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1、精品论文双分子荧光互补技术研究进展窦非，常兴亚（北京师范大学生命科学学院，北京 100875）5摘要：在过去的十年中，双分子荧光互补（BiFC）已经成为研究蛋白质之间的相互作用的 重要手段，在细胞及多种模式生物中均有应用。 BiFC 的原理是基于两个互补的非荧光片段 被一对相互作用的蛋白质拉近到一起时可重组成完整的蛋白并恢复荧光。在这里，我们回顾 BiFC 技术的发展历史，主要介绍了 BiFC 系统的发展和完善，并从技术角度提出了未来可 能的改进。10关键词：细胞生物学；荧光互补；蛋白质相互作用；荧光蛋白中图分类号：Q2-33Research Progress of Bimolecular f
2、luorescence complementation15DOU Fei, CHANG Xingya(College of life science,Beijing Normal University, Beijing 100875)Abstract: In the past decade, the bimolecular fluorescence complementary (BiFC) has become an important means of study protein interactions。It has been proved very useful in cultured
3、cells anda variety of model organisms. The BiFC assay is based on reconstitution of an intact fluorescent20protein when two complementary non-fluorescent fragments are brought together by a pair of interacting proteins. Here, we look back at the history of the development of the BiFC technology, rev
4、iewed on the development of the BiFC system, and possible improvements in thefuture from a technical point of view.Keywords: cell biology; fluorescence complementation; protein-protein interaction; fluorescence25protein0引言随着人类基因组计划（human genome project ,HGP）的提前完成，以及其他一些物种如： 线虫（Caenorhabditis elegans
5、）、果蝇（Drosophila melanogaster）、家鼠（Mus musculus）、30拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）水稻（Oryza sativa）等基因组全序列的 测通，核酸序列的合成、测序、基因序列的体外重组变得越来越高效、常规，现代生物学已 经进入了后基因组时代（post-genomic era）。后基因组时代的一个重要代表就是蛋白质组学 (proteomics)系统研究某种物种全部蛋白结构、功能，以及由它们产生相互作用的关系网 络，为进一步，系统的研究生命活动规律奠定基础。蛋白质组学的研究中要借助大量的现代35生物学技术的发展，
6、这其中很重要的一部分技术就是用于研究蛋白质相互作用的信号网络。 目前用于研究蛋白-蛋白相互作用的技术方法有很多种，总体来说有以下一些方法：1， 基于亲和作用的方法：如GST-pull down、immunoprecipitation1、biotinylation、TAP(tandem affinity purification)2等。402， 基于库的方法：如yeast two-hybrid3、4 、bacterial two-hybrid、phage display等。3， 基于下列分子互补作用的方法：基金项目：教育部“高等学校博士学科点专项科研基金”博导类（20090003110015）作
7、者简介：窦非，（1975-），男，教授，主要从事神经退行性疾病研究。E-mail: - 3 -如 ubiquitin5、6、-galactosidase6、7、luciferase6、8、BiFC（bimolecular fluorescence complement）9、10 Dihydrofolate reductase6、-lactamase6等。454， 其它：如FRET(fluorescence resonance energy transfer)10、11、12、cross-link13、Mass spectrometry14等。其中 FRET 和 BiFC 都是利用荧光物质的指示
8、作用，在活的细胞中，一定波长的激发光 入射某些荧光物质后，波谱会发生红移，产生波长较长的发射光，利用荧光显微镜可以直接50捕捉到这种变化，从而直接观察与它们偶联得两个蛋白因子的相互作用关系，但它们的具体 原理还是有一些不同的。1BiFC 的技术原理在 FRET 技术中涉及到共振时能量的供体和受体，供体荧光蛋白（ECFP、Cerulean）在405/440nm 波长的光激发下，产生大约 475nm 的发射光，如果距它很近的空间内（110nm）55有荧光受体蛋白（EYFP、Venus），其可以接受来自于供体蛋白发射的光子，从而引起自身 的荧光激发而发射出更长(530nm)的可见光，这样从激发和发射
9、光谱的这种跨度的变化，可 以用于分析两个分别与能量供体和受体偶联的目的蛋白的空间关系，从而反映它们在相对正 常的生理环境下的作用，这个作用会因为目的蛋白的动态变化而发生改变，而反映它们相互 关系的这种动态情况。而 BiFC 利用的是某些蛋白被从中间切开后获得的两个片段可在特定60条件下重新组合，恢复天然构象的特性。正常的荧光蛋白 venus 是由 12 个反向平行的“-sheet”围绕形成一个桶状的疏水结构“-barrel”，由“-barrel”围绕着一个主要由 G65、Y66、G67 形成的荧光基团。在各个“-sheet”相连的区域是一些亲水的“loop”结构15、16、17，如果将 ven
10、us 从 173 残基或 155 残基处截开，就破坏疏水的“-barrel”结构，产生 没有荧光激发能力的两个片段 VN（venus N terminal fragment）和 VC(venus C terminal65fragment)，在细胞中由于偶联在片段 VN 上的蛋白因子“bait”捕捉到偶联在片段 VC 上的 蛋白因子“prey”而拉近 VN 和 VC 的空间距离，在一定程度上恢复了“-barrel”结构受 激发后产生荧光。利用荧光蛋白的这种特点，可以在活的细胞中直接研究两个蛋白因子的相 互关系，及亚细胞定位。而且这种复合物的形成比较稳定，是不可逆的，对于研究一些弱的、 瞬时的相互
11、作用很有优势，这也使得这一技术并不太适合于研究分子的动态相互作用，且细70胞中稳定的 BiFC 复合体的形成，也可能改变了原有的动态信号网络，而产生假阳性或假阴 性的结果，使得 BiFC 不太适合于功能性分析9、10、19。劈开的蛋白片段由于互补效应而在一定程度上重新恢复原有蛋白的功能，而形成一个报 告系统用于检测与其偶联或相关的生物分子的行为的方法在很多蛋白上都已经成功实现并 得到很好的运用了6。2000 年 Indraneel Ghosh18等人就将反向平行的“leu-zipper”通过 675到 8 个氨基酸的柔性“linker”分别连接到从 GFP（green fluorescence
12、 protein）157 和 158 位置截开的 GN 和 GC 上，在 in vitro 和 E.coli BL21(DE3)中成功的观察到了 GN 和 GC 通过互 补效应成功的恢复了 GFP 的荧光特点。为利用荧光蛋白的互补效应，在 in vivo 直接观测蛋 白因子的相互关系奠定了重要基础。2001 年 Nagai20等人将 YFP(yellow fluorescence protein)的两个劈开的片段 YN 和 YC 分80别融合到 calmodulin 及 M13 calmodulin 结合蛋白上，共转染 Hela 细胞后，发现互补的 YN 和 YC 在激发下产生的荧光会随着细胞
13、中 Ca2+浓度的变化而变化，类似的 Robert21等人在心 肌细胞中用于研究线粒体的 Ca2+振荡机制。8590951001051101151202002 年 Chang-Deng Hu9等人将 EYFP（enhanced yellow fluorescence protein）的 1-154 的 YN 片段及 155-239 的 YC 片段通过“linker”分别融合到转录因子 fos 和 jun 上，在 COS1、 NIH3T3、Hela 细胞中,成功地观察到它们在细胞核中形成异二聚体，同时也研究了 Rel 家族 蛋白以及 bZIP 与 Rel 家族蛋白的相互关系。使这一技术第一次成功
14、在活细胞中，直接在亚 细胞水平观察两个蛋白的相互作用。2003 年 Chang-Deng Hu22等人利用 GFP 的变异体之间具有可区分的激发光谱和发射光谱的特点系统研究了 EGFP（enhanced green fluorescence protein）、EYFP(enhanced yellow fluorescence protein)、CFP(cyan fluorescence protein)、BFP(blue fluorescence protein)运用于 BiFC 中的特点，他们发现分别在 155 位置和 173 位置分开的荧光蛋白的 N 端和 C 端片断分 别融合到 bZIP
15、 家族蛋白 b-fos 和 b-jun 上，他们发现交互的组合两两蛋白，它们在 Cos-1 细 胞中仍然保持了 BiFC 技术的特点，直接观察到了 b-fos/b-jun 二聚体的形成以及它们核定位 的特点，且可以在同一个细胞中利用 BiFC 技术同时研究多对蛋白的作用以及这种相互作用 的亚细胞分布的特点，为在同一细胞中研究蛋白复合体中各组分的相互关系提供了一个很好 的手段。2004 年 Ingrid Remy23等人第一次运用 BiFC 技术从人脑的 cDNA 文库中钓取与 PKB(protein kinase B)相互作用的蛋白 hFt1。他们将 PKB 与 GFP 的 GC（159-23
16、9）片断编码 序列融合在具有氯霉素抗性的穿梭质粒上，可以在真核细胞中表达出，PKB-GC 蛋白作为 “bait”，而编码 GFP 的 GN（1-158）核酸序列与人脑组织来源的 cDNA 序列连接到另一个 氨苄青霉素抗性的穿梭质粒上，其在真核细胞中可以表达融合有 GN 的“prey”，将可表达 “bait”和“prey”库的质粒混合，转染 Cos-1 细胞后，利用流式细胞仪分选阳性细胞，提 取质粒后转化 E.coli 在只有氨苄青霉素抗性的条件下筛选阳性克隆，并将阳性克隆的质粒与 “bait”质粒重新转染 Cos-1 细胞，并通过流式细胞仪复选一次。这个技术很好的实现了基 于哺乳动物细胞的相互
17、作用蛋白的筛选工作，但是这一技术中几个关键步骤如 cDNA 文库 的库容、向真核细胞转染的效率、流式细胞仪筛选的参数设定、重新从阳性细胞中提取质粒 的转化效率等可能在实际操作中直接影响到筛选结果的有效性，因为这些结果都最终决定着 某些低丰度蛋白 cDNA 的钓取。同年 Michael Walter 等人24和Bracha-Drori K25等人成功将 BiFC 运用于植物细胞中，用于研究两个蛋白因子的相互关系。2005 年 Magliery TJ26等人系统的研究了 GFP 的片断 GN（1-157）和 GC（158-239）结 构重组的原理，他们运用一个反向平行的亮氨酸拉链的文库进行筛选,发
18、现 BiFC 技术可以检 测到非常弱的(KD1mM)相互作用，它们的 in vitro 动力学实验表明重组的 GFP 片断是不可 逆的不会因为其偶联分子的动态而改变，表明这一技术可以很好的运用于研究蛋白因子的瞬 时相互作用。并且可以用这一技术来区分同质或异质蛋白之间的相互作用。但同时又限定了 它的运用，背景可能会偏高，稳定的重组体不适合研究蛋白因子相互作用的动态机制等功能 性研究。同年 Beat Nyfeler27等人成功的将 BiFC 技术运用于研究蛋白的分泌通路上的较弱 的、瞬时的相互作用，他们在 Hela 细胞中运用 YFP 的 YN（1-158）和 YC（159-239）片断 偶联目的
19、蛋白，成功观察到了非糖基化的 I 型膜蛋白 ERGIC-53（endoplasmic reticulum Golgi intermediate compartment protein 53）寡聚物的形成，以及与 catZ(cathepsinZ)、MCFD2 的相 互作用，并首次证明了在 lectin 的介导下 ERGIC-53 与 catC(cathepsinC)的相互作用。2006 年 BiFC 技术得到了很好的发展和运用，首先.John Shyu16等人运用 bJun/bFos 相 互作 用的 leu-Zipper,系统的研究了 GFP 的几个新的变异体：venus、citrine、cer
20、ulean，发现 它们可以很好的运用于 BiFC 的研究，其中 VN173/VC155 组合具有比以往运用的 GFP 或- 4 -125130135140145150155160YFP 以及 EYFP、citrine 的片断组合有更好的效率。并且 VN173/CC155（cerulean C terminalfragment）及 CN173/VC155（cerulean N terminal fragment）组合都具有由 VN173 或 CN173 决定的激发和发散波谱特征。使得 venus 及 cerulean 可以运用于多色 BiFC 的研究。更为重 要的是他们发现 venus、ceru
21、lean 这些新的变异体在运用于 BiFC 时表现出很低的环境敏感性， 荧光蛋白在 37就能很好的迅速成熟不需要象 GFP、YFP 等蛋白在运用于 BiFC 时需要一 个低温成熟的阶段（哺乳动物细胞在图像采集前一般要经过 30孵育 4 小时以上）16，在 植物细胞中运用 BiFC 技术这个问题不是很大，因为植物细胞的培养温度一般在 262824、25 。为在正常生理温度条件下研究蛋白因子的相互作用提供了很重要的工具。Vitaly Citovsky28等人成功的构建了一批具有亚细胞定位的质粒，将 BiFC 技术运用于植物细胞特 定细胞器（nucleus 、plasmodesmata 、chlor
22、oplasts ）中相关蛋白因子的研究。而 Andrey A.Zamyatnin Jr29等人运用 YFP 的 YN（1-154）和 YC（155-239）分别融合到待研究膜蛋白 的 N 端、C 端、或亲水的 loop 区，与定位于 ER 或在 cytoplasm 中表达的 YN 或 YC 片断共 同在植物细胞表达，来研究膜蛋白的拓扑结构特征，它们证明了已知结构的 BYV p6 蛋白（ beet yellows virus-encoded p6 membrane-embedded movement protein ）并 探讨了 PMTVTGBp2 蛋白（potato mop-top virus
23、-encoded integral membrane TGBp2 protein）的膜上 拓扑分布特点，证实了 BYV p6 蛋白是一个 III 型膜蛋白，发现 PMTVTGBp2 蛋白的中心 亲水区定位于 ER 的 lumen 区，而其 N 端和 C 端定位于 cytosol。第一次运用 BiFC 来研究膜 蛋白的拓扑特点，显示了这一技术在这领域运用的快速、高效性。在动物细胞膜蛋白的研究 上,Ci-Di Chen30等人利用 EYFP 的 YN(1-155,1-173)和 YC（156-239，174-239）在 Cos-7 细 胞中利用 BiFC-FACS（fluorescence-act
24、ivated cell sorter）的方法，发现膜蛋白 APP 可以形成 同源二聚体，而且膜蛋白 APP 与膜蛋白 Notch2 可以形成异二聚体，且结合细胞器 ER 和 Golgi 的荧光蛋白标记的共定位分析发现 APP-Notch2 异二聚体的形成具有亚细细胞分布的特点。 第一次运用 BiFC 技术研究了膜蛋白之间的相互关系。以往运用于 BiFC 研究的都是 GFP 的 遗传变异体，而 Jach,G.31等人对 DsRed(red fluorescence protein from Discosoma sp.)遗传突变 体 mRFP1 (monomeric red fluorescenc
25、e protein 1)的荧光基团第一个氨基酸 Q66 进行随机突 变，筛选得到一个突变体 mRFP1-Q66T，具有相对于同系的单体 RFP 有更高的荧光强度。 在运用于 BiFC 中他们发现 RN（1-168）/RC（169-225）（mRFP1-Q66T N terminal fragment,RN）/(mRFP1-Q66T C terminal fragment,RC)相对于 RN（1-154）/RC（155-225）的截法具有更好 的效果。他们的工作扩宽了 BiFC 技术可选荧光蛋白的波谱范围，促进了多色 BiFC 技术在 探讨复合体各因子相互关系的运用。Richard Benton
26、32等人在果蝇（Drosophila melanogaster） 中使用 YFP，成功的将 BiFC 技术运用于嗅觉的研究，发现高度保守而且广泛表达的嗅觉受 体 OR83b(odorant receptor 83b)可以和 OR 家族的其它分子形成功能性异二聚体，实现了真正 意义上的 in vivo 运用。2007 年 Blanchard D33等人运用 Venus 蛋白，并在 Xenopus 胚胎中筛选了一系列的适合 运用于 Xenopus 胚胎发育过程研究的突变体，系统地研究了 TGF信号通路上 smad 家族蛋 白同源和异源二聚体的形成在 Xenopus 胚胎发育过程中的特点，研究发现了
27、 smad2/smad4 异 源二聚体的形成，并在细胞核中聚集激活下游基因 Xbra、gsc (goosecoid)的表达这个过程仅 仅发生在爪蟾胚胎发育的中囊胚转换期以后，这一工作不仅近一步研究了 smad 信号通路在 爪蟾胚胎发育过程中的表达特点，更扩展了 BiFC 的新的运用领域。同样 Cole,K.C.34等人运 用 BiFC 的方法在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)这一系统中研究对蛋白因子 Cdc42p 与- 7 -165170175180185190195200Rdi1p 的关系在细胞分裂周期中的时空变化。针对 BiFC 技术在分析蛋白因子的弱的、瞬时相
28、互作用的特点 Montse Morell35等人采用了 BiFC 结合 FASC 的评价体系在 E.coli BL21 (DE3)系统中探讨这一技术在研究 c-Abl SH3 结构域蛋白作用的具体运用方法。以往的研究 一直认为 BiFC 中两个荧光蛋白片断互补以后很稳定，是不可逆的，但Anderie I36等人在 HEK293 细胞系中运用 BiFC 技术研究-acting 的在细胞中的动态行为，他们发现分别融合 有 EYFP 片断的 actin-YN(1-155)和 actin-YN(156-239)相互聚合形成的互补荧光在细胞中的分 布是时刻变化着的，在用 latrunculin B (1
29、0 mM)阻断处理细胞后发现，整个荧光在细胞中的 分布呈弥散状态。类似的他们在用 actin 纤维稳定剂 jasplakinolide (1 mM)处理细胞时，发现 用于有新的 actin 纤维的形成，由于 YN/YC 互补形成的荧光也是在变化的。他们又用 YC-actin/PKC-YN 异二聚体来研究 BiFC 技术荧光可逆的特点，发现在用 PMA (phorbol esters,1 mM)处理前后由于 PKC的在细胞中分布集中到细胞膜上，而由 YC-actin/PKC-YN 互补形成的荧光也集中到细胞膜上。他们的工作表明 BiFC 技术相互作用蛋白形成的荧 光互补复合体在某些分子的作用中还
30、是会可逆的。2008 年到现在为止，BiFC 技术的发展相对越来越成熟了。首先 Y. John Shyu37等人将 BiFC 技术与 FRET 技术结合来研究 AP-1NF-B 三聚体的形成，探讨 in vivo 的蛋白因子的 cross-talk 行为。他们采用了高信号强度，低环境敏感度的 cerulean/venus 来作为 FRET 中的 donor/acceptor，用 venus 的 VN(1-173)/VC(155-239)片断组合作为 BiFC 技术的互补片断。发 现 NF-B 家族蛋白 p65-cerulean 由于有能量传递到 bJun-VN/bFos-VC 二聚体而激发出接
31、近 于 venus 发射光谱的光产生，反映了它们在细胞内 AP-1NF-B 信号通路的 cross-talk 的机 制。为直接观察多因子的相互作用提供了很好的方法。而 Montse Morell38等人及 Y. John Shyu39等人分别在 BiFC-FACS 技术以及 BiFC 在模式动物 C.elegans 中运用的具体技术细节 进行了探讨，为这一技术的近一步成熟和广泛运用奠定了重要基础。其次，近年来越来越多 的其它荧光蛋白被证明适用于 BiFC 技术，例如 mKate 和 Dronpa，mKate 作为 RFP 的长波 长突变体，更适合于研究较深组织内的蛋白-蛋白相互作用40；Dro
32、npa 作为一种可擦写的荧 光蛋白适合用于研究转录因子等在核质之间的穿梭过程41,42。2结论作为一种新的 in vivo 系统中探讨生物因子相互作用的方法，BiFC 技术显示了它很好的 运用前景，已有的运用表明作为一种可视化的技术手段，它既可以在 in vitro 系统也可以在 in vivo 系统中进行运用，不仅可以运用于 E.coli、yeast、植物细胞、还可以在哺乳动物细胞 甚至运用于 C.elegans、Xenopus 等模式动物的个体发育系统中。不仅可以用于验证两个因子 的相互关系，还可以结合其它方法用于验证多因子复合物的形成以及进行高通量的筛选，显 示了这一技术运用的广泛性。从
33、技术特点上看，BiFC 相对于其它基于分子互补特点的研究方法，这一技术对所运用 的系统影响是最小的，不需要破坏细胞，提取蛋白，可以直接观察所研究分子的作用以及它 们的亚细胞分布。而复合物一旦形成相对比较稳定，且敏感度比较高，使得这一技术特别适 合于研究一些因子之间相对比较弱的、瞬时的关系。但是反过来高的敏感性可能在一些运用 中带来一定的“false-positive”和“false-negative”的结果，过于稳定的结合会改变原有分子 在细胞中的时空动态的关系，为近一步研究它们的生物学效应带来很多不确定的因素，因此 在这一方法中合适的阴性对照是非常必要的，我们一般采用片断缺失的方法筛选合适的
34、对 照。同时，很多实验室开展了高信噪比的突变体筛选，发现 V150 和 L201,L207 等位点的突205210215变可提高信噪比43,44。在具体的信号评价上，一般采用随机选取几个阳性信号进行统计学分 析或者结合 FACS 的技术进行评估。虽然有的研究表明这一技术中形成的复合体在某些研究 中是可逆的，但已有的研究大部分还是认为不可逆的，这方面的研究还需要进一步的工作去 支持，如果能通过一定的遗传改造或化学修饰来降低荧光互补片断的结合力，减少这一作用 对偶联分子本身相互关系的影响，无疑将会很深刻地促进这一技术的发展。而且这一技术在 仪器配置上要求也不是很高的，一般的倒置荧光显微镜就可以满足
35、于实验的需要，也不像FRET 运用中的结果分析需要很复杂的公式推算。 总之作为一种生物学研究手段，它很难尽善尽美，它可以用于验证其它方法的结果，同样它所得到的实验结果也需要用其它手段来验证。相信随着不断有新的运用探索，这一技术 将会给现在的生物学研究带来更多的便捷。参考文献 (References)2202252302352402452502551 Masters MC.Co-immunoprecipitation from transfected cellsJ.Methods MolBol,2004,261:337350.2 Puig, O.The tandem affinity purif
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