向雄性的精原细胞分化还是向雌性的卵原细胞 1 3 性类固醇激素及温度对胡子鲇性分化的影响 分化，早在精卵结台的瞬间就己决定。事实上，性腺的形态学变化与性别之问存在一定关系。 大量研究表明，分化成精巢的生殖腺中微血管往往出现在其背部，而将分化成卵巢的生殖腺， 微血管往往出现在侧面及中央1 1 1 2 0 】。对大西洋鲑( S a l m os a l a r ) 的研究表明，生殖嵴横切面
36、呈 圆形的未来将分化为卵巢，而生殖嵴横切面呈三角形的未来将分化为精巢1 2 0 】。林光华等I “I 在 研究革胡子鲇( C l a r i a sl a z e r a ) 性别分化时也发现相似的结果，即生殖腺横切面呈梨形的将分 化为卵巢，而生殖腺横切面呈长条形的将分化成精巢。 在胡子鲇的性腺分化过程中，性腺微血管、生殖细胞、基质细胞等并未出现规律性变化， 但雌、雄鱼早期性腺的形态特征有明显不同。未来将要发育为卵巢的性腺，早期横切面变宽， 呈梨状，体积快速增大；而将发育为精巢的性腺早期横切面前端尖，中间稍突，后端呈细长 的柄状，增生并不明显。胡子鲇早期性腺的这些特征与林光华等胂1 对革胡子鲇
37、的研究结果相 类似。 232 ，日巢腔的形成方式 在形态学上，判断性腺向卵巢分化的重要而可靠的标志是卵巢腔的形成。然而，不同鱼类 初始卵巢腔的形成方式却各不相同。青鳝( O r y z i a s l a t i p e s ) I l 删通过性腺向体腔后壁拉伸，边 沿与体腔后壁融合形成卵巢腔；泰山螭霖鱼( V a r i c o r h i n u s m a c r o l e p i s ) 1 2 1 I 在未分化性腺的基部 先出现由上皮细胞形成的纵裂小腔，之后生殖腺内裂隙形成小的卵巢腔；南方鲇( S o u t h e r n C a t f i s h1 1 ”1 在生殖则嵴腹面形
38、成两个纵向的组织突两组织突伸长并向腹面方向靠拢并融合 形成卵巢腔，或- - b Y 组织突生长较快，向另一侧弯曲生长，越过生殖腺的膜中线与另一侧组织 突融台而形成卵巢腔。 本实验发现。胡子鲇在出膜后1 2 日，性腺原基的背部出现一组织突，组织突不断伸长， 形成性腺原基的一个分支，同时向性腺原基靠拢，到出膜后1 6 日，形成原始的卵巢腔。胡子 鲇卵巢腔的形成方式与青鳝1 0 0 、泰山螭霖鱼口”、南方鲇I 有所差别但与黄桑鱼( P e l t e o b a g r n v f u I v i d r a c o ) 【l ”基本一致。 233 胡子鲇性腺细胞学上的分化 虽然借助形态学特征可初步
39、判断性别，但细胞学上的分化依然是判断鱼类性别的最可靠依 据。本研究发现，在出膜后2 2 日，胡子鲇卵巢内出现初级卵母细胞，卵巢开始了细胞学上的 分化；而出膜后4 0 日，精巢内出现初级精母细胞。标志着雄性生殖细胞进入成熟分裂阶段 精巢开始了细胞学上的分化。 通常，性腺中原始生殖细胞的活动并非只在成熟分裂时才发生分化，雌、雄生殖腺中的生 殖细胞在早期有丝分裂活动中即显示出了巨大差别。青鳙刚孵化出膜时，其雌、雄性腺中生殖 细胞的数目就有不同，在注定要发育成卵巢的性腺中，生殖细胞的数目比注定要发育成精巢的 性腺中生殖细胞数量多，且卵巢中生殖细胞的有丝分裂和成熟分裂所发生的时间早于精巢中的 生殖细胞1
40、 1 圳。本研究发现，胡子鲇早期雌、雄性腺中生殖细胞数目增加的时期明显不同，卵 但与革胡子鲇【1 2 】和黄桑鱼基本一致。胡子鲇精巢分化始于出膜后3 0 日龄，成熟分裂最早发生 于出膜后4 0 日龄。在出膜后3 0 日龄，精原细胞充满整个性腺，并且成团成簇分布，形成精 小叶的雏形，同时在性腺靠近体腔膜的部位出现明显的输精管，进而开始精巢的分化。此变化 与半滑舌鳎矧和南方鲇1 及黄桑鱼的精巢分化过程类似。 综上所述，胡子鲇早期性腺形态学差异，可作为判断其性腺分化的一个标志。未来发育 为卵巢的性腺横切面呈梨状，体积增长迅速；而未来发育为精巢的性腺呈梭状，增生不明显。 此外，在形态学及细胞学水平，胡
41、子鲇雌性性别分化均明显早于雄性。雌鱼在出膜后1 6 日龄 形成卵巢腔，1 8 日龄卵原细胞进入活跃分裂期，2 4 日龄进入成熟分裂：而雄鱼在出膜后3 0 日出现精小叶和输精管，并且精原细胞进入活跃有丝分裂增殖期4 0 日进入成熟分裂期。 堡耋垦矍塞耋墨兰墨翌塑王塑丝坌些塑星竺 31 7 c t M T 对胡子鲇生长发育及性分化的影响 甲基睾丸酮叉名甲基辜丸素，是人工合成的白色或乳白色结晶性粉末状。雄性激素，具 有雄性和蛋白同化双重作用。它能促进雄性性器官发育成熟和第二性征的形成，并能对抗雌激 素、抑制子宫内膜生长及卵巢垂体、促进蛋白质合成代谢、兴奋骨髓造血功能、刺激血细胞的 生成。关于1 7
42、a - M T 对胡子鲇性分化和生长影响的研究，迄今未见报道。本章着重报道1 7 a - M T 对胡子鲇性腺分化，以及对F o x l 2 表达量的影响。 3 1 材料与方法 3 1l 实验材料 1 7 a - M T 处理的胡子鲇为广西玉林牧源渔牧有限公司同一批亲鱼繁殖孵化而来的仔鱼。 F o x l 2 基因克隆用胡子鲇成鱼购自湛江市霞山区步行街新街肉菜市场，雌雄鱼各3 尾( 体长： 2 2O a = 37c m ，体重：1 9 70 = I = 3 7 ，5g ) 均为性成熟个体；性腺分化时期表达用胡子鲇仔鱼采自 广西玉林牧源渔牧有限公司养殖基地，取出膜后第1 2 d ( 体长：O9
43、3 士0 0 2c m ) 、1 8 d ( 体长： 12 士o l Oc m ) 、2 4 d ( 体长：15 9 - 0 1 5e m ) 和3 0 d ( 体长：26 4 0 1 2c m ) 胡子鲇仔鱼各3 尾， 液氨保存各用。 3 12 饲养条件 同2 1 2 。 3 13 实验仪器厦工具 F o x l 2 基因片段克隆所用仪器及工具如下： A G 2 2 3 3 1 型核酸蛋白测定仪，台式高速低温离心机购自德国E p p e n d o r fH a m b u r g 公司；E L G A P U R E 超纯水器购自英国E L G A 公司：G D S 一8 0 0 0 凝胶
44、图象分析购自美国G e n e 公司；5 8 0 B R l 0 5 3 1 型P C R 热循环仪购自美国B I O - R A D 公司：u B 一7p H m VM e t e r 购自美国D E N V E R 仪器公司：D G X 一 9 0 0 3 系列鼓风干燥箱、D P X 一9 0 0 2 8 一I 2 电热恒温培养箱、K Y C 系列空气恒温摇床购自上海福玛 实验设备有限公司：s W c J 系列洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司：不锈钢手提式压 力蒸汽灭菌器、蛐s 型电热恒温水浴锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂：H z O - F 1 6 0 全温 振荡培养箱购自哈
45、尔滨市东联电子技术开发有限公司； 3 l4 所用试剂及配制 F o x l 2 基因片段克隆所用试剂及溶液配制如下： 3 14 1 试剂盒夏主要药品 M - M L 、，R e v e r s eT r a n s c r i p t a s e 购自P r o m e g a ；T R l z o lR e a g e m 购自l n v i n o g e n ：S M A R T e r R A C E 试剂盒购自C l o n t e c h ；G o l d V i e w 核酸染料购自上海赛百盛；T a q 酶、1 0 上样缓冲液、 D L 2 0 0 0 D N A M a r
46、k e r 、p M D l 8 一T 载体购自T a k a r a ；D E P C 水购自上海生工生物工程公司；D N A 纯化回收试剂盒购自广州天根。蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、喇s 全部进口分装。氪苄青 1 6 ( 1 ) L B ( 无A m p ) 液体培养基：称取O5g 酵母提取物，1g 蛋白胨，定容至1 0 6 m L ，用 1 0r a o F L N a O H 调p H 至7 0 ，1 2 l 高压灭菌2 0 m i n ig N a C I ，加入9 5 m L d d H 2 0 ，。 ( 2 ) L B ( 无A m p ) 平板：在1 ( 2 0 m L L B
47、 液体培养基中加1 5g 琼脂粉，1 2 1 高压灭菌2 0 m i n ， 冷却至5 0 左右，倒平板。 ( 3 ) L B ( 含A m p ) 液体培养基：在灭菌后L B 液体培养基中，加入A m p 贮存液( 滤器过 滤除菌) 至终浓度为1 0 0 , g m L 。 ( 4 ) L B ( 含A m p ) 平板：在1 0 0 m L L B 液体培养基中，加入1 5g 琼脂粉，1 2 1 高压灭 菌2 0 r a i n ，待冷却至5 0 C 以下，加入A m p 贮存液至终浓度为1 0 0 I t g m L ，倒平板。 0 1 m o V L C a C J 2 ：称取05 5
48、 5g C a C l z ，溶于4 0 m L 去离子水中，待溶解后容量瓶定容至5 0 m L 。1 2 1 高压灭菌2 0 r a i n 。 3 1 _ 5 实验方法 3 1 5l1 7 舢M T 处理及取样 本实验采用1 7 a - M T 浸浴法。将1 7 a - M T 溶解于9 5 乙醇并稀释至低( 5 0 以) 、中( 1 0 0 9 9 L ) 和高( 2 0 0 跆t ) 三个浓度，乙醇浓度低于千分之一。三个处理组和一个对照组各设一个平行。 每组5 0 0 尾2 日龄仔鱼全天浸育，处理时间为一个月。每天投喂四次，并保持各组仔鱼生活的 水温、水质、溶解氧一致。 从出膜后2 日
49、龄开始，2 5 0 日，每日从每个处理组中随机取样1 0 尾，6 条迅速转移到 B o u i n s 液中固定，经过梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片厚度6 1 m a 。H E 染色 中性树胶封片，L a e a 显微镜观察、拍照。用于F o x l 2 表达的4 尾鱼，放A 冷冻管，液氮保存。 # Y - C + T v = A + C + G -B = G - - C + T M - A + C - R = A + GrW 5 A + T 3 15 3 胡子鲇F O X l 2 的克隆 利用S M A R T e rR A C E 试剂盒克隆胡子F o x l 2 c D N A 片段。取雌性胡子鲇脑垂体组织，抽提 总R N A ，实验流程参照I n v i t r o g e nT