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1、乙型肝炎血清HBV-DNA定量检测及其临床意义临床医学乙型肝炎血清HBVDNA定量检测及其临床意义任秀丽(吉林省图们市人民医院吉林图们133100)【摘要l通过检测乙肝志者血清中HBV-DNA,丙氨酸转氨酶(ALT).乙肝二对半(HBVM)探讨乙肝DNA的动态变化与乙肝感染,病情好转以及与拉束夫定(Laminvudue-Lam)治疗效粟的关系.采用PCR方法对患者HBV-DNA检测,采用腰A方法检测乙肝二对半(tmvM),采用全自动生化仪检测ALT,用LAM100rag/d治疗乙肝患者.HBV-DNA定量检测是反映乙肝患者病毒复制活跃以及预测和评价LAM治疗效果的可靠指标.【关键词】HBV-D
2、NAALT乙肝二对半LAM【中图分类号lR446I文献标识码lA【文章编号】1674-0742(2011)09(c)-OO16-02乙型病毒性肝炎在我国有较高的发病率,已经成为危害群众健康的公众性问题,实验室的诊断对于乙型肝炎的预防以及患者的病情观测,抗病毒治疗效果的观察等有着至关重要的作用,目前临床上检测乙肝病毒及其复制情况的方法主要有酶联免疫法检测乙肝两对半(HVBM)血清标志物*PCR法测定HBVDNA2】.因此在临床中通过监测乙肝患者血清HBVDNA的动态变化,来了解乙刑肝炎HBVDNA病毒复制活跃与临床的关系以及拉米夫定治疗效果.1材料与方法1.1标本来源100例,乙型肝炎均为我院2
3、006年9B至2008年4B门诊或者住院患者,男68例,女32例,年龄(50.48l1.52)岁,诊断符合西安病毒性肝炎学术会议诊定诊断标准】.其中25例为对照组,75例肝功能化验治疗前ALT>40,HBVDNA1.0Xl04copies/mLHBV-M示HbsAg,HBcAb均为阳性的患者.(1)HBV-DNA检测采用荧光定量方法,检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司.(2)肝功能检测,血清ALT/定采用全自动生化分析仪,ALT>40UL视为异常.(3)乙肝二对半检测采用酶联免疫方法,乙肝检测试剂盒为夏门新创生物制品所提供.(4)LAM(葛兰素史克中国投资有限公司)100mg片
4、/d,疗程52周,于治疗前治疗期间,每隔3个月检NllHBV-M,HBV-DVA定量,并动态观察ALT水平,疗程结束后随诊24周.1.3仪器美国PE7700自动荧火PCR仪,日本奥林巴斯AU600全自动生化分析仪.1.4疗效评价完全应答治疗结束时HbeAg转阴,或HBeAg/HBeAb出现转换,ALT正常,HBV-DNA阴性,部分答应:HBeAg阴转或HBeAb未阳转,HBVDNA短暂消失,ALT值下降为治疗前一半,无应答:未达上述标准者.1.5统计学处理各组治疗前后均数变化,组间率比较采用3C检验.2结果2.1慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA含量与HBVM之间的关系(见表1)结果显示慢性乙型
5、肝炎患者血清HBV-DNA含量在104109copie/mL之间,HBsAg+,HBeAg+,HBcAb+组血清HBVDNA含量显着高于其他组.2.2LAM治疗期间动态监测HBV-DNA的含量变化(表2)所有病例治疗69个月时,病毒含量均有不同程度的下降,以完全应答组下降明显,于治疗前病毒的含量较其他组低有关,且治疗后病毒消除速度也快,9个月完全应答组均低于正常水平线,无应答组患者LAM治疗前病毒含量高,治疗后病毒含量无明显变化,治疗后l2个月和随访24周病毒含量又回到治疗前水平.表1HBVM与HBVDNA检测比较例(%),(is)】注:与完全应答组比较,aap<0.01与治疗后6个月比
6、较,P<0.0516中外医疗CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT(下转19页)临床医学CHlNAFOREIGNMEDICALTREATMENT匿固硼蟹盲重_(+)之间;(+)阳性结果布满整个胞核.(2)组织切片阳性分析:根据切片中阳性信号表达数量/该片中估算的细胞总量,计数5loi-视野,计算肝细胞中总阳性表达率的平均值.1.8阴性对照PCR反应液不加引物,DNA聚合酶或信号检测时不加碱性磷酸酶标记的抗地高辛酶标复合物,其余条件与上述相同.另采用丙肝和脂肪肝等非乙肝组织切片各一例作对照.2结果2O例标本中有17例可见HBVcccDNA阳性信号,组织切片阻性表达率为平均
7、40%85%,以核型为主,呈浓密的蓝色,紫色或紫蓝色,呈颗粒状,弧形或圆形团块状,主要在核及核膜上表达,(+)(+)之间不等.20例患者中,1例酒精性肝硬化合并乙肝肝硬化静止期的患者和l例肝癌及1例乙肝慢性重症患者的组织切片中出现HBVcccDNA强阳性表达,慢性乙肝轻型和慢性乙肝中度患者组织细胞阳性表达率明显低于乙肝慢性重症,肝硬化和肝癌病人.阴性患者及阴性对照肝细胞胞核为红色,未见HBVcccDNA阳性表达.3讨论本实验方法利用石蜡组织切片作为回顾性研究,通过PSAD酶消化及跨缺口标记引物原位PCR方法结合起来再加上滚环扩增方法(RCA),最大限度的提高了方法的特异性及灵敏度,同时提高了石
8、蜡组织切片的利用率.PSAD酶可以消化除闭合环状DNA以外的任何形式的DNA,鉴于该酶的此种特性,经消化后的模板DNA可以抵消部分rcDNA的干扰,因此相对提高了特异性;但此方法不能完全避免rcDNA及其他线状DNA的影响,因为其消化效率因非共价闭合环状DNA的多少而不同,当非共价闭合环状DNA较多时,其消化效率降低,而且该方法也不能避免整合DNA的影响.RCA技术于2004年由Rector等人首先应用于病毒基因组扩增,该技术是一种体外等温核酸扩增法,其特点是利用phi29DNA聚合酶只能扩增闭合环状DNA,对于线状,不完全环状及整合DNA的影响都可进一步避免,使检测的特异性得到了提高.同时由
9、于其扩增效率较高,亦增加了检测的灵敏度.为了最大限度的增加方法的灵敏度及特异性,我们采用上述3种方法结合使用,提高了检测的效果.我们在研究中发现HBVcccDNA在肝组织中的表达与血清中HBVDNA水平IALT水平及肝组织病理分级,分期并无明显的相关性,而与疾病的进展程度相关,而且还发现HBVcccDNA在慢性乙型重症肝炎,乙型肝硬化及乙肝后肝癌患者肝组织中的表达阳性程度明显高于慢性乙型肝炎(轻,中度)患者,进一步说明HBVcccDNA在肝炎一肝硬化一肝癌三部曲中起到了关键的作用,同时也说明HBVcccDNA是乙肝病毒持续性感染的关键因素,而HBVcccDNA在慢性乙型肝炎(轻,中度)患者肝组
10、织中的表达阳性程度较低,可能与应用抗病毒药物有关,虽然传统的抗病毒药物只能清除HBVDNA,不能达到清除HBVcccDNA的目的,但抗病毒药物在降低HBVDNA水平的同时,间接的减少了胞核内HBVcccDNA来源的补充,如果能研制出一种抗病毒药物能直接清除肝组织中的HBVcccDNA,则在不久的将来乙肝的彻底治愈将成为现实(附图1,图2,图3,图4).参考文献1】成军.现代肝炎病毒分子生物学【M】.第2版.北京:科学出版社,2010.2】JohneR,MtillerH,RectorA,eta1.Rolling?circleamplificationofviralDNAgenomesusingp
11、hi29polymeraseJ.TrendsMicrobiol,2009.17:205211.【3】陈京龙.原位聚合酶链反应检测肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状的DNA表达【J】.北京医学,2007,29(9).【4】蒋明德.应用原位聚合酶链反应对肝细胞癌组织中HBVDNA进行再评价【J】.解放军医学杂志,1995,20(1).【5】李华东,江建宁.实时荧光定量PCR检IJHBVcccDNA的临床应用研究【J】.医学研究,2007,36(12).6】RectorA,TachezyR,VanRanstM.Asequenceindependentstrategyfordetectionandclo
12、ningofcircularDNAvirusgenomesbyusingmultiplyprimedrollingcircleamplificationJ.JVirol,2004,78:49934998.7】王笑梅.肝移植术后肝组织中HBVcccDNA的表达及临床意义【J】.中国实用内科杂志,2008,28(12).【收稿日期】2011-08-17(上接16页)3讨论LAM作用的靶位是HBV聚合酶能抑制DNA合成,从而抑制病毒复制.笔者采用荧光定量法对慢性乙型肝炎患者用LAM治疗前后的血清HBV-DNA进行检测,HBsAg,HBeAg,HBcAb指示均阳性的患者中检出率较高42/42(100.
13、0%),在HBsAg,HbeAb,HBcAb指标均阳性的患者中检出率稍低16/25(64.O%),而在HbsAg,HBcAb阳性组中也能检测到HBVDNA12.5%.说明HBeAg阳性,和HBcAb的出现并不能表明HBV复制停止,而是复制水平的降低,相关分析显示慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA的含量与ALT无明显相关性,与肝细胞损害程度也无相关性.LAM已广泛应用于慢性乙型肝炎的治疗.并取得了较好的治疗效果.检测血清HBVDNA含量可作为LAM应答的一个预测因素,笔者观察LAM治疗期间患者血清HBVDNA含量低的患者疗效较好,反之则较差,提示HBV-DNA的含量高低是影响疗效的重要因素.故笔者认为HBV-DNA定量测定是预测和评价LAM的治疗效果,病毒复制的可靠指标.参考文献1】骆抗先.乙型肝炎基础和临床【M】.第2版.北京:人民卫生出版社,2001:l00.【2】宋平.乙肝患者血清中检测乙肝表现抗原大蛋白的临床意义【J】.中华临床内科杂志,2006,6.【3】中华医学会传染病与寄生病学会肝病学分会修订病毒性肝炎防治方案J】.中华肝脏病杂志,2003.8.【收稿日期】201103-13CHINAFOREIGNMEDICALTREATMENT中外医疗19