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1、免费查阅精品论文云南白药含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响1张慧 1,2，班立丽 1，杨兵兵 1，罗敏 1，李玛琳 1*1.昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室，昆明（650031）2.中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化重点实验室，昆明（650223)E-mail：摘要：【目的】研究云南白药含药血清(SYB)对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和 向成骨分化的影响，探讨 SYB 促进骨折愈合的药效学作用机理。【方法】通过形态及多向诱导分化鉴定 BMSCs。用临床成人等效剂量 10 倍的 YB 给大鼠连续 4 天灌胃给药，末次灌胃 后 1h 采血制备 SYB。采用改良
2、MTT 法、pNPP 法、茜素红 S 染色定量法检测 BMSCs 增殖和向成骨分化的指标。用 RT-PCR 法探讨 SYB 促进骨折愈合的初步机制。【结果】和对照组 相比,SYB 对 BMSCs 的增殖在第 17 天内均无明显影响(P0.05)；但 SYB 组 7 天时 BMSCs核心结合因子（CBFA1）mRNA 表达量、14 天时 APL 活性、血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA 表达量、21 天时钙含量分别是对照组的 1.26 倍、1.45 倍、1.38 倍和 4.41 倍（P0.05)。表 1YB 含药血清对第二代大鼠骨髓 MSCs 增殖能力的影响（ x s） 血清A 值（570
3、/630）组别含量d1d3d5d7正常血清高剂量组20%0.076 0.06050.255 0.01050.345 0.02210.590 0.0396正常血清中剂量组10%0.079 0.03260.220 0.01950.307 0.00760.393 0.0443正常血清低剂量组5%0.078 0.00480.192 0.01370.273 0.01700.323 0.0264骨折血清高剂量组20%0.077 0.01600.213 0.06500.334 0.01830.557 0.0459骨折血清中剂量组10%0.080 0.02350.124 0.03260.316 0.02480
4、.363 0.0451骨折血清低剂量组5%0.068 0.01560.168 0.02740.302 0.01450.347 0.0210骨折+含药血清高剂量组20%0.078 0.02440.211 0.5830.316 0.01900.592 0.0170骨折+含药血清中剂量组10%0.075 0.01460.156 0.04270.308 0.02360.442 0.0230骨折+含药血清低剂量组5%0.074 0.02150.169 0.00490.299 0.00800.415 0.0703正常血清+成骨诱导剂20%0.076 0.01810.272 0.04490.294 0.02
5、270.399 0.0466高剂量组正常血清+成骨诱导剂10%0.078 0.02210.232 0.01060.261 0.01500.328 0.0189中剂量组正常血清+成骨诱导剂5%0.068 0.03210.230 0.04860.240 0.03720.326 0.0850低剂量组注：P0.05，含药血清组与其他组相比较（n=4）。3.3YB 含药血清对 MSCs 向成骨分化的影响用 pNPP 法测定第二代大鼠 MSCs 经各处理因素处理 14 天 ALP 活性变化，结果见表 2, 可看出含药血清组 APL 活性与各组比较明显增加，差异有显著性（P 0.01）。和对照组相比， 第
6、9 天含药血清组 ALP 活性分别是正常血清组、骨折血清组及成骨诱导剂组的 1.38、1.27 和 1.32 倍。14 天时，含药血清组和正常及骨折血清组相比，ALP 活性增加更为显著，分别 是正常血清组、骨折血清组的 3.14 和 1.45 倍(P 0.01)（图 11），但不如成骨诱导剂组 ALP 活性的影响大。表 2 YB 含药血清对第二代大鼠骨髓 MSCs ALP 活性的影响（ x s）A值组 别 d3d5d7d8d9d1410%正常血清组0.8560.10711.2080.03131.5060.03221.5010.05392.1500.08764.3920.00210%骨折血清组0
7、.8340.03901.6410.06081.6840.03581.9790.09632.3530.05769.6430.00110%骨折+含药血清组10%正常血清+1.1890.04561.6420.06451.9800.06152.1140.03522.9830.024413.9560.003成骨诱导剂组1.1740.03161.7120.12721.7570.1211.8800.00282.2610.057417.9630.002注：，P 0.01，与正常血清组比较；，P0.01，与骨折血清组比较（n=6）。正常血清组骨折血清组含药血清组正常血清+成骨诱导剂组图 11 第二代大鼠 MSC
8、s 经 YB 含药血清处理 14 天 ALP 染色用茜素红S染色定量法检测第二代大鼠MSCs经各处理因素处理21天钙结节含量（图12）， 结果见表3。含药血清组钙结节含量是正常血清组的9.49倍，是骨折血清组的4.41倍。正常血清组 骨折血清组 含药血清组 正常血清+成骨诱导剂组图 12 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清处理 21 天茜素红钙结节染色 表 3 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清 21 天钙结节含量 A 值（ x s）正常血清+成骨诱导剂组别正常血清组骨折血清组含药血清组组Ca2+含量0.2810.0090.6040.0092.6660.0233.3670.031注
9、：，P 0.01，与正常血清组比较；，P0.01，与骨折血清组比较（n=5）。3.4YB 含药血清促进骨折愈合的作用机制用 RT-PCR 技术检测第二代大鼠 MSCs 经各处理因素处理 7 天 CBFA1 mRNA 表达和 14 天 VEGF mRNA 表达的变化（图 13，14），结果见表 4，5。各组与正常血清组比较均有显 著性差异（P 0.01），含药血清组 CBFA1 mRNA 表达量是正常血清组的 4.44 倍,是骨折血清 组的 1.26 倍,是正常血清+成骨诱导剂组的 1.35 倍,并且早期成骨标志基因 mRNA 表达量含药 血清组超过成骨诱导剂组。含药血清组 VEGF mRNA
10、表达是正常血清组的 2.21 倍,是骨折血 清组的 1.38 倍,是正常血清+成骨诱导剂组的 1.91 倍，VEGF mRNA 表达量含药血清组超过 成骨诱导剂组。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp18s r RNA Cbfa11234图 13 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清处理 7 天 CBFA1 mRNA 表达 注：1:正常血清；2:骨折血清组；3:骨折+含药血清组；4:正常血清组+成骨诱导剂组。表 4 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清处理 7 天 CBFA1 mRNA 表达量（ x s）组别正常血清组骨折血清组比值0.1710.04050.
11、6060.0325骨折+含药 血清组正常血清+成骨诱导 剂组0.7600.01510.5610.0309 注：，P 0.01，与正常血清组比较；，P0.01，与骨折血清组比较（n=3）。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp18s r RNAvegfb vegfa1234图 14 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清处理 14 天 VEGF mRNA 表达 注：1:正常血清；2:骨折血清组；3:骨折+含药血清组；4:正常血清组+成骨诱导剂组。表 5 第二代大鼠 MSCs 经 YB 含药血清处理 14 天 VEGF mRNA 表达量（ x s）骨折+含药 血清组正常
12、血清+成骨诱导剂 组1.5630.06250.8170.0352 注：，P 0.01，与正常血清组比较；，P0.05)，说明 YB 并不影响第 二代 MSCs 的增殖。增殖和分化是细胞的两个重要生物特性，但也是一对矛盾。有些因素可 同时影响细胞的两个特性，有的因素却只能影响其中一个特性，由于 MSCs 有很强的增殖能 力18，局部骨折不需要 MSCs 的大量增殖，但是这并不能排除 YB 从骨髓中将 MSCs 动员到 骨折部位可能起到的作用。这一作用还有待于通过体内实验进一步研究。经典的成骨诱导是单层培养的 MSCs 在含有维生素 C、甘油磷酸和地塞米松的培养 基中培养 23 周，可作为阳性对照
13、19。 ALP 活性增强和细胞外基质钙化是 MSCs 向成骨 分化成熟的两个重要标志。本实验中 YB 含药血清能增加 MSCs 的 ALP 活性和钙结节含量， 提示 YB 含药血清中含有诱导 MSCs 成骨分化的化学成分，但究竟是哪种化学成分起作用， 还有待于以后的实验进一步证实。近年来发现 Cbfa1 是骨发生最早最特异的标志20,21。本实验的结果表明早期 Cbfal 表达 量含药血清组高于正常血清+成骨诱导剂组，该结果和上述含药血清对 MSCs ALP 活性的检 测是一致的。VEGF是毛细血管生成和内皮细胞特殊促分裂原的重要调节子22,23。经YB含药血清诱导 培养MSCs VEGF m
14、RNA表达高于对照组，提示YB可能通过增加MSCs中VEGF的分泌，促进 骨折组织中新血管生成来加速骨折的修复。5结论综上所述，YB 含药血清诱导大鼠 MSCs 分化成骨的机制之一可能是通过作用于 MSCs， 促进 MSCs 向成骨细胞分化、影响成骨细胞成熟和诱导骨折周围组织新血管生成来实现的。参考文献1Friedenstein A.J,Petrakova K.V,Kurolesova A.I,et al.Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues
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24、nd Osteogenic Differentiation of SD Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem CellsZhang Hui，Ban Lili，Yang Bingbing，Luo Min，Li Malin*Yunnan Pharmacological Laboratories of Natural Products，Kunming Medical College，Kunming（650031）AbstractOBJECTIVE To study the effects of serums from SD rats fed with Yunnan-Bai
25、yao（SYB） on theproliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) fromSD rats and the mechanism of SYB in promoting the healing of bone fracture.METHODS BMSCs were identified by their morphology and their capacities in muti-differentiation. The SYB were abtain
26、ed by intragastric administration of YB. The proliferation , osteogenicdifferentiation markers of BMSCs were evaluated via MTT，pNPP and Alizarin Red S stainingassay.The expressions of CBFA1 and VEGF mRNA in BMSCs were detected by RT-PCR. RESULTSFollowing treatment with the medium containing SYB from
27、 d1 to d7,no significant effect in the proliferation of BMSCs was observed(P 0.05). After 7 days treatment with SYB, the mRNA expressions of CBFA1 were 1.26 fold higher than that in the control groups(P 0.01).After 14 days treatment, the ALP activeties were 1.45 fold higher and the mRNA expressions
28、of VEGF were 1.38 fold higher than that in the control groups (P 0.01).After 21 days treatment ,the quantities of calcium nodule in BMSCs were 4.41 fold higher than that in the control groups(P 0.01).CONCLUSION The SYB had no obviously effect on the proliferation of BMSCs,but they could enhance diff
29、erentiate into osteoblasts.They could increase the expressing of CBFA1 and VEGF mRNA. Therefore,one of the possible mechanism of SYB in promoting bone healing was to enhance the osteogenic differentiation of BMSCs and induce the angiogenesis in the tissues around bone fracture.Keywords ：Mesenchymal stem cells ，serums of rats fed with yunnan-baiyao ，Proliferation ，Differentiation，mechanism