应用 con A 来检测大肠杆菌的无线磁传感器1.doc

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1、精品论文应用 con A 来检测大肠杆菌的无线磁传感器1陆庆祝，林海兰，蔡青云 湖南大学化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙 (410082) Email: 摘要：本文介绍了一种无线无源的直接测量大肠杆菌（E. coli）的磁弹性传感器。我们在这种传感器表面先修饰一层聚亚胺酯，然后再用涂膜法均匀地涂上羧基化的甘露聚糖。con A 能够与传感器上的甘露聚糖结合，而 con A 由于与 E. coli 能够发生免疫反应而紧密联结, 这样 E. coli 就能够紧密地连接到传感器上，造成传感器表面负载的质量增加，从而导致共 振频率下降，因此我们通过测量共振频率下降情况就能知道 E.

2、 coli 的浓度。由于传感器与 检测仪器之间没有任何物理连接，属于无线无源传感器，因此它能适用于细菌检测，例如检 验食品中的微生物。此外这种方法的另一个优点是检测灵敏度很高，实验结果表明该方法检 测下限相对其他方法要低第一些（例如石英晶体微天平）, 可以达到 60 cells/mL。由于我 们在测量时没有培养细菌，因此实验耗时比其他方法少一些。基于此，我们研究了可用于细菌早期诊断和快速分析的无线磁弹性传感检测新方法。关键词: 磁弹性传感器，con A，甘露聚糖，大肠杆菌，共振频率1.引言大肠杆菌是一种广泛存在的、危害性很广的致病性细菌。大肠杆菌O157 H7 是毒性 最强的食源性致病菌中的一

3、种。一旦通过食物或者水感染该菌, 将会引起出血性肠炎、溶血 性尿毒综合症等, 还有可能出现致命的综合并发症1, 每年由大肠杆菌O157 H7 引起医 疗花费和商品撤回引起的经济损失非常巨大的。 因此, 快速准确的检测食品中大肠杆菌 O157 H7 是非常必要的2。目前，检测大肠杆菌的方法很多，包括DNA和RNA探针技术 3,4、石英晶体微天平技术5、基于聚合酶链反应分析技术(PCR) 6,7、表面细胞质基因（组） 共振(SPR) 8,9、流体血细胞计数方法10,11、免疫磁场分离(ISM)分析12、声波阻抗生物传感 器13、微电机分析1416、生物发光试验17、原处杂交荧光(FISH)分析18

4、、激光技术19、基 于放大核酸序列试验(NASBA) 20等。这些方法虽然都有各自的优点，但是由于耗资大、耗 时长等原因而没有在临床上得到广泛的应用。传感分析作为一种新的分析技术和手段，由于其低能耗、低成本、检测快速、操作简 单，易实现小型化、远程分析、在线分析、活体分析等特点，在近半个世纪获得高速发展， 并相继有一批传感器投入商业使用。无线磁弹性传感技术是近10年发展起来的新兴传感技 术。在外加交变磁场中，磁性膜片受磁场激励产生磁矩，将磁能转换为机械能，并产生沿长 度方向的伸缩振动，即磁致伸缩（magnetostrictive）。当外加交变磁场的频率与磁性膜片的 机械振动频率相等时，磁片产生

5、共振，此时振幅最大，对应的振动频率为磁性膜片的共振频 率。当磁性膜片传感器的表面性质（质量负载、粘弹性等）发生变化时，其共振频率随之发 生改变。由于传感器材料本身是磁性的，其伸缩振动产生磁通，产生的磁通可由检测线圈探 测到，信号经放大后由外部仪器测定。磁弹性传感器中信号的激发与传送是通过磁场进行的， 传感器与检测仪器之间不需任何的物理连接，属于无线无源（wireless, passive）传感器21。磁弹性传感器无线无源的特征使其在活体、在体、无损检测尤其微生物等领域具有广泛的应用前景。近年来，一些研究者已经研究了磁弹性传感器检测人体胃的pH值22、尿液中 葡萄糖含量23、CO224、湿度25

6、、有机杀虫剂中磷含量的测定26等。微生物在生长过程中1 本课题得到国家自然科学基金 01（20775024）,高等学校博士学科点专项科研基金（20050532024）的资 助。- 2 -会消耗溶液中的营养物，造成溶液的黏度变化，Huang等27利用磁弹性传感器测量黏度下降 引起的共振频率的变化来检测E. coli，但这种方法检测时间比较长（大约12 h）。本文也是应用磁弹性传感器来测量大肠杆菌。与前面的工作不同的是我们是基于细菌吸附到传感器表面引起的质量变化导致磁弹性传感器的共振频率变化来测量的。大肠杆菌在甘 露聚糖和con A这两个媒介28的作用下和传感器紧密地联结，从而改变磁片的负载质量，

7、通 过测量共振频率fr29的变化从而得出E. coli的浓度。这种方法不需要培养细菌，相对于其它 的方法而言检测速度比较快，耗时少。另外，E. coli与传感器的紧密连接意味着这种方法的 灵敏性很好，且检测限比较低，可以达到60 cells/mL。现在微生物检测需要无菌的环境，因 此磁弹性传感器应用前景巨大。2.实验部分2.1 实验仪器和试剂试剂：甘露聚糖和con A 购自杰辉生物长沙办事处。N-3-（二甲基氨基）丙基-N-乙基 碳化二酰亚胺（EDC）和 N 羟基丁二酰亚胺(NHS) 均购自Aldrich公司。聚亚氨酯Bayhydrol110购自Bayer公司。大肠杆菌O157:H7(Esch

8、erichia coli O157:H7)由湖南师范大学生命科学院 提供。牛肉膏，蛋白胨，胰蛋白胨，酵母浸粉和琼脂粉均购自北京奥博星生物技术有限责任 公司。Na2HPO4.12H2O、NaH2PO4.2H2O、NaCl、CaCl2 和醋酸锰均为分析纯。实验过程中使 用的水均为二次蒸馏水。大肠杆菌存储培养基为普通培养基，其中每100 mL培养基成分为：牛肉膏和NaCl 各0.5 g，蛋白胨1.0 g，二次蒸馏水100 mL，溶液的pH值为7.2，121 高压灭菌20 min。E. coli接 种到已灭菌的培养基中，恒温37 培养18 h，然后保存在于4 冰箱里中保存备用。采用 平板计数法确定E.

9、 coli浓度。con A溶液配制：将2.74 gNa2HPO4.12H2O、0.416 g NaH2PO4.2H2O和9 g NaCl配成100 mL溶液, 调pH为7.2, 高温灭菌, 将con A溶解到PBS中, 使其浓度为400 nM。 磁弹性材料：晶态铁基合金软磁材料，一种非晶态合金2826，其成份是Fe40Ni38Mo4B18。传感器的尺寸为22 mm6 mm28 m，涂膜前，传感器在空气中的共振频率约为102.5 kHz。仪器：磁弹性传感器的检测仪器。LRH-250A 型生化培养箱（广东省医疗器械）； DSX-280A手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Delta 320

10、型pH计（梅特勒-托利 多仪器（上海）有限公司）；超净工作台（上海医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（上海博讯实 业有限公司）。2.2 传感器的修饰和检测为了增加甘露聚糖与聚亚胺酯的氨基结合能力，提高其在溶液中的稳定性，先要对它进 行羧基化24修饰，使它其中的一个羟基变成羧基。修饰方法如下：将甘露聚糖500 mg, 1.35 mol/L 一氯醋酸钠7.4 mL, 10 mol/L NaOH 1 mL, 重蒸馏水1.6 mL加于25 mL的圆底烧瓶中， 充分混匀后，室温搅拌反应7 h后加入1 mol/L 磷酸二氢钠2 mL, 并滴加6 mol/L 和1 mol/L的 HCl 调节反应液pH为5.2左右

11、。磁弹性传感器使用前先用丙酮超声清洗，再用二次水清洗多次。在空气中室温干燥后 将传感器两面均匀涂上10L浓度为50(w/v)的聚亚胺酯，置于120 C真空干燥箱中干燥2 小时使传感器表面形成一层牢固薄膜。聚亚胺酯膜一方面保护磁弹性材料不生锈，另一方面 为羧基化的甘露聚糖的固定提供亚甲基（-NH-）。其修饰路线见图1。精品论文测量时，我们首先在小试管中加入0.2 mL菌液、0.4 mL con A PBS缓冲溶液和1 mL二次蒸馏水，然后把修饰后的传感器放入小试管中，最后将小试管放在线圈里面，恒温37 水 浴测量。测量的示意图见图 2。图 2(a)表示传感器首先修饰一层聚亚胺酯，然后再涂上一 层

12、羧化的甘露聚糖。实验过程中磁片上涂的甘露聚糖的活性部位与检测液中的con A结合， 大肠杆菌表面的O-抗原与con A发生免疫反应紧密相连28，这样E .coli便能牢固的吸附到传 感器表面，即甘露聚糖和con A成为E .coli与传感器连接的桥梁，从而增加磁片的负载质量， 引起传感器共振频率的降低。通过测量共振频率fr29的变化就可以知道E. coli的浓度。每次 试验都重复六次。在测量过程中磁弹性传感器置于线圈之中。激发线圈、检测线圈及直流偏置线圈共用同 一个线圈30。传感器的激发、信号放大与检测、数据储存及显示等将由一台自行设计制作 的仪器完成。仪器可由 RS232 接口与外部电脑连接

13、，如图 2 所示。3.结果与讨论3.1 传感器的响应本文测量是基于质量变化引起传感器的共振频率改变机理。我们首先在传感器修饰一层 聚亚胺酯，然后再涂上一层羧化的甘露聚糖。实验一开始就将修饰的传感器放入检测溶液中。 实验过程中传感器表面的甘露聚糖与测量液中的con A成为E. coli与传感器连接的桥梁28， 增加了传感器的负载质量，通过测量共振频率fr29的变化（f）和平板计数法就可以准确知 道f 与E. coli的浓度之间的关系，从而达到检测的目的。大肠杆菌生长需要糖类、蛋白质等营养物质, 在检测溶液中加入这类物质能够使大肠杆 菌快速生长, 在这里我们来检测普通培养基对传感器响应的影响。由图

14、 3可见, 对于相同浓 度的E. coli, 不加培养基和加培养基传感器共振频率的变化量(f)相差很大, 我们可以得出 结论：加入培养基反而会干扰测定。原因可能是大肠杆菌在测量过程中会消耗营养物质引起 溶液黏度的下降，根据黏度方程31 我们知道黏度下降会引起fr的上升，这与传感器质量增加 导致fr的下降的变化趋势相反，所以加入培养基反而不利于测量，因此后面的实验我们选择 不加培养基。甘露聚糖是一种多糖，它能与 con A 发生特异性结合，而大肠杆菌能与 con A 发生免疫 反应31，这就意味着甘露聚糖和 con A 可能会有利于大肠杆菌在传感器表面的吸附。在这里 我们讨论了甘露聚糖和 con

15、 A 对测量的影响。对传感器表面的修饰我们分两种情况，第一种 情况是磁片只涂聚亚胺酯，第二种情况是磁片先涂聚亚胺酯再涂修饰的甘露聚糖。我们在测 量时加 0.2 mL 菌液, 0.4 mL PBS 缓冲液, 1 mLH2O。从图 4 我们可以看出甘露聚糖和 con A 在大肠杆菌的测量中起了一个很大的促进作用，当细菌浓度是 8.3105 cells/mL 时，没有 涂甘露聚糖的传感器的f 大约是 80Hz，而涂了甘露聚糖f 是 250 Hz 左右，对于其他的细 菌浓度，涂不涂甘露聚糖的频移f 相差很大，因此我们可以得出一个结论，甘露聚糖能够 有利于磁弹性传感器测量大肠杆菌，提高了磁弹性传感器的灵

16、敏度。其原因是甘露聚糖的活 性部位能够与 con A 结合，大肠杆菌表面的 O-抗体与 con A 抗原结合28，这样大肠杆菌就 紧密地吸附在修饰甘露聚糖的传感器表面，因而提高测量的灵敏度23。此外由于细菌没有 经过培养，我们测量的速度比较快，每个样品大概 4 h 就可以完成。在后面的实验中我们都 选用修饰甘露聚糖的磁片进行实验。甘露聚糖和 con A 结合需要 Ca2+和 Mn2+的参与28。但 Mn2+一方面是重金属离子对大肠 杆菌生长不利，另一方面高浓度的无机盐不利于细菌生长繁殖，因此在这里我们还要探讨- 12 -Ca2+、Mn2+浓度对磁弹性传感器测量大肠杆菌的影响，以便找出 Ca2+

17、、Mn2+的最佳浓度。 实验测量的条件是：传感器表面修饰了甘露聚糖，测量时除了加了适量的 10 mmol/L Ca2+、Mn2+溶液外，还加 0.2 mL 菌液, 0.4 mL PBS 缓冲液,1 mLH2O。从图 5 可以看出，低浓度的Ca2+、Mn2+（低于 0.303 mM）能够促进测量，主要起促进作用；而高浓度的 Ca2+、Mn2+则 抑制细菌的生长从而降低磁弹性传感器的灵敏度。图 5 表明在这个实验中 Ca2+、Mn2 的最 佳浓度大约是 0.303 mM。3.2检测 E. Coli综合前面培养基、甘露聚糖、con A 和 Ca2+/Mn2+浓度四个因素的影响, 在这里我们选择 最佳

18、条件测量不同浓度细菌的频移情况, 即不加培养基、选用修饰甘露聚糖的传感器、测量 液中加入 con A 和 0.303 mM Ca2+/Mn2+。 图 6 表示最佳条件测量的不同浓度细菌的频移情 况。从图中我们看出当细菌为 6.06109 cells/mL 时,f 可以达到 1.1 kHz, 细菌浓度 6.0101 cells /mL 和空白的（即检测液中不含 E. coli）频移f 相差大约 50 Hz, 因此我们可以说 这种测量方法的灵敏度很好, 测量下限可以达到 60 cells /mL。 图 6(b)是测量大肠杆菌的工 作曲线，只要知道频移f 就可以读出 E. coli 的浓度。测量E.

19、 coli的方法很多，虽然检测这种致病菌的传统方法35检测限低，能够在复杂样品中应用, 但是它们的以耗时和费力为特色，尤其是要获得一个确切的结果, 要花大约57 d 的时间。在这里我们主要把几种测量E. coli浓度的方法进行比较。检测粪大肠菌群的发酵 法33、滤膜法33 虽然具有原理简单、费用较低、利于推广的优点，但操作步骤繁杂、干扰 因素多，专一性差，需要确认实验，且检测周期较长，需 4872 h，不适于大量样品的分 析。酶底物法34虽然比较准确，但其技术性强，造价昂贵，且试验周期长（18-24 h）35、 聚合酶链式技术（PCR）同样由于造价昂贵在实际中无法大量推广使用。电化学阻抗免疫生

20、 物传感器可以用于快速检测E. coli，但是实验前需要进行培养，且需要与被检测物相连，因 此不适合活体分析。因此，通过对比我们发现，本实验采取的磁弹性传感器具有以下优点：实验所用的原料比较廉价；实验耗时相对的来说比较短；该方法比较准确，灵敏性高；检测下限低。4.结果与讨论本文应用磁弹性传感器来检测大肠杆菌, 利用甘露聚糖和 con A 这两个桥梁使大肠杆菌 紧密地吸附在传感器表面。我们通过实验发现选用不加培养基、在传感器表面修饰甘露聚糖、 在测量液中加入 con A 和 0.303 mM Ca2+/Mn2+溶液这四个条件时可以很好提高测量的灵敏度, 检测下限可以达到 60 cells/mL。

21、我们的结论意味着这种无线、无源的磁弹性传感器能够实现 廉价的、准确和快速地测量大肠杆菌等微生物。致谢感谢国家自然科学基金 01（项目批号：20075024）和高等学校博士学科点专项科研基 金（项目批号：20050532024）对本论文工作的资助；感谢美国宾夕法尼亚洲立大学 Craig A. Grimes 教授对磁弹性传感技术和磁弹性传感测定仪的友情提供，及学术上的讨论和帮助！精品论文参考文献1 Yu L S L , Uknalis J , Tu S. Immunomagnetic Separation Methods for the Isolation of Campylobacter Jej

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42、or was measured through magnetic field telemetry. A 1 m-thick layer of Bayhydrol 110 was applied to the cleaned sensors by dip-coating. This polyurethane-protected sensor was then coated with modified mannose. The binding of lectin concanavalin A (Con A) to the E. coli surface O-antigen favors the s

43、trong adhesion of the mannose modified sensor surface to E. coli by forming bridges between these two. As a result, the contact area between cell and the sensor surface that increases leads to rigid and strong attachment. Therefore, it enhances the binding between E. coli and the mannose, which resu

44、lts in the change of resonance frequency (f ) that can be detected. The lack of any physical connections between the sensor and the monitoring electronics facilitates aseptic operation, and makes the sensor platform ideally suited for monitoring bacteria from within, for example, sealed food contain

45、ers. And other advantages of this method are the lower detection limits (about 60 cells/mL) than others (such as quartz crystal microbalance biosensor) and the good sensitivity.Keywords: magnetoelastic sensor, lectin concanavalin A, mannose, Escherichia coli O157:H7, resonance frequency图表：图1 传感器的制备图

46、2 (a) 甘露聚糖磁弹性传感器；(b) 磁弹性传感器的测定仪及工作示意图：内有传感器的小试管放在一 个线圈中，仪器由RS232接口与外部电脑连接进行数据显示和保存。图 3 培养基（NB）的影响：(a)、(b)、(d)检测液中加入 1 mLNB，E. coli 的浓度分别是 9.71106 cells /mL，9.71108 cells /mL，9.711010 cells/mL； (c)、(e)、(f)不加 1 mL NB， E. coli 的浓度依次是 9.71106 cells/mL，9.71108 cells /mL，9.711010 cells/mL。con A 的最终浓度是 133nM/L，磁片只修饰 Bayhydrol 110,检测时加 0.2mL 菌液 和 0.4mL 含有 con A 的 PBS 缓冲液。图4 甘露聚糖和con A的影响: (a)、(b)、(d)传感器没有修饰甘露聚糖，E. coli 的浓度分别是8.3105 cells/mL,8.3106 cells/mL, 8.3107cells/mL; (c)、(e)、(f) 传感器修饰了甘露聚糖, E. coli 的浓度依次8.3105 cells/mL,8.3106 cells/mL, 8.3107cells/mL apart; con A 的最综浓度是133 nM/L图 5 Ca2+ 和