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1、精品论文山羊子宫内膜细胞与性腺激素对 uNK 细胞分泌活性的调节作用廖庆红，齐雪峰5（西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100） 摘要：为探讨山羊子宫内膜细胞和性腺激素对子宫 NK 细胞（uNK）分泌 VEGF 和 IFN- 含 量的影响。以永生化山羊子宫内膜基质细胞（ESC）和上皮细胞（EEC）为体外研究模型， 通过 ELISA 法检测子宫内膜细胞和性腺激素（E2 ,P4）对 uNK 细胞分泌 VEGF 和 IFN- 含 量的影响。结果显示:在 uNK 细胞与 EEC 共培养时，雌激素 E2 单独或与 P4 共同作用可显著10抑制 uNK 细胞中 IFN- 和 VEGF 分泌水平
2、（P0.05），而 P4 单独作用不显著；而当 uNK 细 胞与 ESC 共培养时，孕酮 P4 单独或与 E2 共同作用可显著增强 IFN- 在 uNK 细胞中的分泌 水平（P0.05），而 E2 单独或与 P4 共同作用可显著抑制 VEGF 分泌水平（P0.05）。表明 性腺激素对与 EEC 或 ESC 共培养的 uNK 细胞分泌水平具有不同程度的调节作用。关键词：山羊；子宫内膜上皮细胞；性腺激素；uNK 细胞；分泌活性15中图分类号：S857.2Regulatory role of goat endometrial cells and sex gland hormones in uNK c
3、ells secretionLiao Qinghong, Qi Xuefeng20(Northwest A&F University, ShanXi YangLing 712100)Abstract: To explore the effect of the goat endometrial cells and sex hormones on secretioncontent of VEGF and IFN- in uNK cells. Using immortalized goat endometrial stromal cells (ESC) and epithelial cells (E
4、EC) as an in vitro research model, the effect of the endometrial cells and sex hormones(E2, P4) on secretion content of VEGF and IFN- in uNK cells was detected by25ELISA assay. When uNK cells co-cultured with EEC, estrogen E2 alone or together with P4 significantly inhibited the secretion levels of
5、IFN- and VEGF in uNK cells (P0.05), while the P4 alone had no significant effect. While when uNK cells co-cultured with ESC, progesterone P4 alone or together with E2 can significantly enhance the secretion of IFN- in uNK cells (P0.05), whereas E2 alone or together with P4 significantly inhibited th
6、e secretion level of VEGF (P0.05).30The sex hormones play a varying degrees regulatory role in uNK cells secretion which co-culturedwith EEC or ESC.Keywords: goat; endometrial epithelial cells; sex gland hormones; uNK cells; secretion activity0引言35子宫内膜细胞主要包括基质细胞（ endometrium stromal cell, ESC ）和上皮细胞
7、 （endometrium epithelial cell, EEC）。研究认为，子宫内膜细胞可通过多种途径参与局部免 疫防御与免疫调节：如物理屏障、表达 TLRs、分泌趋化因子和细胞因子及表达免疫黏附分 子等1-3。子宫 NK 细胞（uterine natural killer, uNK）是一类功能特化的免疫细胞，在发挥局 部免疫调节作用的同时，在平衡子宫局部免疫内分泌中具有重要意义。目前对 uNK 细胞40的研究取得了明显的进展，如其表型功能、变化规律、局部免疫及产生的细胞因子，而有关 子宫内膜细胞在 uNK 细胞募集与活化中的作用，以及性激素对该作用的影响等方面尚不清 楚。性腺激素 E2
8、 和 P4 是来自卵巢和子宫局部最主要的激素。大量的研究证明，E2 和 P4 对基金项目：国家博士点基金资助项目（20090204120011） 作者简介：廖庆红，（1989-），女，本科生，家畜生殖内分泌与免疫学。 通信联系人：齐雪峰，（1977-），男，副教授，生殖免疫学。 E-mail: - 6 -淋巴细胞的作用与剂量以及两者的比例相关。但新近的研究表明，P4 对 uNK 细胞的影响似乎并不是通过其直接作用，因为在子宫内膜 uNK 细胞尚未发现 P4 受体4,5。并且体外研究中45两种激素发挥作用所需要的浓度远远高于体内的实际浓度和相应受体的结合度，推测可能通 过子宫内膜间接参与子宫局部
9、的免疫调节。最近的研究也表明，妊娠早期 uNK 等免疫相关 细胞在子宫内膜呈时空分布变化，在胚胎附植期主要聚集于子宫内膜基质细胞区域，提示子 宫内膜细胞在局部免疫细胞活化与功能发挥中的作用6-10。本试验旨在以分离纯化的山羊 uNK 细胞和 hTERT (human telomerase reverse transcripta)50转染获得的永生化山羊 ESC 和 EEC 为基础，通过 ELISA 法检测子宫内膜细胞对 uNK 细胞 分泌 VEGF 和 IFN- 含量的影响，以探究山羊子宫内膜细胞及性腺激素对 uNK 细胞分泌活 性的影响。这不仅对于全面了解子宫局部免疫内分泌免疫调节机制，而且
10、对深入了解生殖道 的抗感染免疫机制等均具有重要的理论意义和潜在的应用价值。1材料与方法551.1 细胞hTERT 转染获得的永生化山羊 ESC 和 EEC 由西北农林科技大学动物医学院靳亚平教授 馈赠。该细胞形态及免疫化学特性均与原代培养细胞相似11,12。1.2 主要试剂DMEM/F-12 为 Gibco 产品；胎牛血清为 Hyclone 产品；胰蛋白酶为 Amresco 产品；E260和 P4 均为 Sigma 公司产品，分别用无水乙醇和氯仿配制，过滤除菌，-20冻存，使用时用 含血清的 DMEM/F-12 完全培养液稀释成设定浓度的工作液；DBA 凝集素、DNaseI、N-乙 酰-D-氨
11、基半乳糖均购自 Sigma 公司；M280 磁珠和磁力架均购自 Invitrogen 公司；DBA 凝 集素一抗及 HRP 标记链霉亲和素二抗为美国 US Biological 公司产品；绵羊 IFN- ELISA 检 测试剂盒、山羊 VEGF ELISA 检测试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司。651.3 山羊 uNK 细胞的分离与鉴定参照 Bizinotto 等6的方法，通过 DBA 标记链霉亲和素包裹磁珠法对山羊 uNK 细胞进行 分离。主要程序为：无菌采集 23 月孕龄山羊子宫角，分离子宫中膜淋巴细胞汇集区并剪 成 1mm3 左右小块，用 Hank s溶液（含 1%BSA、1000U
12、 的 Dnase type ）反复冲洗，离心后 重悬于 Hank s液，加入 DBA 标记磁珠吸附溶液中 uNK 细胞，然后用 0.1mol/L N-乙酰葡萄70糖溶液洗脱磁珠并分离 uNK 细胞。通过台盼蓝染色法计算活细胞率。细胞纯度鉴定通过细 胞离心法将分离的 uNK 细胞吸附于玻片，丙酮预冷后与生物素化 DBA 凝集素一抗及 HRP 标记链霉亲和素二抗反应，于显微镜下鉴定 uNK 细胞纯度。1.4 ESC 和 EEC 的复苏与传代培养分别将冻存的山羊 ESC 和 EEC 迅速解冻，1000 r/min 离心后，用新配置的含 10%胎牛75血清的 DMEM/F-12 完全培养液调整浓度至
13、1105 个mL-1 接种于细胞培养瓶，于 37、5 CO2 培养箱中恒温培养 23d（以下培养条件均与此同）。待细胞生长至约 80%时，吸弃旧 培养液，用灭菌 PBS 液洗涤 23 遍，加入 0.25胰酶消化，进行传代培养。根据细胞生长 情况，每 23 d 传代一次，传代培养 34 次后进行下一步试验。808590951001.5 性腺激素作用下子宫内膜细胞体系对 uNK 分泌活性的调节作用试验于 24 孔套皿培养板进行。主要过程是：将生长状态良好的 EEC 或 ESC 用胰酶消 化后，制成密度为 1105 个mL-1 的细胞悬液，分别加入 24 孔细胞培养板，每孔 500L，置 培养箱中培
14、养。逐日观察细胞生长情况，待各孔细胞生长形成单层时，弃旧培养液；并按照 表 1 所述浓度将 E2 或/和 P4 分别加入 24 孔板各行，每孔 250L，激素添加剂量及比例参照 文献13,14,1。激素空白对照组补加等量 DMEM/F-12 培养液。随后于各孔加入套皿，皿内加 入 5104 个mL-1 的 uNK 细胞悬液，继续培养至 56 h。每个处理做 5 个重复。收集套皿内细 胞培养上清液，按照 ELISA 试剂盒说明进行 VEGF 和 IFN- 含量的测定与分析。1.6 结果分析统计数据按 SPSS 进行方差分析，数据相关分析结果采用平均数标准差表示，P0.05认为差异性显著。2结果2
15、.1 山羊 uNK 细胞的分离与鉴定通过 DBA 标记链霉亲和素包裹磁珠法对山羊 uNK 细胞进行分离纯化。由图 1A 可见与 M280 磁珠（细箭头所示）紧密结合的近似呈球形的 uNK 细胞（粗箭头所示）；当经 0.1mol/L N-乙酰葡萄糖溶液洗脱磁珠后，可见分离 uNK 细胞纯度较高，无其它杂质（图 1B），细胞 浓度约 2105 个.mL-1，台盼蓝染色法计算活细胞率约为 90%；DBA 凝集素染色法显示分离 的细胞呈棕色阳性染色，表明分离的山羊 uNK 细胞纯度较高（图 1C，1D）。图 1 山羊 uNK 细胞分离纯化与鉴定Fig.1 Goat uNK cells isolatio
16、n and purification精品论文1051101151202.2 性腺激素及子宫内膜细胞对 uNK 细胞中 IFN- 分泌活性的影响本研究通过套皿培养技术，检测性激素及体外培养的山羊子宫内膜细胞对 uNK 细胞分 泌活性的影响。实验结果表明，性腺激素 E2 和/或 P4 在单独培养的 EEC 或 ESC 下对 uNK 细胞分泌 IFN- 水平有不同程度的调节作用。如图 2 所示，与未加激素对照组相比较：当 uNK 细胞与 EEC 共培养时，E2 单独或与 P4 共同作用对 uNK 细胞分泌 IFN- 活性具有显著 的抑制作用（P0.05），P4 单独作用对 uNK 细胞分泌 IFN-
17、 活性影响不显著。对于 uNK 细 胞与 ESC 共培养 56 h 后，P4 单独或与 E2 共同作用对 uNK 细胞分泌 IFN- 水平具有显著的 增强作用（P0.05），E2 单独作用影响不显著。* . 表示差异显著，P0.05；n=5。下同* . Mean significantly different at P0.05 level, n=5. The same as below图 2 性腺激素及子宫内膜细胞对 uNK 细胞中 IFN- 分泌活性的影响Fig.2 Effect of sex hormones and endometrial cells on secretion activ
18、ity of IFN- in uNK cells2.3 性腺激素及子宫内膜细胞对 uNK 细胞中 VEGF 分泌活性的影响实验结果显示，性腺激素 E2 和/或 P4 在单独培养的 EEC 或 ESC 下对 uNK 细胞分泌 VEGF 水平有不同程度的调节作用，主要呈抑制作用。如图 3 所示，当 uNK 细胞与 EEC 共培养后， 与未加激素对照组相比较，E2 单独或与 P4 共同作用对 uNK 细胞分泌 VEGF 水平具有明显的 抑制作用（P0.05），而 P4 单独作用对 uNK 细胞分泌 VEGF 活性影响不明显；当 uNK 细 胞与 ESC 共培养后，E2 和 P4 单独或者共同作用对
19、uNK 细胞分泌 VEGF 水平均具有明显作 用，其中 P4 单独作用呈显著增强作用（P0.05），E2 单独或与 P4 共同作用呈显著抑制作用（P0.05）。125130135140145150155图 3 性腺激素及子宫内膜细胞对 uNK 细胞中 VEGF 分泌活性的影响Fig.3 Effect of sex hormones and endometrial cells on secretion activity of VEGF in uNK cells3讨论进行体外研究的一个先决条件是收获高纯度并保持原有活性的单一细胞群。常见的 uNK 细胞分离方法有机械法和酶消化法，但因其局限性，效果
20、皆不理想。研究表明：uNK 细胞 膜及胞浆中含有可与双花扁豆素（DBA）结合的特异性 N-乙酰半乳糖胺的糖结合物6。本 试验将 DBA 凝集素包裹链霉亲和素免疫磁珠，基于磁珠分选技术对妊娠山羊子宫内膜中 uNK 细胞进行分离纯化与鉴定，清除了胰酶消化后残留的各种杂质，成功地制备了高纯度 的 uNK 细胞悬液。而怀孕中期哺乳动物体内 uNK 细胞含量最高，孕期过短或过长，动物体 内的 uNK 细胞含量都会过低，无法满足试验需要8,9。本研究采集 23 月孕龄山羊子宫组 织，保证了高浓度 uNK 细胞的获得，为深入研究子宫内膜细胞以及性腺激素对高比例 uNK 细胞分泌活性所发挥的作用奠定重要的实验
21、基础。子宫内膜组织中存在有大量的免疫细胞。其中 uNK 细胞是妊娠早期子宫内最主要的淋 巴细胞，uNK 细胞水平变化与妊娠能否成功紧密联系。uNK 细胞常出现于血管周围，并且 表达血管内皮生长因子（VEGF）16。uNK 细胞通过促进适量 IFN- 的分泌，在植入部位发 挥促进螺旋动脉改造的作用17。因此，有关妊娠期子宫局部 uNK 细胞的分泌活性调节成为 深入了解胚胎，尤其是核移植胚胎胎盘血管发育缺陷的核心与关键。而目前有关子宫内膜细 胞在 uNK 细胞分泌活性中的调节作用以及性腺激素对该作用的影响机制等尚不确定。本研 究通过套皿培养技术，检测性激素及体外培养的山羊子宫内膜细胞对 uNK 细
22、胞分泌活性的 影响。实验结果表明，性腺激素对与 EEC 或 ESC 共培养的 uNK 细胞分泌水平具有不同程 度的调节作用。在 uNK 细胞与 EEC 共培养时，雌激素 E2 单独或与 P4 共同作用可显著抑制 uNK 细胞中 IFN- 和 VEGF 分泌水平，而 P4 单独作用不显著。提示子宫内膜上皮细胞在介 导 E2 对 uNK 细胞分泌活性中的重要作用。而当 uNK 细胞与 ESC 共培养时，孕酮 P4 单独或 与 E2 共同作用可显著增强 IFN- 在 uNK 细胞中的分泌水平，而 E2 单独或与 P4 共同作用可 显著抑制 VEGF 分泌水平。提示子宫内膜基质细胞在介导性腺激素对 u
23、NK 细胞不同细胞因 子分泌水平的调节作用。E2 和 P4 主要通过与其靶细胞上的相应核受体特异性结合调节子宫 局部免疫微环境促使胚胎发育和子宫内膜容受态的建立。Oh5等的研究表明，P4 对 uNK 细 胞的影响似乎并不是通过其直接作用，因为在子宫内膜 uNK 细胞尚未发现 P4 受体。本研究 结果中性腺激素对与 EEC 或 ESC 共培养的 uNK 细胞分泌水平不同程度的调节作用提示性 腺激素可能通过子宫内膜细胞上激素受体调节子宫内膜细胞的增殖及分泌活性，间接参与对160165uNK 细胞分泌活性的免疫调节作用。4结论性腺激素对与 EEC 或 ESC 共培养的 uNK 细胞分泌水平具有不同程
24、度的调节作用。雌 激素 E2 单独或与 P4 共同作用可显著抑制与 EEC 共培养 uNK 细胞中 IFN- 和 VEGF 分泌水 平，提示子宫内膜上皮细胞在介导 E2 对 uNK 细胞分泌活性中的重要作用；在 uNK 细胞与 ESC 共培养时，孕酮 P4 单独或与 E2 共同作用可显著增强 IFN- 在 uNK 细胞中的分泌水平， 而 E2 单独或与 P4 共同作用可显著抑制 VEGF 分泌水平，提示子宫内膜基质细胞在介导性腺 激素对 uNK 细胞不同细胞因子分泌水平的调节作用。参考文献 (References)1701751801851901952001 ROBERTS RM, CHEN
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