【精品论文】不同的胞外基质对人胚胎干细胞分化为造.doc

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1、精品论文不同的胞外基质对人胚胎干细胞分化为造血祖细胞的影响朱明霞，王晶，克晓燕5（北京大学第三医院血液科，北京 100191） 摘要：采用在胞外基质上直接贴壁培养法诱导人胚胎干细胞分化为造血祖细胞，探讨不同的 胞外基质对产生造血祖细胞的影响。选择三种胞外基质基质胶（Matrigel）、纤维粘连蛋 白（Fibronectin）和 IV 型胶原蛋白（Collagen IV），采用直接贴壁诱导方法，分步添加造 血生长因子诱导人胚胎干细胞向造血祖细胞分化，通过造血集落形成、流式细胞术以及实时10定量 PCR 方法检测造血特异性标志物的表达，比较这三种胞外基质对生成造血祖细胞的差 异。结果表明，诱导 1

2、4 天时 IV 型胶原蛋白组形成造血集落形成细胞数目、产生 CD34 阳性 细胞数以及造血特异性基因 SCL 和 CD34 的表达量均明显高于其它两组（P0.05）。研究 发现人胚胎干细胞在胞外基质上直接贴壁诱导能有效地分化为造血祖细胞，且 IV 型胶原蛋 白更有利于向造血系的分化。15关键词：造血祖细胞；人胚胎干细胞；胞外基质；直接贴壁诱导中图分类号：R55Effects of different extracellular matrix on hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells20ZHU Mingxia,

3、WANG Jing, KE Xiaoyan(Department of Hematology,Peking University Third Hospital, Beijing 100191)Abstract: Human embryonic stem (hES) cells could differentiate into hematopoietic progenitors through adherent culture directly on extracellular matrix. The effects of different extracellularmatrix on hem

4、atopoietic differentiation were investigated. hES cells were adherently cultured on25matrigel, fibronectin and collagen IV, respectively. And several growth factors were administrated to the medium during the differentiation process. The efficiency of committing hES cells tohematopoietic progenitors

5、 was determined by hematopoietic colony forming unit assay, flow cytometry, and real-time quantitative PCR analysis. The efficiencies on three extracellular matrix were compared. At day 14 the total yield of colony forming cells, the proportions of CD34+ cells30determined by flow cytometry, and the

6、expression level of SCL and CD34 on collagen IV werestatistically significantly higher compared to the other extracellular matrix (P0.05). So hES cells can efficiently differentiate into hematopoietic progenitors by adherent culture directly on extracellular matrix. In addition, collagen IV can impr

7、ove hematopoietic differentiation of hES cells.35Keywords: hematopoietic progenitors; human embryonic stem cells; extracellular matrix; adherent culture0引言胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES 细胞）具有无限增殖和多向分化的特性，在体外40可分化为三个胚层的所有细胞1，定向诱导人 ES 细胞分化为造血干/祖细胞，可以为造血干 细胞移植提供新的细胞来源。目前诱导人 ES 细胞向造血细胞分化多采用 ES 细胞与基质细 胞共

8、培养以及拟胚体的方法 2,3，但是这两种方法分化效率均比较低，而且存在动物源性污 染离临床应用距离甚远。本研究采用人 ES 细胞在胞外基质上直接贴壁培养向造血细胞诱导，基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类基金资助项目（20120001120132） 作者简介：朱明霞，（1977-），女，助理研究员，主要研究方向：干细胞诱导分化以及恶性血液病发病机 制研究。通信联系人：克晓燕，（1955-），女，教授，主要研究方向：恶性血液病的发病机制。E-mail: - 8 -既没有拟胚体复杂的三维立体结构，又不受基质细胞的影响，从而排除异源性污染，旨在建45立人 ES 细胞分化为造血祖细胞的简单

9、高效的诱导体系，并探讨不同的胞外基质对其分化的 影响。1实验1.1 主要材料和试剂人胚胎干细胞系 PKU1.1 由北京大学第三医院生殖中心陈贵安教授馈赠，为 PKU1 连续50传代 30 代后建立的单细胞克隆亚系，染色体核型为 46，XX4。KnockOutTM DMEM 培养液、 KnockOutTM 血清替代品（SR）和 IMDM 培养液以及胞外基质 Fibronectin 和 Collagen IV 均 为美国 Gibco/Invitrogen 公司产品；Matrigel 为美国 BD 公司产品；细胞因子均购于美国 PeproTech 公司；HIT（人血清白蛋白+重组人胰岛素+人转铁蛋白

10、）和甲基纤维素培养基 MethoCult 4435+购于加拿大 Stem Cell Technology 公司；流式抗体均为 BD Pharmingen 公司55产品；Mini RNA 提取试剂盒为德国 Qiagen 公司产品；SYBR Green Super Mix 购于美国Bio-Rad 公司；引物合成由北京奥科公司完成。1.2 胞外基质预处理培养板设立 3 组：分别将 Matrigel、Fibronectin 和 Collagen IV 置于 4融化，以预冷的 IMDM培养液按 1:20 比例稀释。各取 2ml 均匀铺于 6 孔培养板，37孵育 2h，吸出后以 IMDM 培60养液清洗

11、1 遍，待用。1.3 人 ES 细胞直接贴壁培养分步向造血祖细胞诱导第一步将生长 5 6d 后的人 ES 细胞经 Dispase 酶消化后，以基础分化培养基（IMDM+HIT+MTG+谷氨酰胺+非必需氨基酸）重悬，按 2104 细胞数/cm2 的密度接种至胞 外基质预先包被过的 6 孔培养板中贴壁培养，培养基中同时添加细胞因子骨形态发生蛋白65（BMP4，25 ng/ml）、血管内皮生长因子（VEGF，20 ng/ml）和碱性成纤维生长因子（bFGF，10 ng/ml）诱导 7d；第二步更换细胞因子为干细胞因子（SCF，50 ng/ml）、芙莱基 3 配体（ Flt 3L，50 ng/ml）、

12、白介素 3（IL-3，10 ng/ml）和白介素 6（IL-6，10 ng/ml）继续诱导 分化 7d，共诱导 14d。每 3 天更换新鲜的培养基和细胞因子。倒置相差显微镜下观察分化细 胞的形态。将人 ES 细胞在未经胞外基质包被的培养板上培养且不添加细胞因子设为对照组。701.4 检测指标（1）造血集落形成试验（CFU）：收集培养液中诱导 14d 的细胞，PBS 清洗 2 遍，40 m 无菌细胞筛过滤除去大的细胞团块 ，将分化细胞按 1105 细胞数/ml 接种于半固体甲基纤维 素培养基 MethoCult 4435+中培养 14d 后显微镜下观察形成的细胞集落数目（CFC）；（2） 流式细

13、胞术分析（FCM）：收集培养液中诱导 14d 的细胞，40 m 无菌细胞筛过滤除去大的75细胞团块 ，将细胞密度调整为 5105 细胞数/ml，PBS 清洗 3 遍，分别加入流式抗体小鼠抗 人 CD34-APC、小鼠抗人 CD31-PE 和小鼠抗人 CD45-PE，同型对照为小鼠 IgG1-APC 和 IgG1-PE，4避光孵育 30min。碘化丙啶（PI）除去死细胞。上机分析分化细胞中各表面标 志物阳性细胞的比例；（3）实时定量 PCR 检测：分别提取人 ES 细胞以及诱导 3d，7d 和14d 分化细胞的总 RNA，反转录后采用 SYBR Green 法进行实时定量 PCR 检测造血特异性

14、80基因的表达。反应总体系为 10 l，反应条件为 95预变性 5 min，95变性 10 s，退火 30 s，精品论文共 40 个循环。各基因引物序列及退火温度（Tm）见表 1。采用 2-Ct 法进行数据处理。表 1 实时定量 PCR 各基因引物序列、退火温度以及扩增产物大小Table 1 Q-PCR gene primer sets, predicted size, and annealing temperature基因名称 引物序列（5-3） Tm 产物大小-actin 上游 CCTGGGCATGGAGTCCTGTG 59 182 bp下游 TCTTCATTGTGCTGGGTGCCBra

15、chyury 上游 TGGCTTCTTCCTGGAACCAG 60 118 bp下游 GGCTCCTCAGGGTTGGGTACFlk1 上游 TGAAGGATGGGAACCGGAAC 56.4 141 bp下游 TCGTCTTTTCCTGGGCACCTSCL 上游 CTTCACCAACAGCCGGGAGC 54 81 bp下游 TGTGTGGGGATCAGCTTGCGCD34 上游 GATTGCACTGGTCACCTCGG 59 107bp下游 CTTCGCCCAGCCTTTCTCCT851.5 统计学分析实验数据以均数标准差（ s）表示，应用 SPSS 17.0 统计软件分析，两组之间进 行

16、 t 检验，三组以上进行单因素方差分析（ANOVA）。2结果902.1 人 ES 细胞和分化细胞形态学观察人 ES 细胞在无饲养层细胞的培养体系里呈巢状集落样生长，扁平状。细胞之间界限清 楚，细胞胞核大，胞质少，核质比高（图 1a）；当人 ES 细胞在胞外基质包被过的培养皿里 贴壁诱导，边界逐渐消失，分化出的细胞向四周扩散（图 1b），分化至 10d 细胞表面开始 出现许多囊腔结构（图 1c），里面充满着圆形细胞（图 1d），随着诱导时间的延长，这些95圆形细胞有的会从囊腔结构中跑出来，漂浮在液体里，直至诱导 14d 时分化细胞表面布满了 圆形细胞（图 1e, 1f）。100105110115

17、图 1 人胚胎干细胞以及不同诱导天数的分化细胞显微镜下的形态。(a)人胚胎干细胞；(b)诱导 7 天时细胞形态；(c)和(d)诱导 10 天时细胞形态；(e)和(f)诱导 14 天时细胞形态。Fig. 1 Morphologies of hES cells and differentiating cells at different days under microscope. (a) hES cells. (b) The differentiating cells at day 7. (c) and (d) The differentiating cells at day 10. (d) T

18、he differentiating cells at day14.2.2 分化细胞的鉴定（1）造血集落形成：将分化细胞接种至甲基纤维素培养基中检测其造血集落形成能力， 培养 2 周后各实验组镜下均可观察到红细胞系、粒细胞系和混合细胞集落等各系细胞集落（CFC）的形成（图 2b），三组分别为 10 1.5/105 细胞数、16 3.5/105 细胞数以及 51 6.1/105 细胞数，Collagen IV 包被组形成 CFC 数目明显多于前两组，具有统计学差异（P0.01）， 其中形成 CFU-E 和 CFU-G 数目高于 Matrigel 以及 Fibronectin 包被组（P0.05）

19、（图 2a）。对照组未见有造血集落的形成。（2）流式细胞术分析特异性标志物的表达：诱导 14d 的分化细胞进行 FCM，结果显示Matrigel、Fibronectin 以及 Collagen IV 包被组 CD34 阳性细胞数分别达到 7.18% 0.32%、9.59% 0.4%、14.42 0.69%，Collagen IV 组高于前两组（P0.05）；三组中 CD45 阳性细 胞数分别达到 0.04% 0.005%、0.05% 0.01%、1.49 0.08%，Collagen IV 组高于前两组（P0.05）；三组中 CD34 和 CD45 双阳性的细胞比例分别为 0.08% 0.00

20、6%、1.16% 0.12%、7.8% 0.32%，Collagen IV 组显著高于前两组（P0.05）；而三组中 CD31 阳性以及 CD34和 CD31 双阳的细胞数占有的比例无显著的差异（图 3）。（3）实时定量 PCR 分析造血特120125130异性基因的表达：从图 4 可以看出，中胚层标志物 Brachyury、血液成血管细胞标志物 Flk1以及造血系统特异性转录因子 SCL 和基因 CD34 在人 ES 细胞中（即分化第 0 天）几乎不表 达，分化第 3 天时 Brachyury 的表达量达到最高值，后逐渐下降直至消失，三组之间未见显 著差异（图 4a）；三组 Flk 的表达在

21、分化第 7 天达高峰，三组的相对表达量分别为 25.74 3.65,27.83 2.41 和 63.03 7.99，且前两组显著低于 Collagen IV 组（P0.05），此后 Flk1 的表 达开始下调（图 4b）；随着诱导天数的增加，SCL 和 CD34 表达均呈上调趋势，分化第 14 天时 Collagen IV 组的相对表达量各为 37.5 7.57 和 82.63 10.01，明显高于其它两组，具 有显著的统计学意义（P0.05 和 P0.01）（图 4c，4d）。图 2 造血集落形成试验检测分化细胞的造血集落形成能力。(a)在不同胞外基质包被组形成造血各系集落的 数目；（*表示

22、 Collagen IV 组与其它两组相比较 P0.05，* 表示 Collagen IV 组与其它两组相比较 P0.01， n=3）(b)造血各系集落镜下的形态。Fig. 2 Differentiated cells were grown in methylcellulose media to assay for hematopoietic potential. (a) Colony forming cells coated on different extracellular matrix. (b) Colony forming unit (CFU), erythrocyte, granu

23、locyte, granulocyte/erythrocyte/monocyte/megakaryocyte (GEMM).135图 3 流式细胞术分析诱导 14 天时不同胞外基质包被组分化细胞表面特异性蛋白的表达。（*表示 CollagenIV 组与其它两组相比较 P0.05，* 表示 Collagen IV 组与其它两组相比较 P0.01，n=4）Fig. 3 Flow cytometric analysis of the proportion of differentiated cells expressing specific surface markers on different

24、extracellular matrix at day 14.140图 4 实时定量 PCR 分析不同胞外基质包被组在不同诱导天数时分化细胞中相关特异性基因的表达。(a)基因 Brachyury；(b)基因 Flk1；(c)基因 SCL；(d)基因 CD34。（以 -actin 为管家基因，数值以 s 表示，为相对于人 ES 细胞中的各基因表达量。 *表示 Collagen IV 组与其它两组相比较 P0.05，* 表示 CollagenIV 组与其它两组相比较 P0.01，n=4）Fig. 4 Time dependent expression of specific genes of di

25、fferentiated cells on different extracellular matrix byQ-PCR. (a) Gene Brachyury. (b) Gene Flk1. (c) Gene SCL. (d) Gene CD34.1451501551601653讨论定向诱导分化是人 ES 细胞研究的重要内容，将人 ES 细胞诱导为造血细胞常采用传统 的基质细胞共培养和拟胚体诱导法，但是这些方法繁琐，重复性查，获得的细胞数量有限； 而且分化体系中添加了成分不确定的胎牛血清，致使难以研究分化机制，也限制了其临床应 用。本实验采用人 ES 细胞直接贴壁分化的诱导策略既没有拟胚体复

26、杂的三维结构，也不存 在基质细胞或胎牛血清的动物源性污染，缩短与临床应用的距离，同样可以有效地产生造血 祖细胞，这一方法成功的关键是胞外基质的选择。研究表明细胞微环境对维持人 ES 细胞自 我更新以及细胞命运的决定极其重要，其中胞外基质是重要组成部分5。胞外基质不但为细 胞提供生长分化的支架，也提供维持细胞存活、迁移和命运决定的调控因子。胞外基质通常 是大分子糖蛋白，包括基质胶（Matrigel）、纤维粘连蛋白（Fibrobectin）、胶原蛋白（Collagen）、 层粘连蛋白（Laminnin）和蛋白多糖等。本实验采用人 ES 细胞接种至 Matrigel、纤维粘连 蛋白和 IV 型胶原蛋

27、白这三种胞外基质包被过的培养板上直接贴壁分化的诱导方法，产生的 CD34+造血祖细胞最高达到 15.06%，表达 CD45 的造血祖细胞可达 7.8%，与传统的基质细 胞共培养和拟胚体法的分化效率相似，但是这一诱导方法简单易操作，而且无血清、无基质 细胞的培养体系更接近于未来的临床应用。造血过程中多种生长因子发挥着重要作用，外源性添加生长因子在一定程度上能模拟体 内的造血微环境，促进造血发生。众多文献报道人 ES 细胞向造血细胞分化过程中需全程添 加细胞因子，包括 BMP4、bFGF、VEGF、SCF、Flt3L、IL-3 和 IL-6 等6, 7。既往研究表明 人 ES 细胞向造血细胞分化过

28、程中，只有 BMP4 能诱导产生对中胚层造血细胞发育必需的原 条样细胞群，启动造血中胚层基因表达和少量造血祖细胞的产生；BMP4、VEGF、SCF 和 bFGF 共同作用则诱导出高效的造血细胞8。近年有研究证实在人 ES 细胞向造血系分化过程170175180185中序贯加入不同的细胞因子更能有效地产生造血祖细胞9。本研究整个分化过程中细胞因子 分两步添加，第一步加入 BMP4、VEGF 和 bFGF，第二步加入 SCF、Flt3L、IL-3 和 IL-6， 诱导 14d 后对分化细胞进行鉴定，造血集落形成、流式细胞分析术以及实时定量 PCR 结果 均证实人 ES 细胞有效地分化为造血祖细胞。

29、本实验还比较了 Matrigel、纤维粘连蛋白和 IV 型胶原蛋白对产生造血细胞的不同作用。Matrigel 多用于人 ES 细胞无饲养层培养的培养皿处理10，也可用于人 ES 细胞的贴壁诱导 向造血细胞的分化11。纤维粘连蛋白和 IV 型胶原蛋白支持小鼠 ES 细胞来源的表达 Flk1 的 祖细胞向造血细胞分化12。纤维粘连蛋白能促进中胚层分化，诱导人 ES 细胞来源的内皮祖 细胞向内皮细胞分化13。IV 型胶原蛋白也能促进中胚层发育，诱导人 ES 细胞向内皮、心 血管和造血系的分化14，但具体的分化效率并未报道。本研究中造血集落形成实验显示这 三种胞外基质上培养诱导的细胞均具有造血干/组细

30、胞的造血集落形成能力，而且 IV 型胶原 蛋白上形成的造血 CFC 数目明显高于其它两组；流式细胞术分析显示 IV 型胶原蛋白组 CD34+和 CD34+CD45+细胞数量显著大于 Matrigel 组和纤维粘连蛋白组；实时定量 PCR 结果 显示 IV 型胶原蛋白组造血特异性基因 CD34 和 SCL 的相对表达量最高。由此证实采用人 ES 细胞直接贴壁的诱导方法选择 IV 型胶原蛋白更利于向造血细胞分化。4结论本研究建立了一种人胚胎干细胞在胞外基质上直接贴壁培养、有效地分化为造血祖细胞 的新诱导方法，为造血祖细胞的大量产生以及进一步分化产生其它功能性血细胞提供足够的 细胞来源，同时发现 I

31、V 型胶原蛋白利于人胚胎干细胞向造血细胞诱导，为胚胎干细胞的定 向诱导分化提供技术平台。参考文献 (References)1901952002052102151 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocystsJ. Science, 1998, 282(5391): 1145-1147.2 Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, et al. Hematopoietic colony-forming cel

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