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1、分光光度技术,分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。,第一节 光学原理,把电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的射线排列，既为电磁波的波谱,电磁波谱,当光线通过某种物质的溶液时，透过光的强度会减弱。因为它分成了三部分： 一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分被组成此溶液的物质所吸收，其余便是透过光的强度。即： 入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光,“空白”校正：在检测过程中，若用蒸馏水或待测溶液的溶剂作为“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的损失，则： 入射光(I。)=吸收光+透过光(I),分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含
2、量的技术。 吸收光谱（absorption spectrum）即物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。 分子对各个波长的光吸收程度不同，这是分子的结构特性所决定的。,物质所发射的光是具有波粒二象性： 微粒性 波动性 E 为光子的能量；为光波的频率（Hz）；h为普朗克常数（6.626）； c为光速（2.9977108ms）；为光波的波长,光波具有一定的频率。不同单色光的颜色不同，即因其频率不同所致。 不同频率的光波在真空中的传播速度相同。根据光的速度(c)和频率(v)可计算出它的波长(入 ),物质的吸收光谱:在连续光谱中某些波长的光被物质吸收后产生的光谱被称作吸收光谱,包括分子吸收光谱和原
3、子吸收光谱。吸收光谱取决于物质的结构。,从一个有连续光谱的光源，逐步地分出各个波长的光，使其透过待测物的真溶液，测出其在不同波长时的光密度； 然后以波长为横坐标，光密度为纵坐标，就可以得到待测物的吸收光谱曲线； 由此找出其中吸收最强的波长，作为灵敏光波长对该物质未知液液进行定量测定。,曲线1-细菌叶绿素a；曲线2-叶绿素a；曲线3-叶绿素b；曲线4-藻胆红素；曲线5-类胡萝卜素,朗伯-比尔定律： I0：入射光强度 C:溶液浓度 b:液层厚度 I:透射光强度 T:透光度 A:吸光度 k:吸光系数,I0,I,朗伯-比尔定律的适用条件： 1.入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大；
4、2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。 3.适用于分子吸收和原子吸收。,光谱分析技术的分类,分子吸收法: 可见与紫外分光光度法、红外光谱法 分子光谱 分子发射法: 分子荧光光度法 光谱技术 原子吸收法：原子吸收法 原子光谱 原子发射法：发射光谱分析法、原子荧光法等,第二节 紫外-可见分光光度计,分光光度计:能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。 分析精密度高 测量范围广 分析速度快 样品用量少,根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。,紫外-可见分光光度计：工作波段在200nm800nm的
5、分光光度计。其中： 200nm400nm为紫外光区。 400nm800nm为可见光区。 属于分子吸收光谱仪。,721 可见分光光度计,722系列 可见分光光度计,SP-756P紫外可见分光光度计,TENSOR系列红外光谱仪,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,紫外-可见分光光度计的基本结构示意图,它包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表,光源（light source）：提供入射光的装置。 要求: 1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱； 2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。 常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体
6、放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。,几种常见光源比较,单色器（Monochromator）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。,入射狭缝：限制杂散光进入； 色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种； 准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上； 出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制 通带宽度。,吸收池（absorption cell）：是用来盛放被测溶液的器件。 在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作； 在低于350 nm的紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。 同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保
7、持一致。 指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。,微型吸收池（Microdrill absorption cell） ：“光程/体积比”提高了近10倍。 多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。,通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：,检测器：把光信号转换为电信号的装置。 对检测器的要求： 1、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系； 2、波长响应范围大； 3、灵敏度高； 4、响应速度快，一般要求小于10-8s； 5、产生的电信号易于检测、放大，噪声低。,