甲基百里酚蓝-铜(Ⅱ)络合物与白蛋白的相互作用.doc

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1、精品论文甲基百里酚蓝-铜()络合物与白蛋白的相互作用丁飞 1，宋卫堂 1，林娟 2，高黎 1，蒋志强 31 中国农业大学理学院，北京 (100094)2 中国矿业大学化工学院，江苏徐州 (221008)3 攀枝花学院生物与化学工程学院，四川攀枝花 (617000)E-mail：摘要：在模拟动物体生理条件下，采用荧光光谱、紫外-可见光谱研究了甲基百里酚蓝-铜 ()络合物与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。实验表明，MTB-Cu()络合物与 BSA 之间为 一形成复合物的静态猝灭过程。根据 Stern-Volmer 方程和 Lineweaver-Burk 方程求出了其结 合常数(295K: 3.4

2、49105Lmol-1; 310K: 2.792105Lmol-1)和热力学参数(H10.71kJmol-1;S69.69JK-1/69.71JK-1; G31.27kJmol-1/32.32kJmol-1)，证明二者主要以静电力作 用，该过程是一个熵增加、Gibbs 自由能降低的自发超分子过程。依据 Fster 理论求出了结 合距离 r2.25nm，阐明了猝灭机制是通过能量转移产生的。并用同步荧光光谱考察了 BSA 构象的变化。关键词：甲基百里酚蓝-铜()络合物，牛血清白蛋白，荧光光谱，紫外-可见光谱 中图分类号：O657.31. 引言目前，染料、药物、金属离子与蛋白质的作用已有较多报道1-

3、6，但有关染料-金属络合 物与蛋白质相互作用的研究报道相对较少。甲基百里酚蓝(Methylthymol blue，简称 MTB) 是三苯甲烷类染料，常用作络合滴定指示剂。我国学者王兴明等7用紫外-可见吸收光谱研 究了 MTB-Zn()络合物与 BSA 的相互作用，但用荧光光谱法研究 MTB-Cu()络合物与 BSA 的作用机理目前未见报道。本实验用荧光光谱、紫外-可见光谱在模拟动物体生理条件下，研究了 MTB-Cu()络合 物与 BSA 结合反应的光谱特征，探讨了 MTB-Cu()络合物对 BSA 的荧光猝灭作用，求出 了结合常数、结合位置、作用力类型、热力学参数等，并用同步荧光光谱考察了 B

4、SA 构象 的变化，为进一步研究生物大分子 BSA 的结构、性质等提供了实验和理论根据。2. 实验部分2.1 仪器与试剂RF-5301PC 型荧光分光光度计(日本 Shimadzu 公司)，UV-2501PC 型紫外-可见分光光度 计(日本 Shimadzu 公司)，pHS-3C 型精密 pH 计(上海雷磁仪器厂)，Milli-Q 超纯水系统(美国 Millipore 公司)，SYC-15 型超级恒温水浴(南京桑力电子设备厂)。牛血清白蛋白(美国 Sigma 公司，纯度98)溶液：6.710-6molL-1，置于 14冰箱中 保存；甲基百里酚蓝(上海楷洋生物技术有限公司)溶液：2.010-5m

5、olL-1，使用时稀释至所需 浓度；CuCl2(北京华腾化工有限公司，纯度99)储备液：1.510-5molL-1。所用试剂均为 分析纯，实验用水为 Milli-Q 超纯水，经检测均无荧光杂质。2.2 实验方法在 10mL 比色管中加入 1.0mLBSA 储备液，然后加入不同浓度的 MTB-Cu()络合物溶 液，以 pH4.25 的 Britton-Robinson 缓冲溶液定容至刻度后摇匀，恒温静置一定时间，在- 1 -RF-5301PC 型荧光分光光度计上以 ex280nm 记录荧光发射光谱、同步荧光光谱。以空白缓冲溶液作参比，测定与白蛋白物质的量之比为 11 的 MTB-Cu()络合物的

6、 紫外-可见吸收光谱。3. 结果与讨论3.1 三元体系的紫外-可见吸收光谱图 1 所示为 pH4.25 时体系的紫外-可见吸收光谱。由图可见，MTB(曲线 1)的最大吸 收峰为 436nm，MTB-BSA(曲线 2)的最大吸收峰为 438nm，MTB-Cu()(曲线 3)的最大吸收 峰在 448nm，且在 601nm 处有微弱吸收，而 MTB-Cu()-BSA(曲线 4)的一个吸收峰在 448nm 处，另外在 611nm 处出现了一个新的较强吸收峰，同时在 611nm 处 MTB、MTB-BSA、 MTB-Cu()吸收曲线的吸光度之和远小于 MTB-Cu()-BSA 三元体系的吸光度，此外，与

7、 MTB-Cu()吸收曲线相比，MTB-Cu()-BSA 曲线在 448nm 处有显著的减色效应，因此， 体系中有 MTB-Cu()-BSA 三元络合物形成。3.2 MTB-Cu()与 BSA 作用的荧光光谱白蛋白分子中因含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸残基而产生较强的内源荧光8， 图 2 是 MTB-Cu()络合物与 BSA 作用的荧光光谱。随着 MTB-Cu()络合物浓度的增加， BSA 的荧光强度有规律地降低，最大发射峰稍有蓝移，说明 MTB-Cu()对 BSA 的内源荧 光有猝灭现象，MTB-Cu()与 BSA 之间存在相互作用。- 8 -0.250.2030012500.15A0

8、.10(4)200IF 15071000.050.00(1)(2)(3) 500400 500 600700 / nm图 1 紫外-可见吸收光谱Fig. 1 Ultra-violet absorption spectroscopy (1)MTB, (2)MTB-BSA, (3)MTB-Cu(), (4)MTB-Cu()-BSAc(MTB)3.010-5molL-1, c(BSA)1.3410-6molL-1, c(Cu2+)3.010-5molL-1300350400 / nm图 2 MTB-Cu()和 BSA 作用的荧光光谱Fig. 2 Effect of MTB-Cu() on the f

9、luorescence ofBSAc(BSA)6.710-7molL-1,c(MTB-Cu()10-6molL-1, 17: 0, 0.4, 0.8, 1.2,2.0, 2.4, 3.23.3 MTB-Cu()与 BSA 的相互作用荧光猝灭作用因机制不同分为动态猝灭、静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂与荧光物质的激 发态分子之间所发生的相互作用过程，可用 Stern-Volmer 方程9来描述荧光体与荧光猝灭剂 分子间的相互作用：IF0= 1 + KSV Q = 1 + kq 0 QI(1)FF其中，IF 是有猝灭剂时 BSA 的荧光强度，I 0为无猝灭剂时 BSA 的荧光强度，Q是猝灭剂浓度，KSV

10、 是动态猝灭常数，单位是 Lmol-1，它反映了生物大分子与荧光猝灭剂分子彼此扩 散和相互碰撞到达动态平衡时的量效关系，kq 是动态荧光猝灭速率常数，单位是 Lmol-1s-1， 它反映了体系中分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响，各类荧 光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为 2.01010Lmol-1s-1；0 是无猝灭剂 时荧光分子的平均寿命，生物大分子的荧光平均寿命约为 10-8s。静态猝灭作用是指荧光体分子与荧光猝灭剂分子之间借助分子间力，彼此结合形成了具 有一定结构的超分子复合物，而导致荧光体荧光强度减弱的现象，用 Lineweaver-Burk

11、方程 10描述：1= 1 +1(2)I 0 II 0KI 0 QFFFLB F其中，KLB 为静态荧光猝灭过程中复合物的形成常数，单位是 Lmol-1，它反应了在静态猝灭 过程中生物大分子和荧光猝灭剂分子的结合反应达到平衡时的量效关系。在 295K、310K 温度下，试验了不同浓度 MTB-Cu()络合物对 BSA 荧光强度的影响， 由实验数据绘出 BSA 的 Stern-Volmer 曲线和 Lineweaver-Burk 曲线(图 3、图 4)，并对实验数 据线性拟合得到线性方程、相关系数(表 1)，进而可得 KSV、KLB 等参数(表 2)。4.03.53.00/ I F2.5-1295

12、K310K0(IF -IF )0.010310K295KI F2.01.51.00.0050.250.50 1 2 3 4 5 6106 MTB Cu / mol L1图 3 MTB-Cu()对 BSA 的 Stern-Volmer 曲线Fig. 3 Stern-Volmer curves of BSA by MTB-Cu()106 MTB Cu / L mol 1图 4 MTB-Cu()对 BSA 的双倒数曲线Fig. 4 Double-reciprocal curves of BSA byMTB-Cu()试样Examples表 1 线性方程和相关系数Table 1 Regression e

13、quations and correlation coefficient线性方程Regression equations相关系数R05Fig. 2 (295K)IF /IF0.92665.25910MTB-Cu()0.994405Fig. 2 (310K)IF /IF0.91864.1510MTB-Cu()0.99410-1-8-1Fig. 3 (295K)(IF IF) 0.003691.0710MTB-Cu()0.99750-1-8-1Fig. 3 (310K)(IF IF) 0.003591.28610MTB-Cu()0.9949表 2 结合反应常数Table 2 The binding

14、 constants of BSA with MTB-Cu()温度T/K动态猝灭常数105KSV/(Lmol-1)动态猝灭速率常数1013kq/(Lmol-1s-1)静态猝灭常数105KLB/(molL-1)2955.6765.6763.4493104.5184.5182.792由表 2 可知，MTB-Cu()络合物与 BSA 结合反应的 kq 值远大于最大动态荧光猝灭速率常数 2.01010Lmol-1s-1，表明 MTB-Cu()对 BSA 内源荧光的猝灭过程不是由扩散和碰撞 引起的动态猝灭，而是形成复合物的静态猝灭过程。并且静态猝灭常数 KLB 随温度升高而减 小，更进一步证明该过程是静

15、态猝灭。3.4 MTB-Cu()与 BSA 的作用力类型有机小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、静电力、氢键和 Van der Waals 力11。当温度变化不大时，MTB-Cu()络合物与 BSA 结合反应的焓变 H 可 看作常数，由热力学公式(3)、(4)可以求得有关热力学参数，计算结果列于表 3。ln KH S=+(3)RTRG = H T S = RT ln K(4)表 3 结合过程的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of BSA with MTB-Cu()温度 T/K焓变 H/ (kJmol-1)熵变 S/ (JK-1)G

16、ibbs 自由能变 G/ (kJmol-1)29531010.7169.6931.2769.7132.32Ross 等12根据大量实验结果，总结出了判断生物大分子与小分子结合力性质的热力学 规律：H0，S0 疏水力H0，S0 氢键和 Van der Waals 力H0，S0 静电力由表 3 的数据看出，MTB-Cu()络合物与 BSA 之间以静电力作用为主，该过程是熵增加、Gibbs 自由能降低的自发超分子作用过程。3.5 MTB-Cu()与 BSA 的作用距离根据 Fster 理论，当给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱有足够的重叠，并且给体与 受体之间最大距离不超过 7nm 时，发生非辐射能

17、量转移现象，导致荧光猝灭13。Fster 理 论中，能量转移效率 E、给体和受体之间的结合距离 r、临界能量转移距离 R0 与重叠积分 J 之间的关系是：R6E = 0 0R6 + r 66252(5)4R0 = 8.8 10(KJ = DA n J )(6)(7)F ( )( ) 4 FD ( )I0E = 1 I F F(8)式中 R0 是转移效率为 50%时的临界距离，K2 是偶极空间取向因子， 是给体的荧光量子产率，n 是介质折射常数，FD()是荧光给体在 波数为 时的荧光强度，A()是受体在波数 为 时的摩尔吸收系数。图 5 所示为 BSA 的荧光光谱和 MTB-Cu()络合物的紫外

18、- 可见吸收光谱。将光谱重叠部分分割成极小的矩形，上 述实验条件下，偶极空间取向因子 K22/3， 介质折射常数 n1.336，给体的荧光量子产率 0.1514 ，求 得光 谱重叠积 分 J 300250200IF 150100500250(1)(2)300 350 400450 / nm0.150.10A0.050.001.02810-14cm3Lmol-1 ， 临界距离 R0 2.56nm，进而由杨频等15提出的方法，求得 E68.23，结合距离 r2.25nm。BSA 的 荧光主要来自第 212 位色氨酸残基，该残基位于 BSA 的疏水腔内，所求得的 r 值为结合 部 位 与 该 残 基

19、 之 间 的 距 离 ，图 5 BSA 的荧光光谱和 MTB-Cu()的紫外-可见吸收光谱Fig. 5 The fluorescence spectra of BSA and the Ultra-Violet absorption spectra of MTB-Cu() c(BSA)6.710-6molL-1, c(MTB-Cu()6.710-6molL-1r 值小于 7nm，符合 Fster 能量转移理论，说明 MTB-Cu()络合物与 BSA 之间存在非辐射 能量转移。并且结合距离 r 小于能量转移效率为 50%时的临界距离 R0，说明非辐射能量转 移引起蛋白质荧光发射峰猝灭的几率比静态猝

20、灭的大16。3.6 MTB-Cu()与 BSA 作用的结合常数求取有机小分子和蛋白质分子结合常数 KA、结合位点数 n 的方法较多，其中 Scatchard 法是经典的方法，但应用此法时必须已知实验中游离态有机小分子的浓度，这个值往往很难 知道，目前一般用已知的有机小分子总浓度来代替，因此就带来一定误差，特别是对于与蛋白质结合较强的有机小分子而言，结果 将与实际情况相差较大17。文献18提出了 改进的公式：0.60.4F F F0.20.0295K310K(I0 I)(I0 I )-0.2lg F F = nlg K+nlgD nP F F -0.4IAttI0FFFF F式中，Dt是溶液中有

21、机小分子的总浓度， Pt是蛋白质的总浓度。根据这一公式，以 lg(I 0I )/I 对 lgMTB-Cu()-0.6lg(I 0-I )/I -0.8-1.000-6.6 -6.4 -6.2 -6.0 -5.8 -5.6 -5.4-5.2F FFlgMTB Cu BSA(I 0 I ) / I 0 000图 6 lg(IF IF)/IF对 lgMTB-Cu()BSA(IF IF)/IF 作图(假设上式中 n1)，可求得 MTB-Cu()络合物与蛋白质分子的BSA(IF IF)/IF 的关系图Fig. 6 Plots of lg(I 0I )/I vs. lgMTB-Cu()FF F结合常数 K

22、A 与结合位点数 n。结果列于表 4。BSA(IFF F0I )/I 0表 4 结合常数和结合位点数Table 4 The binding constants of BSA with MTB-Cu()温度线性方程相关系数表观结合常数结合位点数T/KRegression equationR105KA/(Lmol-1)n295y6.071.06x0.997211.751.06310y5.8541.04x0.99137.1371.04从表 4 可知，MTB-Cu()络合物与 BSA 形成 11 的三元复合物，表观结合常数 KA 在105 数量级，说明 MTB-Cu()与 BSA 有强相互作用，二者之

23、间属于高亲合作用范畴19，且KA 随温度升高而减小，这是因为 MTB-Cu()-BSA 复合物的稳定性随温度的升高而降低。3.7 MTB-Cu()对 BSA 构象的影响同步荧光光谱经常被用于探讨白蛋白中氨基酸残基微环境的变化。由 15nm 得到的 同步荧光光谱显示酪氨酸残基(Tyr)的光谱特征，而 60nm 同步荧光光谱表现出色氨酸残 基(Trp)的光谱特性。因氨基酸残基的最大发射波长与所在微环境的极性有关，所以，根据发 射波长的改变可以判断 BSA 氨基酸残基构象的变化20。35 = 15nm302520IF151050140305 IF20 = 60nm155 100300 320340

24、/ nm0340 350 360 370 380图 7 同步荧光光谱Fig. 7 Synchronous fluorescence spectra / nmc(BSA)6.710-7molL-1, c(MTB-Cu()10-6molL-1, 15: 0, 0.8, 2.0, 3.2, 4.4图 7 所示的是 15nm、60nm 时 BSA 随 MTB-Cu()络合物浓度变化的同步荧 光光谱。随着 MTB-Cu()络合物浓度的增加，Tyr 残基的最大发射波长蓝移了 4nm，而 Trp 残基的最大发射波长不变，说明在 MTB-Cu()影响下，Tyr 残基所处微环境的疏水性增加。 荧光强度降低表明

25、MTB-Cu()络合物使蛋白质分子伸展，降低了芳香氨基酸残基之间的能 量传递，使二者荧光强度降低21,22。4 结论MTB-Cu()络合物对牛血清白蛋白的内源荧光有猝灭现象，该过程是一个形成三元络 合物的静态猝灭过程。通过计算热力学参数，发现 MTB-Cu()络合物与白蛋白之间主要是 以静电力相互作用，熵增加是主要驱动力因素。根据 Fster 理论计算了 MTB-Cu()络合物 与白蛋白的结合距离，进一步说明猝灭过程主要是通过能量转移产生的。MTB-Cu()络合 物与白蛋白之间有强相互作用，且 MTB-Cu()络合物的加入改变了白蛋白 Tyr 残基的构象。 这为深入研究金属络合物与生物大分子的

26、作用机理提供了实验依据。参考文献1 朱铿, 童沈阳. 蛋白质与酸性铬蓝 K 相互作用的分光光度研究J. 化学学报, 1996, 54(6): 620-624.2 王海人, 肖忠柏, 宋功武, 等. 荧光素与牛血清蛋白作用的光谱研究与分析应用J. 分析测试学报, 2001,20(4): 45-46.3 TIAN J N, LIU J Q, HE W Y, et al. Probing the Binding of Scutellarin to Human Serum Albumin by CircularDichroism, Fluorescence Spectroscopy, FTIR, an

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35、tion between Methylthymol Blue-Cu()Complex and Serum AlbuminDing Fei1，Song Weitang1，Lin Juan2 ，Gao Li1，Jiang Zhiqiang31 College of Science，China Agricultural University，Beijing （100094）2 College of Chemical Engineering，China University of Mining and Technology，Xuzhou，Jiangsu（221008）3 College of Biol

36、ogy and Chemical Engineering，Panzhihua University，Sichuan，Panzhihua（617000）AbstractUnder the imitated physiological condition of animal body, the interaction of Methylthymol blue-Cu()complex with Bovine serum albumin(BSA) was studied by fluorescence spectroscopy and ultra-violet spectrum. The experi

37、ment results showed that combination reaction of MTB-Cu() and BSA is a staticquenching process. According to Stern-Volmer equation and double-reciprocal equation, the formation constants of them(295K: 3.449105Lmol-1; 310K: 2.792105Lmol-1) and the thermochemical parameters(H10.71kJmol-1; S69.69JK-1/6

38、9.71JK-1; G31.27kJmol-1/32.32kJmol-1) were obtained. The result suggested that the main binding force between MTB-Cu() and BSA iselectrostatic force, binding MTB-Cu() to BSA is a spontaneous supermolecular interaction in whichentropy increase and Gibbs free energy decrease. The binding distance(r 2.

39、25nm) betweenMTB-Cu() complex and BSAwere obtained by Fsters theory, and the interaction may beinterpreted by energy transfer mechanism. The effect of MTB-Cu() on the conformation of BSA wasanalyzed by synchronous fluorescence spectrometry.Keywords：Methylthymol blue-Cu() complex，Bovine serum albumin，Fluorescence spectroscopy，Ultra-violet spectroscopy