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1、脱钙骨基质与左旋聚乳酸聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较?2O6?2007年3月第23卷第3期ChinJTrauma,March2007,Vo1.23,No.3?骨组织工程?脱钙骨基质与左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维对骨髓间充质干细胞黏附作用的比较李强何清义许建中曾琳罗飞周强【摘要】目的探讨左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维(PLLA/CPPf)与同种异体的脱钙骨基质(DBM)对BMSCs黏附作用的差异,为构建组织工程骨提供理想的支架材料.方法用扫描电镜观察两种支架材料的孔径;通过测吸水率比较其亲水性.将普通培养瓶培养的第3代BMSCs分别成骨诱导培养1周后,在体外分别与PLLA/CPPf和同种异体
2、的DBM复合构建组织工程骨,于构建后10h计算细胞黏附率,并用扫描电镜观察比较两种支架材料对BMSCs黏附作用的差异.构建后每天在相差显微镜下观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况,构建后第l0天再行扫描电镜观察BMSCs在两种支架材料上的生长情况.结果DBM的孔径明显较PLLA/CPPf的大,孔隙率高,体外构建后10hDBM组的细胞黏附率为(91.38.2)%,PLLA/CPPf组为(82.27.7)%,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05).DBM组于术后第3天网孔间出现细胞外基质,且随着时问的推移,基质变得稠密,而PLLA/CPPf的细胞外基质鲜见;第l0天的扫描电镜也证实D
3、BM组的细胞在支架材料上数量多,且细胞外的基质分泌较多.结论DBM较PIJ_A/CPPf更适于BMSCs的黏附生长,是理想的组织工程支架材料.【关键词】骨基质,脱钙;问充质干细胞;细胞黏附;左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维;骨组织工程Comparativestudyofadhesivenessof!lmAmimchatstemcellstotwokindsofscaffoldsofbonelisslleaIg.mnginvitro12Qing,HEQing-yi,XUJian-zhong,ZENGLin,LUO,ZHOUQing.OrthopaedicResearchCenter,SouthwestH
4、ospital,theMilitaryMedicalUn&ers,Chongqing400038,Ch/naCorrespondingauthor:XUJian-zhong.TeZ:00862368754164【Abstract】ObjectiveToexplorethedifferencesofadhesiveeffectsofhumanmesenchymalstemceHs(MSCs)onallogeneicdecalcifiedbonematrix(DBM)andcalciumpolyphosphatefibre/poly(Llac-ticacid)(PLLA/CPPf)inor
5、dertoaffordanidealscaffoldforbonetissueengineefing.MethodsThediameterandrateofthehohintheDBMandPI.I.A/CPPfwereobservedunderscanningelectronmicroscop(SEM).Thehydrophilicityofbothscaffoldswasevaluatedbycalculatingwaterabsorptionrate.ThethirdgenerationofMSCswasculturedonthetwokindsofscaffoldmaterials.a
6、ndtheadhesiverateswerecalcdated10hourslater.ThegrowthsituationofMSCsonthetwoscaffoldswasobservedunderphasecontrastmicroscopeeverydayandwithSEM10daysafterconstruction.ResultsThediameterandtherateofthehohofDBMweregreaterthanthoseofPI.I.A/CPPf.theadhesiveratesofDBMandPILA/CPPfwere(91.38.2)%and(82.27.7)
7、%respectively,therewassignificantdifferencebetweenthetwogroups.MorematrixwasobservedonDBMthanonPI.I.A/CPPfunderphasecontrastmicro-scopeandSEM.ConclusionDBMiSmoresuitableforadhesivenessandgrowthofMSCsthanPI.I.A/CPPf.Itisanidealscaffoldmaterialforbonetissueengineering.【Keywords】Bonematrix,decalcified;
8、Mesenchymalstemcells;celladhesion;Poly(Llacticacid)Calciumpolyphosphatefibre;Bonetissueengineering基金项目;国家自然科学基金资助项目(30300357);国家高技术研究发展计划重大资助项目(2003AA205020)作者单位:4037重庆,第三军医大学附属西南医院骨科,全军矫形外科中心李强(Email:lqlqlO,现在解放军第九十八医院南京军区显微骨科中心,313000)通讯作者:许建中,电话:023687541642007年3月第23卷第3期ChinJTrauma,March2007,Vo1.
9、23,No.3骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,BMSCs)因具较强的自我增殖的潜能,是目前认为最理想的骨组织工程种子细胞之一.而决定骨组织工程修复骨缺损疗效的另一大关键因素支架材料的种类繁多,各有利弊.因此,筛选出适于BMSCs黏附生长的支架材料是提高组织工程骨修复骨缺损疗效的关键所在.研究表明,脱钙骨基质(DBM)和左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤维(PLLA/CPPf)分别是天然和人工合成的骨组织工程理想的支架材料一.笔者通过比较该两种支架材料对BMSCs的黏附生长作用的差异,以期为BMSCs筛选出更为适宜的支架材料.1材料与方法1.1主要试剂和仪器淋巴细胞分离液(北京华
10、美生物工程公司),DMEM(Dulbeccosmodifiedeaglemedium)细胞培养基和优等胎牛血清(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Sigma公司),乙二胺四乙酸(美国Sigma公司),地塞米松(美国Sigma公司),维生素C(美国Sigma公司),B甘油磷酸钠(美国Sigma公司),AMRAY一1000B扫描电子显微镜(美国Amray公司),Laica相差显微镜(德国LAICA公司).1.2方法1.2.1BMSCs的分离与培养:骨髓来源于健康志愿者,参照文献5的方法,于髂后上嵴穿刺,用内含肝素钠200U,等渗盐水20IIll注射器抽取骨髓15IIll,沿管壁缓慢注入4支含
11、5IIll淋巴细胞分离液的10IIll离心管,进行梯度离心(2000r/min20rain),仔细吸取中间交界面云絮状薄层,加入DMEM培养基洗涤1次(1500r/min5min),加入DMEM完全培养基(含体积分数15%胎牛血清,青霉素钠100U/ml,链霉素100U/mO,吹打计数,以110/cm的密度接种于23瓶250ml玻璃培养瓶中.48h首次换液,以后第3天全量换液.孵育箱内培养条件:37C,体积分数5%CO,饱和湿度.1.2.2BMSCs的传代与诱导培养:待细胞长到瓶底80%面积时加入2.5g,/L胰蛋白酶5IIll,消化35min,加入DMEM完全培养基中止消化,移人50IIll
12、离心管,离心(1500r/min5min)后弃上清液,加入DMEM完全培养基,吹打计数,以110/em的密度传代培养,收集第3代细胞以110/em待用.将第3代BMSCs以110/瓶的密度接种于8个250ml的普通培养瓶,加入诱导培养基(含体积分数15%胎牛血清的DMEM,添加地塞米松10mol/L,维生素C50g/ml,B一甘油磷酸钠10mmol/L,青霉素钠100U/ml,链霉素100U/m1),孵育箱内继续孵育.1.2.3两种支架材料制备:PLLA/CPPf制备:参照Freed等熔铸颗粒沥取法.在超净条件下,将氯化钠颗粒(直径300450)3860g,聚磷酸钙纤维(长度10mm,直径15
13、m)0.483g,牛I型胶原0.010g掺人含L聚乳酸(平均相对分子质量1.010)0.262g的三氯甲烷溶液中,充分混匀;用预制模具熔铸成型;37三氯甲烷挥发48h,期间适时脱模;干燥器内真空抽提溶剂;双蒸水反复萃取样品中氯化钠颗粒;室温下自然干燥24h,干燥器内真空干燥48h,经冻干机处理24h,纸塑包装密封,环氧乙烷消毒,最后保存于真空干燥器内.材料呈白色多孔状,直径11mm,厚4mm(图1).DBM制备:采用捐献人的松质骨先制成大小为10mm5mm5mm骨条,再依次脱钙,脱蛋白,脱脂.将洗涤后的DBM控干后,用无菌塑料包装袋包装,置一50超低温冰箱预冻,再置人真空冷冻干燥机内在一50下
14、维持30min,抽成真空3h,以间隙手动加热法除去余下的水分,1h关机,进行分零(12g)包装,用co照射消毒,保存于一20箱内备用(图2).1.2.4扫描电镜观察:使用前分别将相同体积的两种支架材料置于6孔培养板内,用优等胎牛血清浸泡湿化.取等体积约5mm5mm5mm两种材料锐刀横切,真空干燥,横截面喷金,用AMRAY一1000B扫描电镜观察其横截面超微结构,并随机选择不同区域,游标卡尺测量孔径范围.1.2.5亲水性测定:取大小不同的两种材料各3块,置于100ml0.1mmol/L的PBS(pH7.4,37oC)中,7d后取出样品,用滤纸吸净样品表面水分,称其重量,用下面公式计算:吸水率=(
15、吸水后样品重量一吸水前样品重量)/吸水前样品重量100%,取3个结果的平均值.1.2.6两种支架材料的组织工程骨的体外构建:BMSCs诱导后第7天,消化,离心后弃上清液,加入DMEM完全培养基,调整至适当体积后吹打计数,以110/ml的密度于超净台内向两种材料滴加细胞悬液1ml,以恰好浸湿整个组织块为宜.孵育箱内孵育10h,按静置接种法等待细胞贴壁.10h后将两组6孔板内的支架材料取出,每孔内留1块备用.置于另两个空的6孔板内,沿6孔板内壁缓慢加入诱导培养液10IIll,以恰好浸没组织块为宜.孵育箱内继续培2007年3月第23卷第3期chinTr丛Q,:养.隔天换液,并于构建后每天在相差显微镜
16、下动态观察细胞在两种支架材料上黏附生长情况.1.2.7细胞黏附率的测定:向用于构建的两6孔培养板内加入2.5g/L胰蛋白酶5ml,消化35min,加入DMEM完全培养基中止消化,离心(1500r/minx5rain)后弃去上清液,加入DMEM完全培养基,调整至适当体积后吹打计数,按下列公式计算每孔组织工程骨的细胞黏附率:细胞黏附率=(接种前细胞数量)一接种后残余细胞数量/接种前细胞数量.1.2.8体外构建的组织工程骨扫描电镜观察:分别于体外构建术后10h及10d取两种支架材料的组织工程骨,用30g/L戊二醛固定24h后,锐刀剖开,乙醇系列脱水,醋酸异戊酯置换,真空干燥,表面喷金,用扫描电子显微
17、镜观察细胞在两种支架材料上的黏附生长情况.1.3统计学分析实验数据均以s表示,组间差异采用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1两种支架材料的扫描电镜观察DBM的微孔较规则,多呈蜂窝状,类圆形,且孔径大小较均匀,直径多在350450p.m之间(图3);而PLLA/CPPf因由呈短棒状的PuA和呈颗粒状的CPPf复合而成,其形成的网孔多呈纤维网状,微孔形态不规则,孔径大小相差较大,大小在200350p.m之间(图4),与DBM的孔径相比,两者之间差异具有统计学意义(P<0.01).见表1.2.2亲水性DBM具有较强的亲水性,吸水后膨胀,体积明表1左旋聚乳酸/聚磷酸钙纤
18、维与脱钙骨基质孔径的比较(p.m,s)显增加,吸水率达(417.745.2)%,PLLA/CPPf吸水后体积稍增加,吸水率为(262.025.2)%,两者之间差异具有统计学意义(P<0.O1).2.3细胞在两种支架材料上黏附率测定静置接种10h后,在相差显微镜下观察,见PLLA/CPPf组培养孔内残余较多的BMSCs,且已贴壁生长,细胞黏附率为(82.27.7)%,而DBM组培养孔内残余的BMSCs少,其细胞黏附率为(91.38.2)%,两者之间差异具有统计学意义(P<0.05).2.4细胞在两种支架材料上的生长情况相差显微镜观察显示,接种后第2天,细胞在两种材料上生长良好,两种材
19、料的网孔内均未见分泌的细胞外基质,至接种后第4天,可见DBM组的网孔内分泌少量的细胞外基质成分,且随着时间的延长,其基质呈明显增多.而PLLA/CPPf组由于孔径较小,至接种后第10天,其周边的网孔内才可见少量的细胞外基质.电镜观察显示,体外构建后10h,DBM组上黏附的细胞数量明显增多,部分呈簇状分布(图5),而PLLA/CPPf组细胞数量少,呈散在分布(图6).体外构建后10d,DBM组上黏附的细胞数量多,且细胞周围有较多的细胞外基质,而PLLA/CPPf组细胞数量少,呈散在分布,分泌的细胞外基质成分较少.3讨论3.1BMSCs作为骨组织工程种子细胞的优越性理想的骨缺损修复材料应当同时具备
20、骨生成性,骨诱导性和传导性.骨生成性是指修复材料中含有能够成骨的细胞,即种子细胞.种子细胞的选择与培养是骨组织工程中的根本环节,骨膜中成骨细胞因为来源有限和供区损伤等原因不是理想的种子细胞.Friedenstein等首先发现并证实骨髓中除了包含造血干细胞外,还存在一类可以向成骨细胞,软骨细胞等分化的细胞,即BMSCs.BMSCs不仅具有强大的增殖潜能和具有良好的成骨细胞分化潜能,且来源方便,无免疫排斥问题,能够满足自体组织工程骨构建的需要.BMSCs作为骨组织的种子细胞因具有较为突出的优越性而倍受重视,因此,筛选出适宜BMSCs黏附与生长的支架材料是骨组织工程日益紧迫的任务之一.3.2BMSC
21、s黏附的数量和生长的质量对组织工程骨成骨能力的重要性目I*fi)lMkfnH目制缶IICIlffHJI1日4P12【rI#Iw&.1扎1&_Mx51目hLM【rf.IjIjn街充矗if)1BM复丹疋架材料的成甘能与I胞挫种密慢衔圳l父Muchk:)等I为.新生目LL】成哥胞的数成达到7l0shi,na等将外培养I!l!J骨龇Ms(按小同钎度艇台于多瓷悄体I.丧驯,梢物的BMS(s崭度fl2xl【以上4能确保新形成昕1恼l宋卜治疗大段骨献拟需要的子绌胞戤龉巨选良好的n甥1=徉支架利l竹必要目前J骨组:材料种楚蚺多.主砭针为州大类.【!lj人然人工舟成材,而娄利荆吾仃利噼.几工材料
22、来源觅址易j批量生,天然材料州县冉m容陛,降解I4,丹传导胜DTIM和I)IA/CIH分圳是尤然凡工台成骨理坦呐盘槊州料州谖耐种是梨利料LjBMSCs鼎附作用的比较究为月吲r筛选出更为适宜的盘材料331)BM与PlIA/CIPI刊IIMSCs封附作川的蓐异艘可能柏机制实验结叫.悱外佃建11hJj晌DBM兰【细胞封附率商选(9I382)研.町PII/ACPPI细胞赫刚率(82277)%扫描电镜l且帆察到DBMl上j一附的细胞敬哇多.印针_【犊丹布:而HI/CPtfn川乜越址少.敬r十分m接种后2一IOd劫怎观察电旺示,DBM的刚L内舒泌的基质成舒随着时l的延K_1J丑增多;而II上/CPIt组I
23、I于孔径较小,至接种销10K.其J爿曲的扎内才川屺少量1)llM世步rl-实Jl1IM不目31uM1jLkq幻E目5!M哪岫i!1H储IIM#t对BMSCsnfJ较强的鼎阳n用L征fBMS(的牛长和增分析川能帅帆制:(I)凡j-成制iF.II,A/CIPI比,DBM具J旭的扎隙书j较凡ffl,L1扎任池同约3S0450一,陋扎能使移植料邗州屯质纽I胞有多的接触l这L_王为j附较多BMSI:s提供】允址l铷埋,#(2)BM肓鞍的幔水.最凡幢水串达(4I77452)%PL1A/CI【1fll/啦,K半(262_2521暂柑_比两扦之司肄具仃统汁学甑义(/<0)这仪利于BMSCs的赫计TflJ
24、利.岛密度种j细胞营养物质性地和代洲l物匝搀,仳进增殖与分化(3)I)Bvl与_MSCs仃良女r帕生物相祥忭利丁BMSCs的釉时(4)I)BM巾有诱导成骨态发_蜇向fBMI).曹【J勺做L利rIIMI释救辟促进IVvTSCs生L(-增行刊舒化总之.本究J-粜表FIf】.11MB赶tBMSCs驯咐,增殖.旬理慰的组织工程芷架材1l:仉l仃在力学喧眠,来源有限等哗端.嘎蟹的址I)BM【有定的免疫肚柯呵能携病肌曲等不足之址此.川构建组织ll程征=】二修复缸重片缺损和填充洞状缺搬此外,似捉JDBMJJ学l虽应删详免疫J康,尚需世步八研究参考文献IShirtMyodlil,(h?IIalllJJIr),
25、h-JlHmf】1wlI|_1IfhvmM11?I.1wI/I一ITI)MII1lnI?】IEl!4l拈一I2007年3月第23卷第3期ChinJTrauma,March2007,Vo1.23,No.32gimH.KimHW,SuhH.Sustainedreleaseofascorbate一2一phosphateanddexamethasonefromporousPLGAscaffoldsforbonetissueen百neeringusingmesenchymalstemeels.Biomaterials,2003,24:46714679.3戴刚,石宗利,李起鸿,等.新型骨与软骨组织工程支架
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30、强马琳颈椎创伤继发椎动脉损伤的核磁共振血管成像诊断及实验研究任先军王卫东蒋涛等低温预处理对大鼠脊髓神经细胞凋亡及神经功能的影响吴啸波程爱国聚乙醇酸支架组织工程神经复合物修复大鼠脊髓损伤蒲渝郭庆山王爱民等人工全髋关节不稳定的影响因素及防治徐辉张洪黄德勇膝关节后外侧结构的解剖与MRI研究白希壮王慧声郜玉忠等跟骨骨折的手术治疗白晓东邢更彦姜川等抗生素骨水泥棒治疗交锁钉术后髓内感染郑强潘志军李杭等海藻酸钙膜对兔胫骨骨创伤或骨缺损的修复作用何虹黄剑奇平飞云等(一)珠海亿胜生物制药有限公司(封二)(二)常州华森医疗器械有限公司(插页1)(三)上海博纳医疗器械有限公司(插页2)?广告目次?(四)上海其胜生物制剂有限公司(封三)(五)北京百优普泰医疗品有限公司(封底)