丁二酸产生菌的代谢及选育研究.doc

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1、http:/丁二酸产生菌的代谢及选育研究*李兴江，陈小举，姜绍通，潘丽军合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥 230009E-mail：摘 要：在矩阵分析代谢通量基础上，围绕柔性节点下的副产物乙酸及乙醇的降低分别实施 软 X 诱变及定点突变选育，并对比分析了突变株与出发株相关酶活及基因序列变化。针对出 发株的流量分析显示产物丁二酸的代谢通量为 1.78 mmolg-1h-1，主要副产物乙酸与乙醇 的代谢通量分别为 0.60 mmolg-1h-1 和 1.04 mmolg-1h-1,并发现乙醇代谢加剧了丁二酸 合成中的 H 电子供体的不足；筛选出的氟乙酸抗性突变株 S.JST1 的乙酸代谢通量降

2、低了96%，为 0.024 mmolg-1h-1,酶活检测表明磷酸乙酰转移酶（Pta）的酶比活力从 602 降低 到 74，进一步的序列对比分析发现 pta 突变基因中产生了一个突变位点；adh 定点复合突变 株 S.JST2 的乙醇代谢通量降低了 98%，为 0.020 mmolg-1h-1，酶活检测表明 Adh 的酶比 活力从 585 降低到 62,最终突变株 S.JST2 丁二酸累积产量达 65.7 g/L。 关键词：产丁二酸放线杆菌，代谢通量，选育，磷酸乙酰转移酶，乙醇脱氢酶中图分类号：Q92文献标识符：A1 引 言丁二酸广泛应用于化工、食品、医药、香料、染料、油漆、塑料和照相材料工业

3、，丁二 酸可以直接或间接合成 250 种以上的化工产品。目前丁二酸主要依赖石化原料制备，使其广 泛应用受到限制1。生物转化可再生原料生产丁二酸的方法倍受重视，以可再生淀粉糖和二 氧化碳作为主要原料，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的 新途径，使丁二酸成为未来最重要的生物基化工产品之一，其工业规模的微生物转化将成为 一个最具发展潜力的绿色工艺模式2。丁二酸作为三羧酸循环的中间体，也是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌累积产物3-5。产 生丁二酸的微生物包括丙酸产生菌、典型的胃肠菌、瘤胃菌等6-8。许多丁二酸产生菌是从 瘤胃中分离出来的,产丁二酸放线杆菌就是其中最重要的一种 9,

4、10。产丁二酸放线杆菌的代 谢过程中伴有大量副产物出现11,12，如何对菌株进行准确代谢分析并实施定向选育是产丁二 酸菌株的研究重点。笔者发现该类菌与大肠杆菌及厌氧螺菌相比较，它具有耐高糖及耐高丁 二酸盐的特点，尽管产生副产物，仍具有工业开发潜力。代谢流量分析是代谢工程研究的最重要的一种手段和方法13,14。在测定胞外物质变化的 基础上，通过细胞内各种生化反应的化学计量可以计算出胞内各物质的流量分配15-17，在代 谢分析基础上，通过比较由遗传或环境因素扰动而诱导的各代谢物流量分配变化，可以确定 整个代谢过程中具有特殊地位的途径或反应18,19，并对某些特定的途径实施传统诱变或分子 操作定向选

5、育，是开发工业微生物的一个重要手段20,21。而产丁二酸放线杆菌的主要分支途 径存在于丙酮酸及磷酸烯醇式的下游代谢，若能有效检测其下游代谢酶活及产物，则完全能 够有效理清其代谢通路并分析其代谢流量。Zeikus 等的最新研究11,12表明，该类菌株中的主要副产物为乙酸、甲酸、乙醇及乳酸， 并在一定程度上降低了副产物乙酸的代谢量。笔者进一步分析发现该类菌在 TCA 阻断了的 情况下，大量的乙酸产生必然伴随大量的丙酮酸脱羧产生 NADH，产生大量副产物乙酸是 由于细胞 NADH 不足所造成，因此即使诱变选育的突变株中该类副产物有效降低了，仍要-*本课题得到国家科技支撑计划项目（2007BAD34B

6、01）、国家 863 项目（项目编号：2007AA10Z361）、省自然基金（070411024）和校基金（073002F）的资助11进行其他工艺调控，如有效增加 HMP 途径流量或增加发酵气体中的 H2 含量，以弥补 H 供体不足。同时由于 1 分子的乙酰辅酶 A 生成转化为 1 分子的乙醇需净消耗 2 分子的 NADH， 因此副产物乙醇的生成更是加剧了细胞内还原力不足的矛盾，在不能获得有效的诱变选育 时，基因敲除或定点突变选育是必需的。本文在代谢途径及流量分布分析的基础上，围绕磷酸乙酰转移酶与乙醇脱氢酶的降低实 施了定向选育，突变株丁二酸产量获得了显著提高。2材料与方法2.1材料2.1.1

7、菌株牛瘤胃中分离获得，16S r RNA 鉴定(Accession No. EU074771）分析为产丁二酸放线杆 菌（Actinobacillus succinogenes S.JST），为本实验室保藏。2.1.2发酵培养基（g/L）玉米浆（CSL） 15, 酵母浸粉 10，NaH2PO42H2O 1.16，Na2HPO412H2O 0.7，NaCl1.0，MgCl26H2O 0.2，CaCl2 0.2，葡萄糖 80（分消），CaCO3 40，胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）5，PH 6.5。2.1.3培养条件37摇瓶厌氧发酵，厌氧混合气中的二氧化碳及氢气的浓度通过厌氧气室控制。2.1.4试剂和仪

8、器DNA 提取、回收及 PCR 反应试剂均购自大连宝生物工程；定点突变试剂及引物由普洛 麦格（北京）生物技术有限公司提供；高效毛细管电泳色谱（HPCE）采用美国 Beckman Coulter 公司 P/ACE MDQ 型毛细管电泳仪；气相采用安捷伦科技上海分析仪器有限公司色谱系统； 细胞破碎仪为 JY92-系统；厌氧培养系统为 CBJS-5B/1；软 X 射线装置为中国科技大学国 家同步辐射实验室提供。2.2产物检测2.2.1生物量测定恒重法。2.2.2残糖检测DNS 法222.2.3有机酸检测HPCE 检测，石英毛细管内径 75 m，外径 375 m，有效长度 50 cm,以 500 mm

9、ol/L H3PO4 及 0.5 mmol/L 溴化十六烷三甲基铵（CTAB，pH6.5，以 10 mol/L NaOH 调节）为运行电解 质，运行电压 9 kV，运行时间 20 min，柱温 20，检测波长 200 nm，压力进样（3.5 kPa5 s）。2.2.4乙醇检测采用 1790 气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器及 N 2000 色谱数据工作站，色谱柱采 用的是 DB-WAX 毛细管柱，柱长 30 m，内径 0.25 mm，液膜厚度 0.5 mm，色谱条件：N2 为载气，流速为 15 mL/min，进样器 240 ，柱温 220 ，检测温度 250 ，进样量 1 mL， 分流比 1

10、：100，外标法定量。2.3代谢途径酶活检测2.3.1细胞粗酶液制备37条件下，CO2 厌氧气室摇瓶培养 24 h，取 1 mL 发酵培养菌悬液 10000 r/min 离心 获得菌体，pH7.5，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液稀释至 10 mL，冰浴超声粉碎 10 min（超声 2 秒/间隔 5 秒），4下，10000 r/min 冷冻离心 15min，上清液即为原始粗酶液。2.3.2酶活测定（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（Pepck）测定：于对照比色皿中加入 3 mL pH7.5，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液，测定比色皿中加 2.3mL 缓冲液，之后依次加入 50 mmol/L Mn

11、Cl2 、0.5 mmol/L 碳酸氢钠、0.5 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸钠、50 mmol/L 的 ADP（腺嘌呤核苷二磷 酸）、5 mmol/L 还原辅酶（NADH）溶液各 0.1 m L，置于 25保温，而后分别快速加入0.1m L 的 500 U/mL 苹果酸脱氢酶纯酶液与适量粗酶液，启动反应；在 340 nm 处，3min 内 每 30s 以对照比色皿调零，记录测定比色皿吸光度值，计算一定时间内吸光度的降低值A； 在苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸（OAA）到苹果酸 (Mal)的反应中，G=-29.82 KJ/mol,反应 热力学决定了正向处于绝对优势，因此在苹果酸脱氢酶酶活过剩的情况

12、下，苹果酸脱氢酶转 化 OAA 生成 Mal 在速率上不存在限制，其速率远远高于 Pepck 的催化速率，所以 Pepck 固 定二氧化碳催化底物磷酸烯醇式丙酮酸转化 OAA 的速率可以间接用苹果酸脱氢酶 (Mdh) 催化 NADH 的速率代替。（2）丙酮酸羧化酶 (Pc)测定：测定比色皿中分别加入 2.2mL 缓冲 液，依次加入 1 mg/m L 生物素、50 mmol/L MgCl2、0.5 mol/L 碳酸氢钠、0.5 mol/L 丙酮酸 钠、50 mol/L 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、5 mmol/L NADH 溶液各 0.1 m L， 25 保温，之 后操作同 Pepck 的检测。

13、（3）Mdh 测定：测定比色皿中分别加入 2.7 mL 缓冲液，0.1 mL 50 mmol/L OAA，0.1 mL 5 mmol/L NADH 溶液后，25保温，其他操作同于 Pc 的检测。（4） 乙醇脱氢酶（Adh）测定：测定比色皿中分别加入 2.3 mL 缓冲液，0.5 mL 1%（v/v）乙醛溶 液（用缓冲液配制），0.1 mL 5 mmol/L NADH 溶液后，25保温，其他操作同于 Mdh 的检 测。（5）Pta 测定参考文献232.3.3酶活力计算酶活力单位计算在本方法相当于每分钟直接或间接消耗 1 mol NADH 量,计算式如下：U A V b t n 103酶的比活力为

14、每毫克酶蛋白所具有的酶活力，单位为 U/mg，计算式如下：specific activity UV C n= A b t C10 3其中A340 nm 处吸光度的变化值,无量纲；V酶促反应体积，指比色皿中酶液体积，为 3 mL；NADH 的表观摩尔消光系数，为 6.22103 Lmol-1cm-1；b比色皿的光程，为1 cm；t时间间隔，为 3 min；n稀释倍数，n=30000/x；x向反应比色皿内加入的粗 酶液体积，单位为 ul；C比色皿中酶蛋白质量浓度，单位为 mg/mL。2.4代谢过程及通量分析在菌株相关酶活分析及代谢产物精确检测条件下，结合产丁二酸放线杆菌的主代谢途 径，能够推测出其

15、代谢过程，并且利用拟稳态假设的方法，可以求出各个途径的代谢通量的。在代谢流计算过程中，各种产物参数的获得通过本文 1.2 介绍的方法，发酵时间统一取20-24h 的时间段进行代谢分析。细胞在 20 小时左右，其代谢产物的生成速度及细胞的生成 速度都比较稳定，而且这一部分时间内的平均值与细胞总体发酵的平均值比较接近，各个发 酵批次之间重现性很好，所以考察统一考察该时间段变量。参考文献11可知，这一类菌株同时具有 EMP 及 HMP 代谢途径的特点，同时结合生化 代谢基本原理可以列出表 1 中的序号 1 至序号 13 的生化反应。笔者通过对菌株的代谢产物 检测发现主要有丁二酸、乙酸、乙醇、乳酸、甲

16、酸、柠檬酸等，同时笔者分别检测到 Pepck、Pc、Mdh、Adh、Pta 等酶活，从而可以推导其丙酮酸及磷酸烯醇式丙酮酸的代谢支路，进而可以列出表 1 中的序号 14 至序号 27 的生化反应方程。表 1 中序号 28 的等式代表的是细 胞的生物质量合成12，由于同一个种的菌株在相似培养环境条件下，其细胞的生物组成应 一致的，因此细胞组成参考 Mariet J9与 McKinlay JB12的研究结论，单一化为 CH2O0.5N0.2 统一处理。表1 生化反应Table 1 Biochemical reactionsNo.Involved fluxMetabolic reactions1J1

17、PEP+Glc=G6P+Pyr2J2ATP+Glc=ADP+G6P3J3G6P=F6P4J4ATP+F6P=ADP+2*G3P5J5G3P+NAD+Pi+ADP=PEP+NADH+ATP+H2O+H+6J35G3P=3PG7J6ADP+PEP=ATP+Pyr8J24G6P+2*NADP+=2*NADPH+Ru5P+CO29J25Ru5P=Ro5P10J28Ru5P=X5P11J26Ro5P+X5P=S7P+G3P12J27S7P+G3P=F6P+E4P13J29X5P+E4P=F6P+G3P14J8CO2+ PEP+ADP=OAA+ATP15J7ATP+Pyr+HCO3-=ADP+Pi+OAA

18、16J9OAA+NADH+H+=Mal+NAD+17J10Mal=Fum+H2O18J11Fum+FADH2=FAD+Suc19J12Pyr+CoA+NAD+=AcCoA+CO2+NADH20J13AcCoA+H2O+OAA=Cit+CoA21J14Cit=Isoc22J18AcCoA+Pi=CoA+Ac-P23J19Ac-P+ADP=Ace+ATP24J20AcCoA+NADH+H+=AC.H.+CoA+NAD+25J21AC.H.+NADH+H+ =EtOH+NAD+，26J22Pyr+CoA= For+AcCoA27J23Pyr+NADH+H+=Lac+NAD+28JOther1.252

19、2*ATP+0.5270*NADPH+0.06989*NH3+0.05610*G6P +0.01724*F6P+ 0.083*Ro5P+ 0.02568*E4P+0.008852*G3P+0.1341*3PG+0.04667*PEP+0.1279*Pyr+0.1280*AcCoA+0.1043*OAA=1.0*Biomass+1.0547*ADP+0.5263*NADP+(其中:磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、丙酮酸(Pyr)、葡萄糖(Glc)、6-磷酸葡萄糖(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、1，6-二磷酸果糖(F-1，6-2P)、3-磷酸甘油醛(G3P)、3-磷酸甘油酸(3PG)、5-磷酸核

20、酮糖(Ru5P)、5-磷酸核糖(Ro5P)、5-磷酸木酮糖(X5P)、7-磷酸景天酮糖(S7P)、4-磷酸赤藓糖(E4P)、草酰乙酸(OAA)、苹果酸(Mal)、富马酸(Fum)、丁二酸(Suc)、辅酶 A(CoA)、乙酰辅酶 A(AcCoA)、柠檬酸(Cit)、异柠檬酸(Isoc)、乙酰磷酸(Ac-P)、乙酸(Ace)、乙醛(AC.H.)、乙醇(EtOH)、甲酸(For)、乳酸(Lac)、 -酮戊二酸( -Ket)详细的代谢通量方程及细胞组成分解等式见表 2，其中前 19 项是由笔者根据表 1 的生 化反应代谢平衡推导出的（27 个生化反应涉及到 8 个不同类型代谢流出口，所以可用于构 建代

21、谢方程的节点个数为 27-8=19 个）。第 20 项与第 21 项是笔者跟均 H 供体及 ATP 代谢平 衡分别列出的。第 22 项是笔者基于培养基中的葡萄糖消耗而列出的。第 23 项是笔者基于乙 醛酸循环很弱而列出的。第 24 项至第 36 项是根据表 1 中的细胞质量组成而分解并转化成的 物质的量等式12，其中 NH3 的代谢是将各种氨基酸的代谢折合成一种 NH3 的参与。第 37 项至第 45 项是笔者基于可测的代谢终端产物及生物量而列出的。总共 45 个方程，而需要求解的流量个数也是 45，所以可以将表 2 中的 45 个方程联立，利用 MATLAB 软件或 Excel中的数学函数对

22、原方程的逆矩阵进行求解得到各个代谢通量。表 2 代谢通量方程及其他条件方程 Table 2 Equations from metabolic flux balance and from other condition NO. Metabolic intermediate Equations from metabolic flux balance 1Glc1*J1+1*J2-1*J45 =02G6P1*J1+1*J2-1*J3-1*J24-1*J30=03F6P1*J3-0.5*J4+0.5*J27+0.5*J29-1*J31=04G3P1*J4-1*J5+0.5*J29-1*J34-1*J35

23、=053PG1*J35-1*J36=06PEP1*J5-1*J1-1*J6-1*J8-1*J37=07Ru5P1*J24-1*J25-1*J28=08Ro5P1*J25-0.5*J26-1*J32=09S7P1*J26-1*J27=010X5P1*J26-2*J28+1*J29=011E4P1*J27-1*J29-2*J33=012OAA1*J7+1*J8-1*J9-1*J13-1*J40=013Mal1*J9-1*J10+1*J17=014Fum1*J10-1*J11=015Glxt1*J16-1* J17 = 016Ac-P1*J18-1*J19 =017AC.H.1*J20-1*J21=

24、018Pyr1*J1+1*J6-1*J7-1*J12-1*J22-1*J23-1*J38=019AcCoA1*J12-1*J13-1*J18-1*J20+1*J22-1*J39=020H1*J5-1*J9-1*J11+1*J12-1*J20-1*J21-1*J23+2*J24-1*J42=021ATP1*J5-1*J2-0.5*J4+1*J6-1*J7+1*J8+1*J19-1*J41=022Glc( consumed in the broth)1*J45=（Glc）23GlycoxylatecycleFluxaresmall1*J17=024BiomassG6P1*J30-0.005349*

25、J44=025BiomassF6P1*J31-0.001644*J44=026BiomassRo5P1*J32-0.008948*J44=027BiomassE4P1*J33-0.003184*J44=028BiomassG3P1*J34-0.001291*J44=029Biomass3PG1*J36-0.01788*J44=030BiomassPEP1*J37-0.006889*J44=031BiomassPyr1*J38-0.03604*J44=032BiomassAcCoA1*J39-0.004139*J44=033BiomassOAA1*J40-0.01959*J44=034Bioma

26、ssATP1*J41-0.06125*J44=035BiomassNADPH1*J42-0.01754*J44=036BiomassNH31*J43-0.1020*J44=037Suc1*J11 = （ Suc）38Cit1*J13-1*J14=（Cit）39Isoc1*J14 -1* J15-1* J16= （Isoc）40-Ket1*J15 = （-Ket）41Ace1*J19 = （Ace）42EtOH1*J21 = (EtOH)43For1*J22 = (For)44Lac1*J23 = (Lac) 45 Biomass 1*J44=(Biomass) 2.5Pta 酶活降低定向选育2

27、.5.1软 X 射线诱变条件的确立无菌制备 107 个/mL 菌悬液，取L 均匀涂于直径为mm 的纤维素膜片上，再将膜片装于样品架，然后放入同步辐射软 X 射线线路的真空舱。利用真空抽机将真空舱抽至1.610-3Pa，用同步辐射软 X 射线对样品进行辐射 3min，软 X 射线 NK 边对放线杆菌的致 死率为 70%-80%，将辐射后的膜片放入无菌小管内，加 1mL 生理盐水，充分振荡，进行下 步筛选或保存于冰箱待用。2.5.2Pta 途径缺陷型菌株的筛选23,24将诱变后的细胞涂布于含有高浓度氟乙酸的的平板上，筛选获得的那些氟乙酸抗性突变 株的 PTA 酶活极可能大大降低，从而副产物乙酸的流

28、量得到有效降低。2.5.3pta 基因突变前后对比分析对磷酸乙酰转移酶活力降低的阳性突变株进行 PTA 基因克隆分析，原始株及突变株克 隆引物相同，F1：5-ATGTCTCGTACATTTATTCT-3，F2：5-TTAAGCTTGCGTAGCCTGAA-3。PCR 反应： 25 L PCR 反应基本体系中，10Buffer 为 2.5 L，dNTP (2.5 m)为 2 L，F1(20 pmol)为 1 L，F2(20 pmol)为 1 L，Taq 为 0.2 L， 模板 DNA 为 1 L，用水补足到 25 L。PCR 反应条件为：94 5 min；94 40 s，55 40 s，72 1

29、40 s，35 个循环；72 10 min。PCR 产物回收、连接、转化、测序及分析：使 用试剂盒纯化 DNA；取 1 L 回收的 PCR 产物，按照 pMD18T 载体试剂盒说明书，16 连 接 1 小时以上；取连接混合物 3.5 L 加到 200 L 感受态细胞液中，冰浴 30 min 后热击转化； 再对阳性克隆株进行 PCR 鉴定；序列测定由大连宝生物工程公司完成。2.6adh 定点突变选育2.6.1adh 基因克隆ADH克 隆 引 物 为H1 ： 5-ATGAAACTCGAAACCCTTTC-3 ， H2 ：5-TTATTCGAATCTGAGTTGGA-3, PCR 反应、产物回收、连

30、接、转化、测序操作同 1.5.4。2.6.2胞外定点突变将所获得的 ADH 基因片段进行定点突变，设置 2 个突变点，一个在基因片段 79 位， 一个在基因片段 973 位，突变后均为 TAA 三联终止密码子，其中 79 位的突变引物为： Forward:5-CACAACACCTTGATTATGATTAAAACAGTCAGGAACAAACC-3 ， Reverse:5GGTTTGTTCCT GACTGTTTTAATCATAATCAAGGTGTTGTG-3，973 位的突变 引物为：Forward:5-GTTTTCGATTTCCGGTAACTTGAAGACGCG-3，Reverse: 5-CGC

31、GTC TTCAAGTTACCGGAA ATCGAAAAC-3，突变过程由普洛麦格（北京）生物技术公司完成。2.6.3导入胞内重组定点突变基因片段用低复制载体 pLG338 连接，之后电穿孔（取 50 L 放线杆菌与质粒 DNA 混合，电极槽采用 25 mF、2.5 Kv、200 电场处理 4 ms）导入放线杆菌细胞内，由于 载体携带 adh 突变片段与染色体 adh 片段具有高度同源性，易发生同源重组。2.6.4阳性重组体筛选利用载体 pLG338 抗药性筛选重组细胞，突变前菌株的 Adh 酶活很强，与丙烯醇结合 后产生对细胞有致死效应的丙烯醛，一旦重组细胞内载体所带的突变 adh 片段与染

32、色体上的 高度同源的 adh 片段发生交换、对接等重组，则 Adh 酶活就可能会迅速降低，从而利用平 板内添加丙烯醇能够进一步筛出阳性重组细胞。2.6.5重组细胞 adh 基因测序所用引物及相关操作与 2.6.1 相同，确认所获菌株的 adh 基因突变情况。3结 果3.1代谢通量分析所得代谢过程及通量数据见图 1。(Glc)J45=2.00/2.20/1.74GlcJ1=0.095/0.10/0.083J2=1.90/2.10/1.66J3 0 = 0 . 0 0 7/0 . 0 0 7/0 . 0 0 7G6PJJ 3=1.97/1.21/0.60J24= 0. 0 2 4/0 . 9 9

33、/1 . 1 3JJ2 5 = 0 . 0 23 1 = 0 . 0 0 2/0 . 0 0 2/0 . 0 0 2J36 =0.024/0.024/0.024 3PGJ4=3.94/3.70/2.69J 2 7=0.01/0.65/0.75F6PS7P26=0.01/0.654/0.75/0.34/0.39Ro5PJ32=0.012/0.012/0.012Ru5PJ34 =0.002/0.002/0.002J35=0.024/0.024/0.024G3PE4PG3PJ29=0.002/0.64/0.74J2 8 = 0 . 0 0 7/0 . 6 5/0 . 7 4X5PJ5 = 3 . 9

34、 2/4 . 0 0 /3 . 0 3J8 = 1 . 9 0 /2 . 2 6/2 . 5 6J1=0.095/0.10/0.083J7 = 0 . 0 9 5/0 . 1 1/0 . 1 3PEP PyrJ6 = 1 . 9 2/1 . 6 2/0 . 3 8J3 3=0.004/0.004/0.004J37 =0.01/0.01/0.01J3 8=0.05/0.05/0.05J40=0.03J12=1.74/1.36/0.063JCoAJ23=0.039/0.03/0.03J9 = 1 . 7 8OAAJ17= 0 /0 /0AcCoA22= 0. 0 8 7/0 . 0 7 2/0 .

35、 0 9 1J39=0.006/0.006/0.006/0.13/0.13/2.27/2.58J16=0/0/0J13=0.18/0 . 0 8 2/0 . 0 8 2J18=0.60/0.024/0.046JJ22= 0. 0 8 7/0 . 072/0.091 Mal(Cit)Ac-P20=1.04/1.32/0.02J10=1.78/2.27/2.58GlxtJ14=0.046/0.022/0.019J19=0.60AC.H.J11 =1.78/2.27/2.58Fum(Isoc)J15= 0 /0 /0/0.024/0.046J21 =1.04/1.32/0.02(Suc)(-Ket)

36、(Ace) (EtOH)(For)(Lac)biomass(biomass)J44 =1.34/1.34/1.34NH3J43=0.14/0.14/0.14J42=0.02NADPH /0.02/0.02ATPJ41= 0.08/0.08/0.08图 1 代谢网络中的通量分布Fig.1 Flux distribution in the metabolic networks（ N o t e : F l u x u n i t m m o l g - 1 h - 1 , L e f t f l u x f r o m p a r e n t s t r a i n , Middle flux f

37、rom mutant strainS.JST1, Right flux from mutant strain S.JST2）通过图 1 出发菌株的代谢通量结果可以发现，流量分析显示产物丁二酸的流量速率为1.78mmolg-1h-1，丙酮酸及乙酰辅酶 A 下游的代谢通量绝大部分被乙酸及乙醇分流，主要副 产物乙酸与乙醇的流量速率分别为 0.60 mmolg -1h-1 和 1.04 mmolg -1h-1,大量乙酸及乙醇的 代谢增加了乙酰辅酶 A 的流量，这必然导致丙酮酸通向丁二酸的代谢流的降低，尤其是乙醇的代谢更是加剧了细胞内部的 H 电子供体的不足，毕竟由草酰乙酸到苹果酸以及由富马酸到丁二酸各

38、自分别净消耗一个 NADH，因此菌株的进一步选育应围绕乙酰辅酶 A 下游副 产物乙酸及乙醇的代谢流降降低实施。3.2Pta 酶活缺陷株的筛选3.2.1诱变筛选将出发菌株制备菌悬液，采用软 X 射线同步辐射 NK 边对菌体进行辐照，进行抗氟乙 酸平板筛选获得 6 株突变株，其中 S.JST1 菌株的初步发酵显示丁二酸代谢流量明显增加， 副产物乙酸代谢流量明显降低，丁二酸代谢通量由 1.78 mmolg-1h-1 升为 2.27 mmolg-1h-1 流 量结果见图 1。3.2.2突变株的代谢及酶活分析 对突变株的进一步代谢流量分析表明，在整体代谢框架不变的情况下，终端产物产率显示丁二酸产量由 4

39、7.3 gL-1 增至 56.2 gL-1，产物产量结果见图2-A， Pta 酶活大幅降低，与出 发株的酶比活力比较见图 2-B。60 50403020100Parent strainStrain S.JST11200Specific activity/Umg-11000 8006004002000Suc Ace EtOH Cit Isoc For Lac CellEnd product s图 2-A 突变株与出发株的终端产物比较Fi g.2-A Th e com pari s on of th e e n d produ cts of m u tan t s trai n s .s jt1

40、wi th th at of pare n t s trai n3.2.3突变株的 pta 克隆分析Pepck Pc Mdh Adh PtaEnzyme图 2-B 突变株与出发株的酶比活力比较Fi g.2-B Th e com pari s on of th e e n z ym e acti vi ty of m u tan t s trai n s .js t1 wi th th at of pare n t s trai nYield/gL-1对出发株 pta 基因分析表明（Accession No.EU256480），该基因有 2142 个碱基序列，属 于磷转酶系列的乙酰磷酸转移酶；将

41、该基因序列在数据库中进行同源性搜索后，发现本基因 片段的最高同源性片段是 Actinobacillus succinogenes 130Z 菌株内的 pta 基因序列（Accession No.CP000746：1823344-1825485），其同源性超过 99%，这也表明产丁二酸放线杆菌这一类 细菌中广泛表达磷转乙酰酶，若想提高该类菌株的丁二酸产量，对 Pta 途径实事选育是必需 的。对突变株的 pta 基因分析结果表明（Accession No.EU284747）：突变株 pta 基因序列第259 位的 T 被突变为 G，相应编码氨基酸第 87 位的亮氨酸被突变为缬氨酸，序列第 1480

42、 位 的 G 被突变为 T，相应编码氨基酸第 494 位的缬氨酸被突变为亮氨酸，而生物信息学分析 表明这两个位置都处于 pta 基因酶活性位点的保守区域，可能这些突变造成了其酶活的直接 降低。3.3adh 定点突变选育3.3.1adh 克隆分析对 adh 基因片段克隆测序（Accession No.EU256479）分析，该基因有 1044 个碱基序列， 同源性搜索结果表明，该基因是在革兰氏阴性厌氧细菌中最广泛存在的锌离子激活型乙醇脱 氢酶，普遍表现酶活较高，其高达 99.5%同源性的片段是 ATCC55618 菌株内的 adh 基因序列（GI:150840531），在掌握该酶基因序列的基础上

43、进行定点突变是可行的。3.3.2adh 基因胞外定点突变及胞内重组针对所得的 adh 序列涉及两个突变点一个是靠前的 79 位的 G 突变为 T，一个是靠后的973 位的 C 突变为 T，突变引物见 1.6.2，将突变了的 ADH 基因片段克隆入低拷贝载体 pLG338，此时载体 DNA 作为破坏载体用于转化，采用电穿孔法将带有突变 adh 片段的载体 pLG338 导入放线杆菌突变株 S.JST1 细胞内，由于该片段与染色体上的 ADH 片段高度同源， 因此容易发生同源性重组。3.3.3阳性重组细胞的筛选及鉴定利用 pLG338 质粒载体所具有的 Amp 抗性筛选阳性转化子，并通过丙烯醛的致

44、毒效应 从阳性转化子中筛选 adh 突变株，其中突变株 S.JST2 的生长特征及发酵特性优良。于是对 其 adh 基因克隆测序（Accession No.EU284746），结果表明破坏载体携带的突变 adh 片段与 放线杆菌染色体的 adh 片段只是进行了部分交换重组，因为序列对比表明该基因片段只有一 个突变点，但由于突变位点开始设计的就是终止密码子，因此一个突变点足以让该基因酶活 丧失。3.3.4酶活与流量对比分析对重组复合突变株 S.JST2 的进一步代谢流量分析表明，在整体代谢框架不变的情况下， 产物产量结果见图3-A，终端产物产率显示丁二酸产量增至65.7 gL-1。流量结果见图 1。丁二酸代 谢通量升为