【精品论文】慢性乙型肝炎患者肝组织中上皮间质转化.doc

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1、精品论文慢性乙型肝炎患者肝组织中上皮间质转化现象的研究刘峰1，武楠1，赵景民2，马慧1，饶慧瑛1，王烨1，魏来15（1. 北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，北京市丙型肝炎和肝病免疫治疗重点实验 室，北京 100044；2. 北京 302 医院病理科，北京 100039） 摘要：目的：研究慢性乙型肝炎患者肝组织内何种细胞发生上皮间质转化。方法：收集 54 例慢性乙型肝炎患者的肝组织标本，对其分别做细胞角蛋白 7（Cytokeratin 7，CK7）/S100A4，10CK7/-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，-SMA），E-钙粘素（E-cadherin）/

2、vimentin， E-钙粘素（E-cadherin）/-SMA 的检测，观察肝细胞、胆管细胞和肝干细胞（hepatic progenitor cells，HPCs）是否同时表达上皮细胞和纤维细胞表型。结果：患者肝组织中观察到汇管区周围的胆管反应细胞、小胆管和中胆管细胞共表达上皮细胞表型（CK7 和 E-cadherin）和间质细胞表型（S100A4），并且双阳细胞与肝纤维化分期有一定的相关性（p0.05）。E-cadherin15阳性的肝细胞、CK7 阳性的 HPCs 未发现表达间质细胞表型（S100A4）。-SMA 阳性的成 纤维细胞与 HPCs 和胆管反应邻近分布，未观察到 CK7/-S

3、MA 和 E-cadherin/-SMA 双染阳 性的细胞。结论：慢性乙型肝炎患者胆管反应细胞和胆管细胞可以同时表达上皮细胞和纤维 细胞表型，提示其可能向成纤维细胞转化。 关键词：上皮间质转化；慢性乙型肝炎；肝干细胞；肝细胞；胆管上皮细胞20中图分类号：R512.6+2The research of epithelial-mesenchymal transition inChronic hepatitis BLiu Feng1, Wu Nan1, Zhao Jingmin2, Ma Hui1, Rao Huiying1, Wang Ye1, Wei Lai125(1. Peking Unive

4、rsity Peoples Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing KeyLaboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044;2. Beijing 302 Hospital,Department of Pathology, Beijing 100039)Abstract: Objective To investigate whether EMT occurs and contributes to fibrogene

5、sis in chronic hepatitis B. Methods Liver tissue specimens from 54 cases of chronic hepatitis B were studied.30Liver sections were immunostained to detect antigens associated with epithelial cells (cytokeratin7, and E-cadherin), epithelialmesenchymal transition (S100A4), myofibroblasts (-smooth musc

6、le actin). Results In liver tissure, CK-7 and E-cadherin positive ductular reactions, small andmedium ductular epithelial cells showed clear expression of S100A4 at the portal area, indicating the transition from epithelial cells to mesenchymal cells. These double positive epithelial cells also35cor

7、related with fibrosis stage (p0.05). E-cadherin positive hepatocytes, CK7 positive hepatic progenitor cells (HPCs) had no expression of vimentin. Double staining of CK7/-SMA andE-cadherin/-SMA was not observed. Conclusions Co-expression of vimentin and CK7 in ductular reactions and epithelial cells

8、indicated the transition of these cells to mesenchymal cells. Keywords: Epithelial to mesenchymal transition; Chronic hepatitis B; Hepatic progenitor cells;40hepatocytes; Ductular epithelial cells0引言肝纤维化不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病共同的病理过程，是多种慢性肝脏疾基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20090001110088)；国家重点基础研究发展计划（2007CB512900）

9、；北京大学人民医院院内基金（RDK2008-06）；中国肝炎防治基金会王宝恩基金（20080030）作者简介：刘峰，（1975-），女，副研究员，主要研究方向：干细胞在肝病中的应用。通信联系人：魏来，（1961-），男，教授，主要研究方向：肝病研究。E-mail: - 7 -病发展至肝硬化的必经阶段。肝纤维化发生时，肝内肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）45和汇管区纤维细胞均参与肝纤维化的发生发展。近年来研究表明骨髓来源的 HSC 在肝纤维 化形成过程中发挥作用1,2。另外一种观点认为肝内成纤维细胞的一种可能来源为肝内上皮- 间质细胞转化(epithelial

10、 to mesenchymal transition，EMT)3-6。实验发现，成体肝细胞可在促 纤维化因子 TGF- 的诱导下发生 EMT7,8。在原发性胆汁性肝硬化患者肝移植后复发早期， 胆管上皮细胞即可表达 S100A4、波形蛋白（vimentin）等成纤维细胞表型9，Rygiel 等1050对小样本原发性胆汁性肝硬化（PBC）和酒精性肝硬化患者的研究也得出了相似结论。那么 在慢性乙型肝炎中，是否也有 EMT 现象存在尚无报道。故本研究拟观察不同纤维化分期的 慢性乙型肝炎患者肝组织中 EMT 想象。1材料和方法1.1一般资料55研究 2006 年 4 月至 2006 年 10 月在解放军

11、第 302 医院和北京大学人民医院进行肝穿刺 活检的慢性乙型肝炎患者。其中男性 44 例，女性 10 例，年龄 3-58 岁。所有病例均为乙型 肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性持续半年以上，抗-HCV（hepatitis C virus）和抗-HIV（human immunodeficiency virus）阴性，经病史及其他临床指标排除酒精 性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病及其他系统疾病所致肝损害。所有患者均未进行过抗60病毒治疗。对全部患者肝活检组织进行组织学活动指数（HAI）和纤维化程度评分11,12。3 例正常肝组织取自肝血管

12、瘤旁的肝组织。每例肝脏标本以 10%中性甲醛固定、石蜡包埋后 由病理科保存。Polymer 双染检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人细胞 角蛋白 7（Cytokeratin 7，CK7）、鼠抗人 E-钙粘素（E-cadherin）单抗购自 Dako 公司、兔 抗人 S100A4 多抗购自 Abcam 公司， 鼠抗人-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，65-SMA）购自 Leica 公司，Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠 IgG Fab 和 Alexa Fluor 568 山羊 抗兔 IgG Fab 二抗购自 Moleculat Pr

13、obe 公司。1.2免疫组织化学免疫组织化学双染法按照 Polymer 试剂盒说明书。标本连续切片厚 4m，经脱水、脱蜡、 抗原修复、过氧化氢灭活内源性酶，滴加 5BSA 封闭 10 min，倾去勿洗。滴加一抗 -SMA70(鼠 IgG，即用型)，4过夜，PBS 洗后，滴加辣根酶标记的羊抗鼠 IgG，37C 30min，PBS 洗， DAB 显色，镜下控制反应时间，染色后充分蒸馏水洗，PBS 洗，其后进行第二种染色。 滴加 5BSA 封闭室温 10 min 后，滴加第二种一抗 CK7 (鼠 IgG，即用型)，3730 min，PBS 洗 2rain3 次，再滴加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG，

14、37C 30rain，PBS 洗，AEC 显色，镜 下控制反应时间，充分水洗。苏木素轻度复染，流水清洗后滴加水溶性封片剂封固。DAB75显色呈棕黄色，AEC 显色呈红棕色。1.3免疫荧光双标记石蜡切片脱蜡至水；高温抗原修复，滴加 50L 10%山羊血清 37反应 30min，封闭非 特异性结合位点。甩去封闭液，滴加 50L 混合均匀的一抗 CK7 单克隆抗体（即用型）和 兔抗 S100A4 多克隆抗体（1:200），4湿盒中孵育过夜。次日取出切片，PBS 洗涤 5min380次。滴加 Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠和 Alexa Fluor 568 山羊抗兔二抗，37湿盒中孵

15、育 30min。PBS 洗涤 5min3 次，滴加 DAPI 封片剂封片，置于荧光共聚焦显微镜下观察染精品论文色情况并拍照。用 PBS 代替一抗作阴性对照。其它抗体（E-cadherin 和 S100A4）的检测方法同上。计数 CK7+/S100A4+细胞占 CK7+细胞数的比例。1.4统计学分析85连续正态分布变量以均数标准差（xs）表示，比较两组间差异采用 t 检验，判断相关 性采用 Pearsons 相关分析。对于非正态分布变量，比较组间差异采用非参数检验，判断相 关性采用 Spearmans 相关分析。采用 SPSS 12.0 进行统计学分析，p0.05 时差异有统计学意 义。2结果9

16、02.1患者的临床特征和组织学表现54 例患者年龄在 3-58 岁之间（平均 22.111.0 岁），其中 44 例（81.5%）为男性。各 纤维化分期病例数详见表 1。H&E 染色可见在纤维化 0 期，汇管区和小叶内炎症较轻，伴 随纤维化程度的增加，汇管炎、界面炎、小叶内炎症也呈加重趋势。正常对照肝组织无脂肪 变、炎症和纤维化表现。95表 1 54 例慢性乙型肝炎患者临床和病理特征Table1: Clinical and Pathologic Features of Patients with Chronic Hepatitis B参数 均数/病例数 病例总数，n54 年龄（岁）22.111

17、.0 性别-男性，n（%）44（81.5%） 纤维化分期，n（%）0 期 101-2 期 153-4 期 215-6 期 81001051102.2S100A4 在各期纤维化组织中的表达在正常肝组织中，S100A4 在胆管上皮细胞和肝细胞中不表达，在门脉成纤维细胞（portal fibroblast）和肝窦周围星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中有少量表达。在慢性乙型肝 炎肝组织中，随纤维化程度增加，S100A4 的表达也随之增加。尤其在 3-4 期肝纤维化组织 中，可见大量 S100A4 阳性的纤维细胞在汇管区聚集。此外，汇管区浸润的炎性细胞也可表 达 S100A

18、4。CK7 阳性细胞主要见于胆管上皮细胞、胆管反应细胞、中间型肝细胞和 HPCs。E-cadherin 阳性细胞主要见于肝细胞和胆管上皮样细胞。对慢性乙型肝炎肝组织分别做 CK7、E-cadherin 和 S100A4 双标记染色，发现不同纤维化分期的汇管区胆管反应细胞和成熟小、中胆管上皮 细胞可以同时表达 CK7、E-cadherin 和 S100A4（图 1，2 箭头所示）。而在 5-6 期的患者肝 组织中发现胆管反应细胞 S100A4/CK7 双染阳性细胞减少，同时中间型肝细胞在 5-6 期纤维 化患者中数量增多，可见较多的中间型肝细胞出现在双染阳性的胆管反应周围，并且多数 HPCs 和

19、胆管反应细胞与 S100A4 阳性的纤维细胞伴随分布。对 CK7 和 S100A4 双阳细胞的 数量进行分析，发现其与肝纤维化分期有一定的相关性（p0.05）（图 3）。在各期肝纤维 化患者中，未观察到表达 S100A4 的 HPCs 和肝细胞。115120125图 1：不同纤维化分期的慢性乙型肝炎患者肝组织中 CK7 和 S100A4 的表达。(a：正常肝组织；b：纤维化2 期肝组织；c：纤维化 4 期肝组织；d：纤维化 6 期肝组织；1：CK7，红色；2：S100A4，绿色；3：DAPI染核，蓝色荧光；4：1-3 的重叠图）Fig.1 The expression of CK7 and S

20、100A4 in different stages of fibrosis in chronic hepatitis B. (a: normal liver tissue; b: liver tissue from fibrosis stage 2; c: liver tissue from fibrosis stage 4; d: liver tissue from fibrosis stage 6;1: E-cadherin (red); 2: S100A4 (green); 3: nucleus (blue); 4: 1-3 overlap)图 2：慢性乙型肝炎患者肝组织中 E-cadh

21、erin 和 S100A4 的表达。（a：E-cadherin，红色荧光；b：S100A4， 绿色荧光；c：DAPI 染核，蓝色荧光；d：A-C 的重叠图）Fig.2 The expression of E-cadherin and S100A4 in different stages of fibrosis in chronic hepatitis B. (a: E-cadherin(red); b: S100A4 (green); c: nucleus (blue); d: a-c overlap)图 3：不同纤维化分期的慢性乙型肝炎患者肝组织中 CK7/S100A4 双阳性细胞数/CK+

22、单阳性细胞数Fig.3. CK7+/S100A4+ cells/ CK7+ cells in different stages of fibrosis in chronic hepatitis B1301351402.3-SMA 在各期纤维化组织中的表达在正常肝组织中，-SMA 在门脉成纤维细胞中有少量表达，在胆管上皮细胞、肝细胞、 和肝窦周围星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中不表达。在慢性乙型肝炎患者肝组织中， 星状细胞激活，转化为肌成纤维细胞表达 -SMA。对患者肝组织做 -SMA 与 CK7，E-caherin 的双标记染色。未发现胆管反应细胞及胆管上皮细胞

23、共同表达 -SMA 和 CK7（图 4）,但是 激活的星状细胞与 HPCs 和胆管反应伴随分布。也未发现 -SMA 和 E-caherein 双染阳性的 细胞。图 4：慢性乙型肝炎患者肝组织中 CK7 和 -SMA 的表达。（DAB：-SMA；AEC：CK7，400） Fig.4 The expression of CK7 and -SMA in liver tissue of patients from chronic hepatitis B. （DAB：-SMA； AEC：CK7，400）1453讨论最近研究表明，肝内胆管上皮细胞和肝细胞可以通过上皮- 间质转化（epithelial- m

24、esenchymal transition，EMT）参与肝纤维化形成3-9。EMT 是肝内上皮细胞的一种自我保 护机制，在致病因子作用下，肝内受损伤的上皮细胞如胆管上皮细胞和肝细胞不发生坏死， 而是表达间质细胞表型，并转化为间质细胞，以维持一定的细胞数量。该现象已经在原发性 胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）和酒精性肝硬化的研究得到证实8,9。并且， Sicklick 等13分离、培养动物卵圆细胞系和人 HPCs，两种细胞可以同时表达上皮细胞（如 CK、上皮细胞粘附分子等）和间质细胞表型（如 S100A4）。这些都提示在慢性乙型肝炎肝1501551601

25、65170175180185190组织内可能存在 EMT 的现象。我们对 54 例患者做纤维细胞和上皮细胞表型双标记染色，发现在不同纤维化分期的患 者肝组织的胆管上皮和胆管反应中细胞均有 S100A4 和 CK7 及 E-cadherin 共表达，其周围有 S100A4 阳性的纤维细胞包绕。提示肝组织中存在同时具有上皮和间质特征的细胞，即共表 达 S100A4 和 CK7 及 E-cadherin 的胆管反应细胞和胆管上皮细胞可能向纤维细胞转化的过渡 型细胞。在部分 0-2 期肝纤维化组织中，中间型肝细胞尚未出现，胆管反应细胞即可表达 S100A4， 同时可见胆管上皮细胞表达 S100A4，提

26、示在纤维化早期，胆管反应细胞和胆管细胞可能通 过 EMT 在纤维化进展中起作用。但是，在 5-6 期肝纤维化患者中，胆管反应细胞和 S100A4/CK7 双染阳性细胞减少，同时中间型肝细胞在 5-6 期纤维化患者中数量增多，可见 较多的中间型肝细胞出现在双染阳性的胆管反应周围。由此推测，在慢性乙型肝炎的纤维化 晚期，HPCs 以向肝细胞方向分化为主。另外，在慢性乙型肝炎肝组织中，-SMA 阳性的肌成纤维细胞与胆管反应邻近分布， 未发现 -SMA 和 CK7 双染阳性的胆管反应细胞、胆管细胞和肝细胞。提示在慢性乙型肝炎 患者中发生 EMT 的主要是胆管反应细胞或胆管细胞在向纤维细胞，先从胆管反应

27、或胆管中 迁移出来，然后其具有上皮特征的特征表达消失（如：CK7），同时具有间质细胞特征的表 达出现（如：-SMA）10。Taura等14在20l0年的Hepatology中公布了新的研究结果，使用三倍转基因小鼠作为指 示，GFP阳性的肝细胞不表达S100A4等间质细胞特有的标志物，认为在肝纤维化的过程中 肝细胞没有上皮-间质转化。该结论对既往肝纤维化中EMT的发生提出了质疑。Scholten等15 研究也认为在肝纤维化的过程中并不存在EMT，从而掀起了上皮-间质转化是否参与肝纤维 化的研究热潮16-18。我们的研究只是初步观察到肝纤维化组织中胆管反应细胞和胆管上皮共 表达上皮细胞和间质细胞的

28、表型，提示与EMT有关，今后不仅需要在更大样本量进一步验 证上述结论，更要从动物实验和体外实验上进一步验证，以便为肝纤维化发生发展机制的相 关研究补充理论基础。4结论我们研究初步表明，慢性乙型肝炎患者胆管反应细胞和胆管细胞可以同时表达上皮细胞 和纤维细胞表型，提示其可能向成纤维细胞转化。参考文献 (References)1 Forbes SJ, Russo FP, Rey V, Burra P, Rugge M, Wright NA, Alison MR. A significant proportion of myofibroblasts are of bone marrow origin

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