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1、精品论文基于 ATRP 法研制多糖基因载体杨鑫超，杨万泰，徐福建（北京化工大学材料科学与工程学院，北京 100029）5摘要：通过对天然多糖进行化学修饰，制备具有 ATRP 引发位点的多糖引发剂，然后通过原 子转移自由基聚合，制备以天然多糖为骨架，以不同链长的阳离子聚合物为侧链的阳离子非 病毒基因载体。对合成的材料进行细胞转染、细胞毒性测试，并对其它各种性能进行表征。 各项表征的结果证明基于 ATRP 法合成的多糖基因载体能够很好的络合 DNA，并且具有良 好的 PH 缓冲能力以及生物相容性，与 PEI 和商业化转染试剂相比，转染效率更高，细胞毒10性更低，在基因治疗中具有很好的应用前景。关键
2、词：材料学；天然多糖；ATRP；基因载体；细胞转染；基因治疗中图分类号：O631Synthesis of Polysaccharide-Based Gene Vectors via ATRP15YANG Xinchao, YANG Wantai, XU Fujian(Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029)Abstract: Through chemical modification of polysaccharides, we developed bromoisobutyryl- terminated polysac
3、charide initiators for subsequent atom transfer radical polymerization. A series of new cationic polymers composed of biocompatible polysaccharide backbones and polycation20side chains of different length were designed. Cell transfection, cell toxicity, and the other properties of the material were
4、characterized. The results of the characterization indicated the cationic polymers can condense DNA very well and have good buffer capacity and biocompability. The high gene transfection efficiency and cell viability of polysaccharide-based polycations compared with PEI and commercial transfection r
5、eagent demonstrate it has great potentials as25efficient vectors in future gene therapy.Keywords: Materials science; Polysaccharide; ATRP; Gene vector; Gene transfection; Gene therapy0引言30基因治疗在攻克人类癌症、遗传疾病及心血管等重大疾病方面起到举足轻重的作用，未 来的医疗革命将取决于基因治疗研究的成败。基因导入系统是基因治疗的核心技术, 缺乏安 全而高效的基因载体是目前制约基因治疗实施的主要瓶颈。应用于基因
6、治疗的载体主要分为 病毒载体与非病毒载体。病毒载体的优点是转染率高，缺点是缺乏安全性，可能引起致癌作 用与自身免疫反应和白细胞的病毒变化。此外病毒载体还可能导致宿主细胞的恶性转化，而35且携带 DNA 的能力有限。目前，科学界已将研究中心转向非病毒载体的研究与开发。与病 毒性载体相比，非病毒载体具有安全性高，并且具有低免疫原性、能够携带大量 DNA 分子、 容易大批量生产及费用低廉等优点，是一个有潜力的替代路线。阳离子聚合物是研究最广泛的非病毒载体。阳离子聚合物能够与带负电的基因通过电荷 相互作用, 形成略带正电荷的纳米级复合体，从而协助基因穿过带负电的细胞膜，加速基因40的细胞转染。目前，相
7、关文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸、聚乙二胺树枝状聚合物、聚甲基丙烯酸 N,N-二甲氨基乙酯、聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）等1-3。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用4,5。这基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金(20090010120007)国家自然基金（21074007, 51173014, and512210020）作者简介：杨鑫超，（1987-），男，研究生，主要研究方向：应用高分子。通信联系人：徐福建，（1976-），男，教授，主要研究方向：应用高分子。E-mail: - 16 -样，开发低毒而高效阳
8、离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。目前较为流行的方案是在阳离子聚合物中插入生物相容的成份，最常见的是聚乙二醇（PEG）6,7。另一种常见45的思路是开发阳离子化多糖非病毒载体，包括壳聚糖、环糊精、葡聚糖等2,8,9。天然多糖具 有无毒、极好的生物相溶、生物可=-降解、可再生等特性，非常适于制备药物控释 体系。但是多糖阳离子非病毒载体制备过程往往比较复杂,不具有可控制性，以及载体的转 染性能比较低。探索新的载体制备技术有利于促进高性能基因控释体系的研发，以满足先进 医学技术快速发展的特殊需要。50近年来，随着活性/可控自由聚合（living/controlled radical poly
9、merization，LRP）研究的 快速发展，LRP 技术在制备具有新颖特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大发展。迄 今为止, 已有原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization, ATRP)10、稳定自由 基氮氧游离基调控体系(nitroxide mediated free radical polymerization, NMRP) 11和可逆加成- 裂解链转移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)12等 LRP 体系问世。55其中，ATRP 近几年得到了迅速发展并
10、有着重要应用价值7,8。ATRP 反应温度适中，适用单 体范围广，甚至可以在少量氧存在下进行，对高分子材料的分子设计不需复杂的合成路线， 是现有 NMRP、RAFT 等其它活性聚合方法无法比拟的，因此可以说 ATRP 技术的出现开 辟了活性聚合的新领域 10,13。ATRP 已成功应用于制备多种分子量分布窄的聚合物、嵌段 共聚物、末端官能团聚合物、接枝共聚物、超支化聚合物、星型聚合物、梯度聚合物等。60综上所述，本文将介绍几种 ATRP 法合成的以多糖为骨架的阳离子基因载体。1基于 -CD 为核的星状非病毒基因载体环糊精（Cyclodextrin，CD）由于自身的生物相容性和结构易剪裁性，受到
11、越来越多的 研究者的亲睐，并已开始运用于非病毒基因载体的研究中。在之前研究的基础之上，可以设 计以 -CD 为核，聚甲基丙烯酸 N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）为臂的新型星状非病毒65基因载体 CDPD，并通过末端接枝聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯（PEGEEMA）增强其生物相 容性，得到毒性更低，转染效率更高的阳离子基因载体 CDPDPE14。针对上述研究内容和目标，具体研究思路如图 1 所示：首先从 -CD 基质出发，制备带 ATRP 引发剂官能团的大引发剂(CD-Br),再通过 DMAEMA 的 ATRP 制备出以 -CD 为骨架、 PDMAEMA 短链为边链构成的星状基因载体(CDPD
12、)，然后对 CDPD 载体进行 PEG 功能化，70以 CDPD 共聚物为大引发剂,通过聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)的 ATRP 在 PDMAEMA 边链引入 PEG 功能嵌段,以得到 PEG 化 CDPD 载体(CDPDPE)15,16。PEG 的引 入一定程度上可降低载体的毒性、改善载体的稳定性和提供屏蔽效应16。对合成产物 CDPD 以及 CDPDPE 进行各种表征，包括 XPS 及 400MHz 核磁测试，检验 聚合物的 DNA 缩合能力、粒径、电位、细胞毒性和转染效率。基因转染实验结果显示 CDPD75及 CDPDPE 对 Hek293 细胞具有高的转染效率14。通过控
13、制 ATRP 的反应时间，合成不同分子量的 CDPD，CDPD1 为 ATRP 反应时间 0.5 h 的产物，CDPD2（1.5 h），CDPD3（8 h），CDPD3PE（PEGEEMA 的 ATRP 反应时间为12 h）。80CH3CH3OCH3C CH2 Cm BrCC BrO C CH3 C OOH OBIBBCH3 ODMAEMAATRPH3CO(CH2)2NCH3-CD CD-Br CD-g-P(DMAEMA)(CDPD)CH3CH3CH3CCH2 Cm CH2 CnBrPEGEEMA ATRPO C CH3OH3CC O O(CH2)23N CHC OOCH2CH2O3C2H5C
14、D-g-P(DMAEMA)-b-P(PEGEEMA) (CDPDPE)OHO O OOCH3CH3CH3OH HOC C CH2 C CH2 C BrHO OOH OHOOHO OHO OH OOHOOHO OHOO OHOOHOOH OH O OHCH3H3CmC O O(CH2)2NCH3n C O OCH2CH2O3C2H5图 1 通过原子转移自由基聚合制备星状阳离子基因载体的过程Fig.1 Processes for the Preparation of Star-Shaped Cationic Copolymers via Atom Transfer RadicalPolymeriz
15、ation (ATRP) from the 2-Bromoisobutyryl-Terminated -CD Macroinitiator(CD-Br)85图2 合成的阳离子基因载体在不同条件下对HEK293细胞的转染效率Fig.2 In vitro gene transfection efficiency of the cationic polymers(CDPD1, CDPD2, CDPD3, CDPD3PE, andP(DMAEMA)/pDNAcomplexes in comparison with that of PEI (and naked DNA (ND) at various N
16、/P ratios in90HEK293 cell cultures in the (a) absence and (b) presence of serum.由图 1 可以看出，无论在有无血清的条件下，CDPD3PE 的转染效率均高于 CDPD，并且在所做的大多数氮磷比下，CDPD3PE 的转染效率也高于 PEI，证明 P(PEGEEMA）链段 具有提高转染效率的作用。952基于羟丙基纤维素为骨架的梳状非病毒基因载体羟丙基纤维素（HPC）是一种水溶性的非离子型纤维素醚，是一种以天然纤维素为原料 经化学改性制得的半合成型高分子聚合物，HPC 原料来源广泛，具有黏结、增稠、凝胶、 赋形和热塑等性
17、质，对生理无害、不污染环境,具有良好的成膜性和抗生物降解性，与许多100105阴离子、阳离子、非离子及其两性表面活性剂具有良好的相容性, 与其它聚合物具有良好的协同性和相容性。羟丙基纤维素分子具有活性基团羟基,若能利用羟丙基纤维素分子结构中 残余的-OH 作为反应官能团,使其进一步进行接枝改性反应, 则可得到新的改性材料, 能够 进一步拓宽羟丙基纤维素的应用领域。梳状聚合物作为一种很重要的非病毒基因载体，受到了人们的广泛关注17-20。羟丙基纤 维素上具有活性羟基基团，对其进行进一步修饰，可作为活性自由基聚合的引发点，进而形 成梳状聚合物21,22。首先，我们利用 2-溴异丁酰溴与羟丙基纤维素
18、主链上的羟基反应，制备 主链带溴的引发剂（HPC-Br），再通过原子转移自由基聚合（ATRP）23,制备以聚甲基丙 烯酸 N,N-二甲氨基乙酯（PDMAEMA）为侧链，以 HPC 为主链的阳离子基因载体（HPD）， PDMAEMA 可进一步季铵化，形成季铵盐（QHPD），具体合成过程如图 3 所示:BrBrBrBrBrBrBrBrATRPDMAEMABr-hexaneHPC-Br HPC-g-P(DMAEMA) (HPD)HPC-g-QP(DMAEMA) (QHPD)O CH2CH3H2 C CH O x HH3CCH3NH3CBr- NCH3(CH2)5 CH3HC OH CHC C H O
19、CnHO HOOH2C CH O x C CH3CH3CBrCH3(CH2)2OCO CH2 C xCH3(CH2)2OC OCH2 C y BrCH3110115HPC-BrQP(DMAEMA)图 3 以羟丙基纤维素为骨架的梳状阳离子聚合物的合成线路图Fig.3 Schematic diagram illustrating the preparation processes of cationic comb-shaped copolymers composed ofHPC backbones and short partially quaternized P(DMAEMA) side cha
20、ins通过控制 ATRP 反应的时间，合成不同分子量的阳离子聚合物，HPD1 为 ATRP 反应 2 h 的产物，HPD2 为 ATRP 反应 8 h 的产物。QHPD2-1 为季铵化 22的产物，QHPD2-2 为 季铵化 43的产物。120125图 4 合成的阳离子基因载体在不同条件下对 HEK293 细胞的转染效率Fig.4 In vitro gene transfection efficiency of the cationic polymers (HPD1, HPD2, QHPD2-1, QHPD2-2, P(DMAEMA), and PEI)/pDNA complexes in c
21、omparison with that of naked DNA (ND) at various N/P ratios in HEK293 cells in the absence (a) and presence (b) of serum.不同产物的基因转染效率如图 4 所示，由图中可以看出，在有血清的条件下，随着季铵 化程度的提高，表现出最高转染效率的最佳氮磷比有所降低，说明季铵基团可以提高缩合 DNA 的能力。在氮磷比较低时，转染效率随其升高而提高，较高时，则会随其升高而降低，主要 是由于在氮磷比较高时，聚合物的含量升高，毒性增大，进而影响细胞的生长，使转染效率 降低。130由图 2 中
22、还可以看出，HPD1 的转染效率低于 HPD2 的转染效率，表明 HPD 的侧 链长度对转染效率有影响，较长的侧链能提高聚合物缩合 DNA 的能力，增强复合物的稳定 性，进而提高转染效率。135140145150季铵化的阳离子聚合物可以提高其表面电荷数，进而提高其缩合 DNA 的能力，理论上可以提高转染效率，但从图 1 中可以看出，季铵化的阳离子聚合物的转染效率反而低于未季 铵化的阳离子聚合物，可能是由于毒性增加，从而使转染效率降低24。但有报道说可通过 控制季铵盐中的烃基(-CH2-)长度和载体的季铵度,提高载体的转染效率25。总而言之，通过原子转移自由基聚合制备的以 HPC 为主链，以短链
23、 P(DMAEAM)为侧链的梳状阳离子聚合物，具有比长链 P(DMAEMA)更低的毒性和更高的转染效率，是一种新 型的多功能基因载体。3基于葡聚糖为骨架的梳状非病毒基因载体不同种类的直链多糖骨架, 其主链糖单元的组成不同，生物学活性存在较大差异，可能 会影响基因载体的性能。与前面提到的羟丙基纤维素多糖相比26，葡聚糖(dextran)具有更广 泛的临床应用价值, 易溶于水，可以增加血浆容量，维持血压，抗休克，改善微循环，预防 或消除血管内红细胞聚集和血栓形成，还可以在体内结肠细菌酶的作用下降解。广泛应用于 生物领域，包括组织工程、药物释放、细胞封装等26,27。以葡聚糖基质为出发点，结合 AT
24、RP 法和后续修饰手段，能够制备出毒性低、DNA 缩 合能力强、转染效率高的新型梳状基因控释载体28。具体制备过程如图 5 所示：首先从葡 聚糖（Dextran）基质出发，制备带 ATRP 引发剂官能团的大引发剂(Dextran-Br),再通过 DMAEMA 的 ATRP 制备出由葡聚糖为骨架、PDMAEMA 短链为边链构成的梳状载体(DPD)， 再通过 DPD 与溴己烷反应，对 DPD 的短边链进行适度的季铵化，得到高性能的 QDPD 基 因载体。OHHO OHO HO CCH3C BrCH3O CH3C C BrO CH3HO OHDMAEMAO CDI OnO ATRP OnH3CCH3
25、NH3CCH3 H3CCH3O CH3(CH2)2OC OCH3N(CH2)2OC OBrN- (CH2 )5 CH3(CH2)2OC OC C CH2C x+y BrO C C CH2 C x CH2 C y BrO CH3HO OHO OnCH3Br-hexaneO CH3HO OHO OnCH3CH3Dextran-g-P(DMAEMA) (DPD) Dextran-g-QP(DMAEMA) (QDPD)图 5 通过原子转移自由基聚合制备以葡聚糖为骨架的阳离子基因载体Fig.5 Schematic diagram illustrating the preparation processe
26、s of partially quaternized PDMAEMA-graft-dextran comb copolymers via atom transfer radical polymerization (ATRP) from 2-bromoisobutyryl-terminated dextran155160165图 6 合成的阳离子基因载体与 lipofectamine 在不同细胞中进行 EGFP 测试Fig.6 Representative photos of DPD2-mediated (N/P ratio = 13,a, b) and Lipfectamine 2000-me
27、diated (a0, b0) EGFP expression in vitro in (a, a0) breast cancer MCF7 and (b, b0) lng adenocarcinoma 973 cells,where the percentage of the EGFP positive cells was determined usingflow cytometry. Figure scale bar = 100 m.对所得的材料（DPD2 为 ATRP 反应时间 12 h，DPD1 为 ATRP 反应时间 5 h）进行 EGFP 测试，测试结果如图 3 所示，DPD2 与
28、商业化的转染试剂 lipofectamine 相比，其转染能力大 概是 lipofectamine 的三倍。图 7 在裸鼠中对材料进行抗肿瘤活体实验Fig.7 In vivo anti-tumorigenesis: dissected tumors after 33 days with transfected MCF7 cells in nude mice ( 10 mice for each group).170175对材料进行抗肿瘤活体实验，结果如图 7 所示，DPD/p53 络合物表现出比lipofectamine/p53 更好的抗肿瘤效果。 在上述研究基础之上，还可以在材料中引入可生物
29、剪切的二硫键29，在还原剂 DTT 的作用下，二硫键可以断裂。在基因治疗中，聚合物与 DNA 的络合物进入细胞内，DNA 要 从络合物中脱离出来以进行表达，从而达到更好的基因治疗的效果。而二硫键可还原断裂的 特点对 DNA 的脱离与表达有重要意义30-32。上述材料的具体合成线路如图 8 所示：首先从 葡聚糖（Dextran）基质出发，制备带 ATRP 引发剂官能团以及二硫键的大引发剂(Dextran-S-S-Br),再通过 DMAEMA 的 ATRP 制备出由葡聚糖为骨架、PDMAEMA 短链为边 链构成的梳状载体(S-S-DPD)，再通过 S-S-DPD 与 PEGEEMA 反应，对 DP
30、D 的短边链进行 适度的 PEG 功能化，得到高性能的 S-S-DPDPE 基因载体。180HH HC O HO C OOHOHHHC OCystamineH CDI OHHHO C OOHHHC OBIBAH EDAC/NHS OHHHO C OOHHO HOHO HOO HO HO C HOHO CC H H2HO HOO HHOCC H H2185DextranH2CSC NHOH2CSC NHOO CH3H2 H2H2 H2 HS C C NH2S C CN C C BrNH2NH2NH2NH2NH2NH2BrBrCH3BrSS-Dextran-NH2H HBr Br Br190DMA
31、EMA ATRPHC OOH HO HOHHO COOH O HPEGEEMA ATRPHC OOH HO HOHHO C OOH O HSS-Dextran-BrHOCC H H2HOCC H195H2CC NHOO CHCHCH2CH2 NH OS 33H2 H2 H H2S O CH3CH3CH3S C CN C C C CBrH2 H2 H H2 H2m S C CN C CC C mC C n BrCH3 O CCH3 H2C NOCH2OH2C NC O CH2OH2C OC O CH2200H3CCH3SS-Dextran-g-P(DMAEMA) (SS-DPD)H3CCH3CH
32、2CH2O2H2C CH3205SS-Dextran-g-P(DMAEMA)-b-P(PEGEEMA) (SS-DPDPE)图 8 通过 ATRP 制备以葡聚糖为骨架的可生物剪切阳离子共聚物Fig.8 the preparation processes of biocleavable P(DMAEMA)-graft-dextran copolymers via atom transfer radical polymerization (ATRP).(a) SS-Dextran-Br(b) SS-DPD1(c) SS-DPD1 in the presence of10 20 30 40 50El
33、ution Time (min)210215220图 9 在加入 DTT 的条件下对聚合物进行凝胶渗透色谱测试Fig.9 Aqueous GPC traces obtained for (a) SS-Dextran-Br, (b) SS-DPD1 and (c) SS-DPD1 in the presence of 10 mM DTT, where the incubation time with DTT was 1 h.由上图可以看出，由于 DTT 的存在，聚合物的分子量减小，表明二硫键在特定的条件 下是可以断裂的。图 10 对材料进行琼脂糖凝胶电泳测试Fig.10 Electrophore
34、tic mobility of plasmid DNA (pDNA) in the complexes of the cationic polymers (a) SS-DPD1, (a) SS-DPD1 in the presence of 10 mM DTT and poly(sodium styrenesulfonate) (Mn = 20 KDa) as the counter polyanion, (b) SS-DPD2, (b) SS-DPD2 in the presence of 10 mM DTT and poly(sodium styrenesulfonate) as the
35、counter polyanion, (c) SS-DPD3, (d) SS-DPD4, (e) SS-DPD5, (f) SS-DPD5PE, (h) P(DMAEMA) and (i) PEI) at various N/P ratios. For (a) SS-DPD1 and (b) SS-DPD2, the incubation time with DTT was 1 h.225230235240由图 10 可以看出，在氮磷比 2.0 以上，SS-DPD 系列材料、P（DMAEMA）以及 PEI均能与 DNA 形成稳定的复合物， 而在 DTT 存在的条件下，材料束缚 DNA 的能力明
36、显减 弱，结合图 5 得到的结论，证明二硫键的断裂能使 DNA 更好地从复合物中脱离。图 11 在 HepG2 细胞中对材料进行 EGFP 测试Fig.11 Representative images of EGFP expression mediated by SS-DPD5, SS-DPD5PE, P(DMAEMA), and PEI (25kDa) at their corresponding optimal N/P ratios in HepG2 cells.对材料进行 EGFP 测试，结果如图 11 所示，SS-DPD5PE（ATRP 反应时间 60 分钟，并 适度 PEG 化的产物
37、）的转染效率最高，甚至高于金标 PEI，证明对材料进行 PEG 功能化有 利于提高其转染效率。4基于壳聚糖为骨架的梳状非病毒基因载体壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，这种天然 高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业 广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程 等诸多领域的应用研究取得了重大进展33,34。以壳聚糖基质为出发点，通过 ATRP 法和后续修饰手段，能够制备出毒性低、转染效率 高、DNA 缩合能力强、PH 缓冲能力强且可降解的新型梳状基因控释载体35
38、。具体制备过程 如图 12 所示：首先从壳聚糖（chitosan）基质出发，制备带 ATRP 引发剂官能团的大引发剂 (chitosan-Br),再通过 DMAEMA 的 ATRP 制备以壳聚糖为骨架、PDMAEMA 短链为边链构成 的梳状载体(PDCS)。245H OHH O OH OHH O O* CS*HOHm HHnOHHOHNH2 HNHO CBMPACH3H2O2, 70 C, 4 hEDC/NHS, r.t.CSO24 h, r.t.DMAEMAr.tCS-BrPDCS图 12 以壳聚糖为骨架的基因载体的合成线路Fig.12 Route of the synthesis of PDCS vectors.1110987pH6543PDCS 1 PDCS 22 PDCS 3 PDCS 41 PEI P(DMAEMA) CSOBlank00 500 1000 1500 2000 2500250图 13 PDCS、PEI、PDMAEMA、CSO 的 pH 缓冲能力测试Fig.13 Acid-base titration curves for PDCS vectors, PEI (25 kDa), P(DMAEMA), CSO and blank (0