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1、乙型肝炎病毒耐药基因研究进展4现代检验医学杂志第26卷第3期2011年5月JModLabMed,Vo1.26,No.3,May.2011summaryofthethirdreportoftheNationalCholesterolEducationProgram(NCEP)expertpanelondetection,evaluation,andtreatmentofhighbloodcholesterolinadults(adulttreatmentpanelIII)D.JAMA,2001,285(19):24862497.7陈文祥,王抒,董军,等.高效液相色谱测定血清甘油三酯的研究一一种参
2、考方法的建议J.中华检验医学杂志,2000,23(2);8790.8E93中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南D.中华心血管病杂志,2007,35(5):390-419.GrundySM,CleemanJI,MerzCN,eta1.ImplicationsofrecentclinicaltrialsfortheNationalCholesterolEducationProgramAdultTreatmentPanelIIIguidelinesJ.Circulation,2004,110(2):227239.收稿日期:20110506修回日期:20110510乙型肝炎
3、病毒耐药基因研究进展何超,张朝霞(新疆医科大学第一附属医院医学检验中心,乌鲁木齐830011)摘要:核苷(酸)类似物抗病毒药物的开发和应用,为慢性乙型肝炎(CHB)的治疗带来了极大的帮助.然而在临床治疗的过程中,乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异地产生增加了治疗失败的风险.近年来,在全球范围内对HBV耐药变异毒株的研究正在大规模的进行.该文将围绕HBV耐药基因的特点,HBV基因分型与耐药,检测耐药基因的技术和方法等方面的研究进展进行综述.关键词:乙型肝炎病毒;基因型;耐药;天门冬氨酸基因;自然变异中图分类号:R512.62;Q786文献标志码:A文章编号:16717414(2011)0300404
4、doi:10.3969/j.issn.16717414.2011.03.002ProgressinHepatitisBVirusResistanceGeneHEChao,gHANGZhaoxia(Med口InspectionCenter,AffiliatedFirstHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)Abstract:Thedevelopmentandapplicationofnucleoside(acid)analogueantiviraldrughadbroughtagreathelpforthechroniche
5、patitisB(CHB)treatment.However,inthecourseofclinicaltreatment,hepatitisBvirus(HBV)drugresistancemutationsproduceincreasedriskoftreatmentfailure.Inrecentyears,theglobalvariationoftheHBVstrainsresistantlargescaleresearchwasbeingcarriedout.Thisarticlewillfocusontheresearchprogressofthecharacteristicsof
6、HBVdrugresistancegene,HBVgenotypinganddrugresistance,resistancegenedetectiontechniquesandmethods.Keywords:hepatitisBvirus;genotype;resistance;YMDDgene;spontaneousmutation乙型肝炎病毒(HBV)是一种呈世界性分布,危害严重的传染病1.全球约有20亿人曾感染HBV,其中约3.54亿人为慢性HBV感染,约占全球人口的6L2.HBV是一种带有部分单链区的双链环状DNA病毒,其基因组仅含3200bp,它通过逆转录在肝细胞中进行复制.HB
7、V一般不会直接引起肝脏的病变,而是通过机体的免疫机制,对HBV表达产物引起应答,导致肝脏损害.由于HBV持续地复制,刺激机体产生持续的免疫反应,从而造成更多的肝细胞破坏,引起肝脏疾病的产生对于慢性乙型肝炎(CHB),目前普遍采用干扰索和核苷(酸)类似物进行抗病毒治疗,进而改善肝脏组织学病变,延缓乙型肝炎病情进展.自2000年起陆续有四种核苷(酸)类似物上市,分别是:拉米夫定(LMV),阿德福韦酯(ADV),恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LDT),它们各有优点,但共同的问题是,在长期治疗的过程中HBV均会对它们发生耐药变异,并引发临床耐药等严重后果5.类似物主要作用于HBVDNAcccDNA的复
8、制期,抑制前基因组RNA逆转录为HBVDNA的负链及正链的合成日.由于不能直接作用于感染细胞的病毒cccDNA,所以需要长期用药来控制病毒复制.近年来,随着医疗技术的不断提高,人们从基因水平上对HBV耐药性进行研究,并取得了显着的成果.笔者将从以下几个方面介绍目前国内夕乙型肝炎耐药基因研究的新进展.1HBV基因分型与耐药HBV可分为AH基因型.HBV基因型分布呈地域性差异且与肝脏病变程度以及药物治疗效果存在一定的相关性.我国HBV基因型以B,C,D型为主,存在南北和民族差异.南方以B型为主,北方以C型多见.我国东北的黑龙江省就以C型为主要的基因型【g.汉族以B,C为主,D型少见.少数民族可见一
9、定比例的A,D型.不同基因型的HBV对核苷(酸)类似物的反应性不同,发生耐药的毒株中以B型和C型最为多见.张智等】对185例广东人慢性乙型肝炎患者进行基因分型检测和拉米夫定,阿德福韦酯耐药基因检测,185例CHB中162例对拉米夫定敏感,21例对拉米夫定耐药;185例患作者简介:何超(1982一),男,在读硕士研究生,Tel:18999297705,Email:heehao520520sina.corn.通讯作者:张朝霞,女,教授,硕士生导师,Tel:13999139616,Email:xia0513yahoo.corn.en现代检验医学杂志第26卷第3期2011年5月JModLabMed,V
10、o1.26,No.3,May.20115者均对阿德福韦酯敏感,未检测出耐药基因型.21例对拉米夫定耐药的突变基因型中,均为B和C基因型出现耐药,B,C混合型与其他型未见耐药.突变基因以rtL180M为主,且多见于C基因型.ZhouDongyao等【|对广州铁路中心医院的53例慢性乙型肝炎患者进行基因分型及耐药基因检测,53例CHB患者中有13例对拉米夫定产生耐药性,其中B型1例,C型8例,D型4例.两篇报道的结论基本一致.然而在国外则报道为D基因型多见,有学者认为D基因型在世界上分布最为广泛,D基因型更多是集中于中东地区,如土耳其,埃及,海湾地区.有研究表明HBV的D基因型约占沙特阿拉伯的81
11、%85,而在埃及几乎所有的HBV均为D基因型1.HaniAMasaadeh等【.对约旦107例慢性乙型肝炎患者进行HBV基因分型及耐药基因研究,得出了D基因型几乎是唯一在约旦流行的基因型,并且D基因型耐药发生率较其他基因型低的结论,这和我国学者报道基本一致.2四种临床常用核苷(酸)类似物治疗HBV时的常见耐药变异2.1拉米夫定(LMV)LMV是第一个被批准抗乙型肝炎病毒的核苷类似物,为胞苷类似物.LMV在控制病情进展,改善预后等方面效果明确L】.然而,LMV并不能消除HBV,也不能阻止其复发】.LMV长期治疗所致的HBV耐药变异发生率高.LiawYFL】报道同一批拉米夫定治疗的慢性乙肝患者,用
12、药时间分别是1,2,3,4和5年,其拉米夫定耐药率为】4,38,49,66和69.最常见的是HBVDNA聚合酶P区(rt区)的M2O4I/V变异L2.张淑云等2对14例口服LMV100mg/d的CHB患者进行YMDD基因变异检测,在142例CHB患者中有8O例发生rtM204I/V变异,占56.3;在rtM204I/V变异中,38例发生rtM204I变异,占47.5;24例发生rtM204V变异,占3O;18例发生rtM204I/V混合变异,占22.5%.还有研究22表明我国HBV经LMV长期治疗后发生变异者C基因型rtM2041变异要较B基因型发生率高,同时B基因型rtM204V变异要较C基
13、因型发生率高.LMV主要的变异方式有:rtM2041,rtM180M+rtM204V,rtL18OM斗-rtM204I,rtV173L十rtL18OM+rtM204V.赵卫峰等Lz.对109例口服LMV10个月后出现病毒学突破的CHB患者进行HBVRT区变异分析,在109例患者中,出现rtM204V/I变异的93例(85.3),rtL180M变异51例(46.7),rtV173L/M变异7例(6.4%),rtV2O7M/L/I变异4例(3.7),rtA181T变异4例(3.7),rtT184I/S/M变异2例(1.8),rMt250L变异2例(1.8).13例患者HBVDNA序列未发现LAM耐
14、药相关性变异.他们在对这109例患者HBV的RT区序列的进一步分析中发现,除了常见的rtM2O4I/V,rtL180M,rtV173M/L,rtV207M/I变异外,还发现了其他一些rt区新的氨基酸替代,如rtF221Y,rtS213,rtL229V等.Daniel等2通过表型耐药研究表明,这些新的氨基酸替代HBV毒株对核苷/核苷酸类似物敏感性没有下降.2.2阿德福韦酯(ADV)ADV是腺嘌呤磷酸酯类化合物,是新一代抗乙型肝炎病毒药,ADV在体内外均能有效拮抗HBV,有显着的抗病毒作用.ADV耐药发生率低且较LMV晚,ADV耐药相关典型变异如下:()nt670位点由鸟瞟呤(G)突变为腺嘌呤(A
15、),使编码的rtl81位点的氨基酸由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T);nt671位点由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T),使编码的rtl81位点的氨基酸由丙氨酸(A)变为缬氨酸(V),nt836位点由腺瞟呤(A)突变为胞嘧啶(C),使编码的rt236位点的氨基酸由门冬酰胺(N)变为苏氨酸(T).即HBV聚合酶P区的rtA181T/V和rtN236T,其中rtN236T的变异较常见.2.3思替卡韦(ETV)ETV为环戊酰鸟苷类似物,是继LMV后第二个获准上市并被广泛用于治疗CHB的核苷(酸)类似物,对于初治患者或LMV治疗失效患者均具有显着的抗HBV作用.但是,核苷(酸)类似物治疗CHB所面临的最大临
16、床挑战就是耐药性的产生,ETV也不例外.ETV的变异位点在HBV聚合酶P区的rtT184G,rtS202I或rMt25OV,其耐药的机制可能是限制了ETV与HBV多聚酶的结合.但单独上述位点的变异并不引起耐药的发生,只有在rtM204V加rtL180M变异的基础上,出现上述一个或多个位点变异,才导致耐药发生,即ETV的耐药基因屏障较高口.HBV对ETV产生耐药需要3个位点联合突变,LMV耐药相关位点的突变是发生ETV相关位点突变的必要条件.王程等2对41例接受口服ETV(1.omg/d,治疗疗程>12mon,基线HBVDNA10coppies/m1)治疗,且LMV失败的41例CHB患者进
17、行临床随访.41例患者中只发现1例ETV耐药,该例患者的基线血清中可以检测到LMV耐药毒株(rtL180M+rtM204V),在治疗12个月后检测到ETV耐药毒株(rtL18OM+rtM204V+rtS202G).2.4替比夫定(LdT)LdT是最新上市的核苷类抗病毒药物,属于左旋核苷类似物,具有较LMV更强的抑制HBV的活性l2,且耐药发生率低,治疗1年时仅5出现变异.蔡伟等Lz收集美国Idenix公司开展的多中心药物临床试验瑞金医院分中心所选择的CHB患者22例,采用LdT治疗52w后评价其疗效,发现22例CHB患者中只有2例发生变异,变异率为9.LMV和LdT的耐药位点相同,95以上对L
18、MV和LdT耐药的突变位点都发生在rtM204V/I,一小部分患者的耐药突变发生在rtA181T/V位点.3HBV耐药变异和结构定位HBV对某种药物的耐药性一般是指这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用,依据判断的方法不同,有三种类型:HBV基因型耐药,指HBV基因组中的某些位点发生改变,导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失;HBV表型耐药,体外细胞培养方法,直接测定某种药物对HBV的抑制作用,即表型耐药,通常以抑制病毒复制率达5O以上所需的药物浓度(ICS0)来评估其敏感性;临床耐药指临床出现病毒复制不能被抑制,或抑制后又出现HBVDNA反跳,同时并伴有ALT升高.在HBV基因型耐药中,
19、HBV变异与HBV的耐药性有直接关系,通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性.所以,人们探讨了核苷类似物易诱导HBV发生变异位点的结构域.研究表明,HBV耐药的产生和其聚合酶基6现代检验医学杂志第26卷第3期2011年5月JM0dLabMed,Vo1.26,No.3,May.2011因(P01)变异有关.由于HBVPol是一种逆转录酶,缺乏校正的功能,因此,HBV变异率比其他DNA病毒大约要高1O倍,发生一5变异的频率为(1.43.2)X10核苷酸替换/位点/年.Pol基因是HBV负链最长的开放阅读框,横跨了整个基因组的8O.Pol蛋白翻译起自HBV前基因组RNA,其产物为816个氨基酸
20、的多功能蛋白,包含4个区域.氨基端为末端蛋白(TP),它可与HBV负链的5端共价结合,引导HBV负链的合成.紧邻TP的是间隔区,尚未发现此区有特殊的功能.多功能蛋白的羧基端为RNA酶H,它可裂解逆转录过程中形成的RNADNA杂交体中的RNA.介于间隔区和RNA酶H之问的Pol/RT区,其性质为RNA和DNA依赖的DNA聚合酶,催化HBV的逆转录和DNA链的合成.HBVDNA聚合酶基因可分为A到E5个活性部位,A,C,D区为三磷酸核苷结合和催化位点,而B,E区可能参与RNA模板和启动子定位,C区为酶催化的活性部位,YMDD基序位于其中,其中M204I/V的突变可以对拉米夫定形成大于1000倍的耐
21、药l3.阿德福韦酯引起D区N236T的突变,对阿德福韦酯形成51o倍的耐药.4YMDD基因自然变异CHB患者使用LMV治疗后出现耐药与HBV毒株的rtM204I/V变异相关.已有研究表明,在未经LMV治疗的HBV感染者体内也可检出rtM2O4I/V变异毒株,称为自然变异毒株L3.自然变异毒株对LMV天然耐药,为临床治疗带来极大的困难.赵卫峰等a将120例CHB患者按测序时机分为3组:I组未服用核苷(酸)类似物,25例;组LMV持续治疗过程中病毒学突破后测序,74例;组LVD病毒学部分应答时测序,21例.I组和I组患者给予LMVlO0mg/d,口服治疗.疗程l3年,平均疗程1年半.I组25例患者
22、中,自然发生变异的2例(8.0A),其中1例为rtM204V+rtL180M变异,另l例为rtL180M变异并与野生型毒株并存;I组74例患者中,67例(90.5)出现变异;I组21例患者中,无变异将三组实验结果进行统计学处理,P<0.0001,三组实验结果差异有统计学意义.且YMDD自然变异率为8(2/25).而霍红等31j从183例CHB患者中检出4O例自然变异,其自然变异率为21.86%,与其他学者报道的1O%3O%基本一致.患者的性别,年龄等对YMDD自然变异检出率无影响,但B基因型CHB患者较C基因型者更易检出自然变异.5乙型肝炎病毒耐药变异的检测与分析【3.5.1常用基因型耐
23、药检测技术5.1.1PCR产物直接测序(directPCRsequencing):是将HBV基因组的逆转录酶区进行扩增后直接进行测序分析的方法.PCR产物直接测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点,是最常用的基因型耐药检测方法之一.该方法的缺点是灵敏度较差,只有当变异株超过HBV准种池的2O时才能被发现.5.1.2聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCRRFLP):该方法具有较强的灵敏性,可检测数量占HBV准种池5的耐药变异株,只能检测已知,单一位点的变异,对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便,快速且廉价的方法.但随着多种核苷(酸)类似物的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现,该方法将
24、难以胜任多位点变异的检测.5.1.3反向杂交法(reversehybridizationassay):基于该技术的INNOLiPA方法在国外已获准应用于临床检测,目前INNOLiPAHBVDRv3可检测包括LAM,ADV,ETV与LdT常见位点耐药位点.该法可检测变异株占HBV准种池51O的样品,故敏感度较好,但其同样只能检测已知位点变异,另外该检测价格昂贵,国内尚难广泛应用于临床检测.5.1.4实时PCR(realtimePCR):该方法操作简便,可检测变异发生率低于10的耐药变异.缺点为仅能检测已知位点,同时针对每个位点的不同变异均需合成相应的探针.随着核苷(酸)类似物耐药位点的增多,相应
25、合成探针的费用增高.国内已有经SFDA批准的实时PCR试剂盒用于rMt2o4v/I变异的临床检测.5.1.5基因芯片(genechip):亦称DNA芯片,DNA微阵列.具有快速,高效,敏感,平行化和自动化等优点,可检测已知变异位点.另外随着基因芯片高通量测序技术进展,还可用于检测未知变异位点.目前国内用于核苷(酸)类似物耐药临床检测的芯片正在研发中.5.1.6限制性片段质谱多态性技术(RFMP):该技术是将PCRRFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDIT0FMS)技术结合,灵敏度高,能够发现数量不足HBV准种池l的变异株,但其同样仅能检测已知位点变异,且价格昂贵,很难在临床推
26、广应用.5.2体外表型分析体外表型分析(invitrophenotypicanalysis)是确认基因型耐药的金标准,常用半数有效浓度(EC50)或半数抑制浓度(IC5O)来评价耐药程度的高低.5.3虚拟表型分析进行虚拟表型分析(virtualphenotypicanalysis)的前提是建立包含相互关联的临床资料,基因型和表型耐药信息的HBV耐药变异数据库.当向数据库提交一待分析序列时,数据库会查找与该序列最匹配的HBV序列,根据其匹配序列的临床以及耐药检测情况来推断待分析序列耐药变异情况.6展望核苷(酸)类似物的发现是治疗乙型病毒性肝炎的一大突破,有望成为彻底治愈慢性乙型病毒性肝炎的手段,
27、但长期用药过程中耐药性的产生妨碍了临床应用,因此如何根据YMDD主型区的变异形式,筛选,联用新的核苷(酸)类似物或其他免疫抑制剂,值得深入探讨.研究耐药性的产生,HBV逃避抗病毒药物的机制以及突变株的分子生物学特性,将有助于发展更好的检测方法和更有效的抗病毒药物.从临床耐药管理的根本策略来讲,将管理和干预的时问前移到抗病毒治疗的起点,在启动抗病毒治疗时,因考虑到减少,延迟耐药发生,而选择合适的药物和治疗方案进行有效的耐药预防,这或许可能成为临床最有效,简便,可行的耐药管理方案.随着临床与实验研究的深入发展,基因治疗可能成为一种前景十分看好的针对HBV感染的治疗方式,随着临床与实验研究技术的日趋
28、成熟,慢性乙型肝炎的基因治疗有望在临床上发挥巨大作用,开创出更为广阔的前景.参考文献:1苏成豪,许龙善.乙型肝炎流行病学研究进展J.旅现代检验医学杂袁第26卷第3期2011年5月JModLabMed,Vo1.26,No.3,May.20117234567891O11121314151617行医学科学,2008,14(1):5-8.LokAS,McMahonBJ.ChronichepatitisB:updateofrecommendationsJ.Hepatology,2004,39(3):857-861.VanDameP,VanHerckK.Areviewoftheefficacyimmuno
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