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1、DB33/T 2005浙江省质量技术监督局发布2005-07-15实施2005-07-01发布乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 酶联免疫吸附法Determination of aflatoxin M1 in milk and milk powder-Enzyme-linked immunosorbent assayDB33/T 5562005DB33浙江省地方标准ICS 67.040C 53备案号：1DB33/T 5562005前 言本标准由杭州市质量技术监督局、杭州市农业局共同提出。本标准由浙江省质量技术监督局归口。本标准由杭州市农产品检测站负责起草。本标准主要起草人：胡学肖、杨华、袁谦、吴玲
2、玲、李容、姚建红。I引 言黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在动物体内的羟基化代谢产物，具有剧毒性和致癌性。目前我国有关黄曲霉毒素M1的标准检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱法和荧光光度法等，本方法是用于定性和半定量的快速测定法，适合快速检测和批量样品的筛选。II乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 酶联免疫吸附法1 范围本标准规定了乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、乳粉等乳品中黄曲霉毒素M1的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标
3、准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理标准溶液和样品试液加入各自板孔，游离的黄曲霉毒素M1与微孔中包被的黄曲霉毒素M1抗体结合，没有结合的物质在洗涤中被清除。再加入黄曲霉毒素M1酶标记物，将没有结合的抗体位点全部覆盖，结合的酶标记物通过显色液显示出来。最后加入终止液，用酶标仪在450nm测定吸光度值，吸光度值与样品中的黄曲霉毒素M1含量成反比。4 试剂和溶液4.1 本实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水。4.2 黄曲霉毒素M1试剂盒注：不同品牌的黄曲霉毒素M
4、1试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调整。：最低检出限不大于0.02g/kg。4.2.1 微孔板。4.2.2 黄曲霉毒素M1标准溶液：浓度范围00.10g/kg。4.2.3 酶标记物浓缩液。4.2.4 酶标记物稀释用缓冲液。4.2.5 显色剂。4.2.6 柠檬酸缓冲液。4.2.7 终止液。4.2.8 样品稀释缓冲液。4.2.9 洗板浓缩液。4.3 酶标记物工作液：实验前计算用量，用酶标记物稀释用缓冲液（4.1.4）将其浓缩液（4.1.3）以1：100稀释，切勿涡旋混合，配制后放回试剂盒放置4h以上，备用。4.4 显色反应液：显色剂（4.1.5）用柠檬
5、酸缓冲液（4.1.6）以1：10稀释，在使用前配制，避光保存。4.5 洗板工作液：洗板浓缩液（4.1.9）用水以1：20稀释，备用。4.6 0.36mol/L亚铁氰化钾溶液：称取15.2g K4Fe(CN)63H2O，用水溶解、定容至100mL。4.7 1.04mol/L硫酸锌溶液：称取29.9g ZnSO47H2O,用水溶解、定容至100mL。5 仪器和设备5.1 微孔板酶标仪（带450nm滤光片）。5.2 天平：最小感量0.01g。5.3 冷冻离心机：最大转速不小于3000rpm。5.4 旋涡混合器。5.5 连续可调移液器及配套吸头：5L50L、20L200L、200L1000L。5.6
6、脱脂棉签。5.7 实验室常规玻璃器皿。6 分析步骤6.1 样品前处理6.1.1 生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳以下简称液态乳：将待测样品摇匀，平行称取两份5.0g试样（精确到0.1g）到10mL离心管中，2 oC8 oC 以3000rpm的转速离心10min，用脱脂棉签除去上层脂肪。加入150L亚铁氰化钾溶液（4.5），短暂涡旋混合后加入150L硫酸锌溶液（4.6），涡旋振荡3min。10oC15 oC 以3000rpm的转速离心10min，上清液供测试用。6.1.2 乳粉：平行称取两份10.0g待测乳粉（精确到0.1g）到各自小烧杯中，加水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容至刻度。以下步骤同6
7、.1.1。6.2 测试程序6.2.1 以下操作均须在20 oC25 oC温度下进行。6.2.2 取出试剂盒，放置1h以上，使其温度恢复到20 oC25 oC。将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，并记录标准和样品对应的位置。6.2.3 加100L标准溶液（4.1.2）和已处理好的样品试液到各自微孔中，孵育60min。6.2.4 倒除微孔中的液体，注入洗板工作液（4.4）约300L，重复洗涤5次，最后在吸水纸上轻轻拍干。6.2.5 在所有微孔中加入100L酶标记物工作液（4.2），孵育20min。6.2.6 重复6.2.3步骤。6.2.7 在所有微孔中加入100L显色反应液（4.3），孵育3
8、0min。6.2.8 在所有微孔中加入50L终止液（4.1.7），混匀后60min内在450nm处测定吸光度值。7 分析结果计算和表述7.1 标准工作曲线绘制以标准溶液的浓度值（C）为横坐标，相对吸光度值（B/B0）为纵坐标，在半对数坐标纸上绘制标准工作曲线。相对吸光度值（%）= B/B0 100 - (1)式中： B 标准（或样品）的吸光度值；B0 空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值。7.2 结果计算7.2.1 液态乳中黄曲霉毒素M1的含量按式（2）计算：X1 = k1Cx - (2)式中：X1 液态乳中黄曲霉毒素M1的含量，g/kg； k1 液态乳在前处理过程中的稀释倍数。 Cx 由测试
9、用上清液的相对吸光度值查标准工作曲线得到的黄曲霉毒素M1的浓度，ng/mL；7.2.2 乳粉中黄曲霉毒素M1的含量按式（3）计算：X2 = k2CyV/m - (3)式中：X2 乳粉中黄曲霉毒素M1的含量，g/kg； k2 乳粉定容后分取液在前处理过程中的稀释倍数。 Cy 由测试用上清液的相对吸光度值查标准工作曲线得到的黄曲霉毒素M1的浓度，ng/mL； m 乳粉称样量，g； V 乳粉定容体积，mL。计算结果表示到小数点后两位。8 检出限与允许差8.1 检出限 液态乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的检出限分别为0.02g/kg和0.20g/kg。8.2允许差每个试样称取两份进行平行测定，以其算术平均值为分析结果。其分析结果的相对偏差应不大于15%。9 其他9.1 本方法为半定量快速测定法，当测定结果超标时，以国家标准方法的测定结果为准。9.2 黄曲霉毒素M1具有剧毒性和强致癌性，检验人员应戴乳胶手套，避免直接接触黄曲霉毒素M1标准溶液和酶标记物等试剂；使用过的粘有黄曲霉毒素M1的玻璃容器等最好用10%（V/V）高氯酸溶液浸泡过夜。