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1、精品论文早实枳酵母双杂交 cDNA 文库的构建及评价孙雷明，张金智，胡春根5（华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070） 摘要：为探索早实枳的成花分子机理及各成花相关蛋白之间的互作关系，利用 SMART 技术 成功构建了早实枳特定组织的 cDNA 文库，用于后续的酵母双杂互作蛋白筛选试验。通过 对总 RNA 的分离纯化得到 mRNA，再将其反转录为第一链 cDNA，经 LD-PCR 扩增获得双 链 cDNA。通过质粒的同源重组，在酵母 AH109 菌株中构建了早实枳特定组织的双杂文库。10经检测构建的文库容量为 1.61E+6，文库滴度为 1.84E+8pf
2、u/ml。文库质量及多态性较好，为 筛选分离成花相关蛋白及其互作关系奠定了基础。 关键词：早实枳；酵母双杂交；文库；构建中图分类号：Q715Construction and Evaluation of Yeast Two-Hybrid cDNA Library of precocious trifoliate orange (Poncirus trifoliata L.Raf.)Sun Leiming, Zhang Jinzhi, Hu Chungen(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, C
3、ollege of Horticulture20and Forestry Science, Huazhong Agricultural University,WuHan 430070)Abstract: To explore the molecular mechanism and interaction among the proteins of flowering inprecocious trifoliate orange, SMART technique was used to construct the cDNA library. The total RNA was isolated
4、form special tissues and mRNA was purified. We used mRNA as template and synthesized the first strand cDNA, and then obtained double strand cDNA by using LD-PCR25amplification. The yeast two-hybrid library of precocious trifoliate orange was constructed in yeast AH109 by homologous reorganization me
5、thod. The results showed that the library contained1.61E+6 independent cloned, and had a titer of 1.84E+8pfu/ml. These results indicated that the library was suitable for screening the interaction proteins related to flowering.Keywords: Precocious trifoliate orange; Yeast two-hybridization; Library;
6、 Construction300引言植物的生长发育和对环境的适应是其内在基因与环境相互作用的结果，是由受发育调控 的大量基因在时间上空间上选择性表达；它的整个生长过程包括包括营养生长 (vegetative growth) 和生殖生长 (reproductive growth) 两个阶段1。开花是高等植物个体发育的中心环35节，这一过程包含营养分生组织向花序分生组织的转变、花序分生组织向花分生组织的转变， 是一个极其复杂的多层次、多元化的反应过程，也是开花基因在时间和空间上顺序表达的结 果2。近些年来，随着对拟南芥和水稻等模式植物研究的深入，越来越多的成花相关基因被分离，并在细胞和分子水平上对
7、其表达调控及生物学功能进行了较深入的分析3，为植物成 花研究提供了很大便利，同时也使得开花调控这一复杂的网络途径逐步被揭开。基金项目：教育部博士点基金：用 Raman 光谱研究 PtFLC 基因的选择性剪切及其童期调控中作用机制（20090146110009）；教育部新教师基金：柑橘成花关键基因 PtELF5 互作蛋白的分离及其功能鉴定（20110146120027）作者简介：孙雷明，男，博士，果树发育分子生物学。通信联系人：胡春根，男，教授，博士生导师，主要从事果树发育分子生物学及植物学研究。 E-mail:- 2 -40柑橘作为世界第一大果树，其栽培面积和产量均居世界首位。同时也是我国南方
8、重要的经济作物，对农村和农业的发展及农民的脱贫致富，都起着十分重要的作用4。然而像柑桔 这样的木本植物在开花结果前，都要经历一个漫长的童期，即果树由营养生长向生殖生长转 化所经历的时期。宽皮柑桔类的童期一般为 6-7 年，甜橙为 8 年或更长，柚类更是长达 15 年左右，这种复杂的遗传背景大大地制约了果树遗传机理和育种实践进程5。因此，研究果45树发育阶段的转变机制，分离成花相关基因，进而从分子水平上有效缩短植物的童期，提高 育种效率，具有重要的理论和实践意义。目前随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学理论与技术的研究的深入，也使得人们意识 到植物开花调控是由多个基因之间相互作用甚至是一个大的代谢
9、网络所控制，不同的基因网 络又存在着一定的交叉6。酵母双杂交是研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种重要技术50手段。它主要通过将已知蛋白的基因序列与 DNA 结合结构域融合，在酵母中表达产生融合 蛋白 BD-Bait7。将未知蛋白的基因序列以 cDNA 文库的形式与转录激活域融合，在酵母中 表达另一融合蛋白 AD-Prey。在同一宿主中，若两个蛋白能够互作，则 BD 与 AD 会联系在 一起，激活下游报告基因的表达8。因此，构建高质量的酵母双杂交文库对于寻找与已知蛋 白互作的蛋白，进而研究互作蛋白的功能及各基因之间的调控关系具有重要的意义。55本研究以早实枳花芽分化时期的新梢及花器官为实验材料
10、，从中分离得到大量纯度较高 的 RNA，通过利用 SMART 技术和同源重组的方法，构建了早实枳组织特异的酵母双杂交 cDNA 文库，并对文库质量进行了检测，为进一步分离与成花基因相互作用的调节因子奠定 了基础，也为揭示各成花基因之间的调控关系及分子机理提供了一定的理论依据。1材料与方法601.1 材料1.1.1实验材料构建 cDNA 文库所用的材料为早实枳花芽分化时期的新梢及盛花期的花，早实枳植株 于 2006 年定植于华中农业大学园艺林学学院实验基地，采后的材料用液氮速冻后保存于-80C 备用。651.1.2菌株及质粒酵母菌株 AH109、AD 克隆载体 pGADT7-Rec2 均购于 C
11、lontech 公司酵母文库试剂盒。1.1.3主要试剂植物组织总 RNA 提取试剂盒 RNAiso plus 购自 TaKaRa 公司；mRNA 纯化试剂盒 Oligotex mRNA Mini Kit (Cat. No 70022)购自 QIAGEN 公司；酵母双杂交构建试剂盒 Match markerTM70Library Contruction & Screening KitsUser Manual 购自 Clontech 公司；酵母培养基 YPDA 及 SD 营养选择性培养基分别自于 BD 公司和 Simga 公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇等均购 自于国药集团化学试剂有限公司，为分析纯。
12、1.2 实验方法1.2.1 早实枳特定组织总 RNA 的提取75取早实枳特定组织材料 1.0-2.0g，用液氮研磨至粉末状，后加入 1ml RNA plus 试剂，振 荡混匀后室温静置 5min，4，12000g 离心 15min。转移上清到新的离心管中，加入 15- 7 -80859095100105110115体积的氯仿，用力震荡混匀，室温静置 5min，4，12000g 离心 15min。转移上清至新的离心管中，加等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在室温静置 10min，4，12000g 离心10min。丢弃上清，加入 200l DEPC 处理水溶解沉淀，同时加入 2U DNase，混
13、匀后置于 37 30min 消化 DNA。加入等体积氯仿抽提去除 DNase，4，12000g 离心 15min。转移上 清至新的离心管中，加等体积的异丙醇重新沉淀 RNA，4，12000g 离心 10min。加入 600l75乙醇清洗沉淀，后弃净酒精，加入 50l DEPC 处理水溶解沉淀，取少量 RNA 用 UV0080D 紫外分光光度计检测其浓度、纯度等，并用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，确定 无降解，剩余样品保存于-80备用。1.2.2mRNA 的纯化与双链 cDNA 的合成将 1000ug 的总 RNA 用 RNase-free 水稀释至 500l，置于 1.5ml 离
14、心管中，65温浴 5min。 向离心管中加入 500l 37预热的 Buffer OBB 和 85l Oligotex suspension，用枪吸打混匀。70水浴 3min 以打断 RNA 的二级结构，后放在室温 l0min。使 Oligotex 微粒上的 OligodT30 与 mRNA 的 polyA 充分杂交。室温 12000g 离心 2 min，使 Oligotex: mRNA 沉淀，并小心吸 去上清，加 400l Buffer OW2，用枪吸打重新悬浮 Oligotex:mRNA 沉淀，室温 12000g 离心1 min，后弃上清。加入 20l 70预热的 Buffer OEB 到
15、离心管中，室温 14000g 离心 2 min。 将上清转移至新的离心管中，-80保存备用。依据 Match markerTM Library Contruction 构建试盒说明书逆转录第一链：在一无 RNase 的 0.2ml 离心管中加入 6l mRNA，1l CDS III primer，1l Deionized H2O，轻轻吸打混匀 后 72 温浴 2 min，取出后迅速放于冰上。依次加入以下成份：3.0l 5First-Strand buffer，1.0l 20mM DTT，1.0l dNTPs (10 mmol/L)，1.0 l M-MLV 逆转录酶。吸打混匀后置于 PCR 仪中
16、 42，10min。最后加入 1.0l SMARTIII Oligonucleotide，混匀后 42温浴 1h，75 10min 终止反应。室温冷却后加入 1l RNaseH，混匀后 37消化 20min，取出后保存于-20备用。在二链合成反应的 0.2mL 离心管中依次加入 2.0l Frist-stand cDNA，Deionized H2O80l，2.0l 50dNTP Mix，10l 10PCR Buffer，2.0l 50Advantage 2 Polymerase Mix，2.0l5PCR Primer，2.0l 3PCR primer。吸打混匀后短暂离心，进行以下 PCR 扩增
17、：94， 5min，95,35s，68，90s，25 个循环。取 5l PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测双链合成 情况。剩余的 PCR 产物用 CHROMA SPIN TE-400 Column 过滤，去除小片段后，用无水 乙醇沉淀、浓缩，取 5l 在 1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。1.2.3 酵母感受态的制备向 10ml 灭菌离心管中加入 3ml 1YPDA 液体培养基，挑取 AH109 单菌落于其中，置 于 30振荡培养 8h。取 5l 培养菌液到 50ml1YPDA 培养基中，在 250ml 三角瓶中 30250rpm 振荡培养 16-20h 至 OD600=0.15-0.3。摇好
18、的菌液 700g 室温离心 5min，弃上清，加 入 100ml 1YPDA 培养基重悬细胞，30振荡培养 3-5h 至 OD600=0.4-0.5。700g 室温离心5min，弃上清，加入 60ml 灭菌去离子水悬浮细胞，700g 室温离心 5min，弃上清，用 3ml 1.1 TE/LiAc 溶液悬浮细胞，分装成两管，12000g 室温离心 15s，弃上清，每管用 600l 1.1 TE/LiAc 溶液悬浮备用。1.2.4 cDNA 转化酵母 AH109 感受态根据 Match markerTM Library Contruction & Screening KitsUser Manual
19、 的步骤，在一个 无菌预冷的 15-ml 离心管加入下列试剂 20l ds cDNA，6l PGAD-Rec，20l Herring Testes精品论文120125130135140Carrier DNA， 混匀后加入 600l 新鲜制备的感受态细胞，轻轻震荡混匀，加入 2.5mlPEG/LiAc 溶液, 涡旋混匀，30C 温育 45min，每隔 15min 混合一次细胞。加入 160 l DMSO， 混合后 42C 温浴 20min。700 g 离心 5min，弃上清，加入 3ml YPD Plus 液体培养基重悬细 胞，30C 震荡温育 90min。700 g 离心 5 min，弃去上清
20、，用 20ml 0.9% Nacl 溶液重悬细胞。 将菌液均匀涂布于 SD/-Leu 培养基上，每个平板上涂 180l，封好的平板置于 30C 暗培养3d 至长斑。1.2.5 文库菌体收集将长斑的平板置于 4C 条件冷却 3-4h，后将所有菌落收集于含 25%甘油的 YPDA 培养 基中，并用血球计数析对收集的菌液计数，调节文库菌液的浓度，使其大于 2107 个细胞/ml， 然后将混匀的菌液分装入 2ml 离心管中，每管 1ml，置于-80C 保存备用。同时取一部分悬 浮菌液做 1/10、1/100 梯度稀释，每个梯度取 100l 涂布于 SD/-Leu 固体培养基上，30C 暗 培养 3d，
21、对每个培养基上的单菌落个数时行统计，从而用于估算文库容量。2结果与分析2.1 早实枳特定组织总 RNA 的提取及 mRNA 的分离纯化选取花芽分化时期的早实枳新梢及花器官（图 1）进行总 RNA 的提取，提取的总 RNA 经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，其纯度为 A260/A280=1.954，浓度为 1.233ug/l； 同时完整的 RNA 在凝胶电泳中呈现出清晰的 28S 和 18S 两条主带（图 2a）。表明所提取的 总 RNA 质量较好，基本上无蛋白和 DNA 污染，未出现降解现象，确定所提取的 RNA 符合 建库要求。图 1 早实枳新梢及其花器官形态Fig.1 Morpholo
22、gy of new shoot and floral organ in precocious trifoliate orange经 mRNA 纯 化 试 剂盒分 离纯化 后， mRNA 纯度为 OD260/280 为 1.932 ，符 合1.8OD260/2802.0 的标准；且在琼脂糖凝胶上仍可看到微弱的弥散的条带（图 2b），表明mRNA 纯化效果较好，质量合格，可继续进行下一步实验。145150155160图 2 早实枳总 RNA 及纯化后的 mRNA，（a）早实枳总 RNA；（b）纯化后的 mRNAFig.2 Total RNA and purified mRNA of precoci
23、ous trifoliate orange, (a) Total RNA; (b) Purified mRNA2.2 双链 cDNA 的合成及纯化反转录后的第一链 cDNA 经 LD-PCR 扩增获得双链 cDNA，所生成的条带成明显的弥散 瀑布状分布（图 3a），说明 mRNA 得到了充分的反转录，片段长度分布于 200-4000bp 之间， 表明早实枳 mRNA 成分复杂。经 CHROMA SPIN TE-400 Column 对双链 cDNA 进行纯化， 其中的一些小片段基本被去除（图 3b）。图 3 早实枳双链 cDNA 纯化前后电泳检测，（a）纯化前；（b）纯化后，M：MarkerF
24、ig.3 Double strand cDNA of precocious trifoliate orange before and after purified, (a) Before purified; (b) After purified2.3 文库的鉴定及插入片段的检测根据在 SD/-Leu 不同稀释平板上重组子的数目（图 4），对所构建文库容量进行了检测， 测得文库容量为 1.61106，文库滴度为 1.84108pfu/ml。图 4 酵母文库滴度检测，（a）1:1000 稀释；（b）1:10000 稀释Fig.4 Determination of the plaque titer
25、of the library, (a) The dilution ladder was 1:1000; (b) The dilution ladder was 1:10000165170从中随机挑取几个单克隆菌进行菌液 PCR 检测，发现重组到质粒 PGADT7-Rec 载体上的 cDNA 片段大小主要分布于 400-2000bp 之间（图 5）。这一结果表明所建早实枳文库中 的 cDNA 片段大小均匀，较适合进行后续的酵母双杂交筛选实验。图 5 早实枳特定组织 cDNA 文库 PCR 扩增产物电泳检测，M：MarkerFig.5 PCR amplification of the insert
26、 fragments of cDNA library in precocious trifoliate orange1751801851901953讨论文库构建是现代分子生物学研究的基础，有效利用所构的文库并尽可能提高后续工作的 效率是构建文库时所需考虑的重要方面9。目前酵母双杂交已被广泛地运用于筛选与目的蛋 白相互作用的蛋白质，并一直被认为是最为灵敏和可信的方法之一10。构建酵母双杂交文库的过程中，所提取 RNA 的质量是决定文库质量的关键因子，它直 接决定着 cDNA 序列的完整性及文库的多态性11。因此，在进行 RNA 提取中应尽可能选用 新鲜的组织材料，所使用的器材应用 0.1%的 D
27、EPC 水过夜处理，然后经高压灭菌；整个提 取过程动作要迅速，尽可能减少材料及 RNA 在空气中的停留时间12。本实验所提取的 RNA 经分光光度计测定及电泳检测，浓度及 OD260/280 均符合要求，28S 与 18S 两条主带均清 晰可见，mRNA 经 Oligotex mRNA Mini Kit 试剂盒纯化后仍能看到微弱的条带，未发生降解， 表明此样品可用于文库构建。经 LD-PCR 扩增后获得的片段长度在 0.5-3.0kb 之间，多态性 好，适合与 PGADT7-Rec 线性化载体连接，后期的文库质量检测结果也证实了这一点。酵母双杂交文库构建中所用感受态细胞的活性是另一关键因素，较
28、高活性的感受态细胞 可以最大效率地吸收 ds cDNA，进而保证文库的丰度13。因此，在构建文库时，应严格控 制每次摇菌的时间，并保证每一阶段适当的 OD 值，同时进行转化的过程中要尽可能降低背 景的产生，并保证不能有表面活性剂的成分黏在器皿内表面14。从本实验的鉴定结果来看， 所构建的双杂文库达到了酵母双杂交研究所要求的标准，可以用来进行目的基因的互作蛋白 筛选，为探索各成花相关蛋白之间的互作及调控关系提供了依据，也为全面揭示柑橘成花机 理及复杂的成花调控网络奠定了坚实的基础。致谢感谢教育部博士点基金：用 Raman 光谱研究 PtFLC 基因的选择性剪切及其童期调控中 作用机制（20090
29、146110009）和教育部新教师基金：柑橘成花关键基因 PtELF5 互作蛋白的 分离及其功能鉴定（20110146120027）的资助。参考文献 (References)2001 Bowman JL, Smyth DR, Meyerowitz EM . Genes directing flower development in Arabidopsis. Plant Cell,1989, 1: 37-52.2 Becker A, Theissen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development a
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