脉冲电化学沉积制备纳米 HAAg 复合涂层.doc

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1、精品论文推荐脉冲电化学沉积制备纳米 HA/Ag 复合涂层张柏林 1，王英波 2，鲁 雄 2*，周先礼 1，屈树新 2，冯 波 2，翁 杰 21 西南交通大学生命科学与工程学院，成都（610031)2 西南交通大学材料科学与工程学院 材料先进技术教育部重点试验室，成都（610031）E-mail：luxiong_摘要：脉冲电化学法在生物医用金属钛表面成功地制备出均匀、致密的纳米球状的 HA/Ag复合涂层。借助 SEM，XRD 等对复合涂层进行了表征。HA/Ag 复合涂层的抗菌性能利用大 肠杆菌和白色葡萄球菌两个菌种分别从定性和定量两个角度进行了分析研究。最后利用MC3T3-E1 成骨细胞检测复合

2、涂层的生物相容性。结果表明 HA/Ag 复合涂层呈纳米球状， 由 HA 和 Ag 两相组成。Ag 在 HA 涂层中分布均匀，无团聚现象。HA/Ag 复合涂层对两种细菌均有较好的抗菌效果，对大肠杆菌抗菌率达 100%，对白色葡萄球菌的抗菌率接近 100，对大肠杆菌的抗菌能力高于白色葡萄球菌。同时，MC3T3-E1 成骨细胞在 HA/Ag 复合 涂层表面的黏附、铺展较好。上述分析可知，脉冲电化学沉积法制备的 HA/Ag 复合涂层具有较好的抗菌性和生物相容性。关键词：脉冲电沉积；复合涂层；抗菌性；生物相容性 中图分类号：R318.081. 引言近年来的很多研究表明，由生物材料引发的感染中，45的原因

3、是由于生物材料与人体 接触时，在材料表面形成一层蛋白膜，而细菌很容易在这层蛋白膜上黏附，继而生长繁殖， 使用传统的抗菌治疗无法根除。因此，生物材料表面抗菌性能的研究已经成为当前研究和开 发的热点1。银（Ag）有着非常宽泛的抗菌谱，能够杀灭多达数百种致病的细菌以及病毒2-4， 此外，Ag 除了具有抗菌作用外，还具有抗氧化、抗腐蚀5、高热稳定性以及低细胞毒性6,7 等特征。最近，利用 Ag 来杀灭生物材料和医疗器械上的微生物已成为了一种非常有效的方 法8。羟基磷灰石Ca6(PO4)10(OH)2, hydroxyapatite, 缩写为 HA 或 HAp与人体硬组织的化学成 分和晶体结构极为相似，

4、具有独特的生物活性和生物相容性9。但 HA 脆性大、韧性差、强 度低，在生物材料方面的应用受到限制；而钛及钛合金作为重要的生物医用材料，具有优良 的力学性能，但生物活性差。将 HA 涂覆在机械性能优良的生物金属材料（如钛或钛合金） 上，可以综合发挥金属材料优良力学性能和羟基磷灰石良好生物相容性能10, 11。随着材料科学的发展，生物材料的研究已从被动地适应生物环境发展到有目的地设计材 料组分,制备具有特殊功能的生物复合材料12。近年来，在金属钛（钛合金）基底上制备既 有较好的生物相容性和生物活性又具有较强抗菌性的新型复合涂层已成为一种趋势。而 HA/Ag复合涂层恰好满足上述要求。同时，HA/A

5、g生物复合材料已被证明和HA一样具有优 越的骨引导和结合性13。目前，HA/Ag复合涂层的制备已见报道，其制备方法中主要有浸渍 法14，等离子喷涂法15,16，电沉积法17-19。Anchun Mo等14利用浸渍法制备Ag-HA/TiO2涂 层，涂层颗粒呈棒状，尺寸在100-300nm范围内，涂层表面粗糙有大量的微孔，且疏松。胡 艳等人15利用等离子法制备HA/Ag涂层，但等离子喷涂法存在着一些缺点，主要是HA在高 温等离子焰作用下，分解出磷酸三钙等杂相，使涂层纯度下降；另外，涂层结晶性因HA迅 速冷却而变差，导致涂层溶解严重，层间结构弱化，涂层的结合强度下降，甚至脱落。而电1 基金项目：国家

6、自然科学基金 30700172；高等学校博士学科点专项科研（新教师）基金 20070613019；国 家科技支撑计划（2006BAI16B01）。- 9 -沉积法是一种非线性方法，具有工艺简单、均覆性好和过程易控制等优点，成为目前生物涂层研究的方向之一20-22。 目前，已有采用电化学沉积制备钙磷盐生物活性陶瓷/银复合涂层的报道。刘榕芳等17采用一步法恒电流模式电沉积制备 HA/Ag 复合涂层，其方法是在电沉积 HA 涂层的电解液中加入 Ag 粉。该方法不足是在涂层表面存在着大量的 Ag 颗粒团聚，且 Ag 粉分布不均匀， 这将影响复合涂层的抗菌性能。肖秀峰等19采用两步法恒电流模式电沉积法制

7、备 HA/Ag 复 合涂层，其方法是：首先，通过在恒电流模式沉积 HA 的前驱体，然后置于 NaOH 溶液中浸 泡得到 HA，最后在烟酸渡银液中，以 HA 为基底，恒电流沉积 Ag 颗粒。其结果不足是银 颗粒只是存在于涂层的表面，这将导致表面的大量银颗粒脱落于机体内。从总体上看，文献 的报道大多采用单一的恒电流（或恒电压模式）进行一步沉积或者是两步沉积。然而，这些 方法存在一些缺点，如涂层中 Ag 颗粒的粒径较大，Ag 分布不均匀等。本研究采用脉冲化学沉积法，在含 Ag 离子的沉积液中，一步法直接得到均匀致密的纳 米级 HA/Ag 抗菌复合涂层。该方法制备的 HA/Ag 复合涂层中银的分布均匀

8、、且得到纳米级 的 Ag 颗粒，同时也减少了暴露于复合涂层表面的 Ag，降低了对生物体的毒性。本研究考 察了 HA/Ag 复合涂层的表面形貌、成分、抗菌性及生物相容性。2. 材料与方法2.1 试剂与材料Ca(NO3)24H2O（分析纯）、NH4H2PO4（分析纯）、AgNO3（分析纯）和 Cys（分析纯）。-MEM (Gibco, Grand Island, NY)，纯钛(宝鸡英耐特医用钛有限公司，纯度99.9%)。2.2 仪器带有 EDAX 能谱分析的扫描电子显微镜（QUANTA 200 型）、X 射线粉末衍射仪（PW3040/60，CuK，40Kv，40mA，扫描速度 2/min，扫描范围

9、 10120），CHI660 型电 化学工作站。2.3 实验部分2.3.1 样品制备2.3.1.1 钛表面的预处理选用医用级钛合金作为基体，其尺寸为10 mm10 mm1 mm。为了提高复合涂层与钛基 体的结合力，钛表面的预处理是关键工艺，否则由于钛表面氧化膜的影响，复合涂层容易脱 落。因此，对打磨好的钛板进行除油、刻蚀、活化等预处理。先用丙酮去油超声清洗3次， 每次10 min。然后用化学侵蚀法（按体积比H2SO4:HCI:H2O = 1:1:1的混合液）60下处理3-5 h。最后在活化液（5 M的NaOH溶液）中60 下加热1 h。以上预处理每一步骤之后均在室 温下用去离子水超声清洗。2.

10、3.1.2 实验步骤涂层的制备在40 恒温水域中进行。1.18 g分析纯Ca(NO3)24H2O和0.345 g分析纯 (NH4)H2PO4 按照Ca/P =1.67的比例用蒸馏水配制钙磷溶液，将0.17 g硝酸银溶于蒸馏水中， 然后将0.05g的配位剂半胱氨酸缓缓加入，最后将硝酸银-半胱氨酸溶液加入钙磷溶液中定容至1L用氨水调节pH值为4.0充分搅匀得到电解液，其中Ca2+的浓度为5.0mM、PO43-的浓度为3.0mM、Ag+的浓度为1.0mM。以钛合金作为阴极，铂金板作为阳极，饱和甘汞电解作为参 比电极，把电解液放在三电极系统的电解槽中以脉冲高电位：0 V，脉冲低电位：-2.0 V，脉

11、宽：100 s，沉积时间：2 h为条件进行脉冲电沉积。脉冲电化学沉积完成后立刻用去离子水 冲洗样品，自然晾干。2.3.2 HA/Ag 复合涂层的抗菌性测试菌种为大肠杆菌（Escherichia coli）和白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)，从定性和定 量两个方面来评价 HA/Ag 复合涂层的抗菌性能。定性分析采用平板涂布培养法（spread plate method），而定量分析采用薄膜表面粘附的方法(film adhering method)。抗菌实验分为两组： HA/Ag 复合涂层组、纯 HA 涂层组。每个实验组有 3 个平行样。2.3.2.1 定性分析首先将大肠杆

12、菌、白色葡萄球菌两种菌体分别接种于 LB 培养基上，于 37下进行活 化培养 12h，用接种环取适量的菌体将它们置于液体培养基中培养 12h 得到菌悬液，再用磷 酸盐缓冲液（PBS）把上述两种细菌配制成 10ml 浓度为 1108cell/ml 的菌悬液。接着把每个 实验组的样品分别放入其中，在 37，200rmp 的摇床中培养 12 h。最后摇匀，取出 100l 涂 平板，在 37恒温培养箱中培养 12 h，观察细菌的生长情况并进行拍照。2.3.2.2 定量分析采用样品表面粘附的方法测试样品抗菌率。两种菌株都接种于 LB 的培养基中，于 37 下培养 12h，此过程重复 3 次，以得到较纯的

13、菌落。取单菌落接种于液体培养基在 37，200rmp 的摇床中培养 12 小时。用磷酸盐缓冲液（PBS）将两种细菌配制成 3.0107 cell/ml 的菌悬液，分别稀释 103 倍。将被测样品放置在载玻片上，放在培养皿中，培养皿底部加入 无菌水，以防止菌液蒸发，其装置图见 1。取 50 L 滴于样品表面，37培养 12h，将菌液 移至 500 L PBS 溶液中，摇匀，取 50 L 涂布平板，培养 12h，即得菌落数。样品的抗菌 作用可以通过计算样品的抗菌率来表示，抗菌率的计算方法如（1）式所示。进行三次平行实验，以得到平均抗菌率。抗菌率对照样菌落数实验样菌落数 对照样菌落数100（1）32

14、41图.1 实验装置：（1）水，（2）玻璃，（3）样品，（4）菌液Fig.1 Experimental set-up: (1) water, (2) glass, (3) sample, (4) bacteria solution2.3.3 HA/Ag 复合涂层的生物相容性测试用大鼠颅盖骨成骨细胞（MC3T3-E1）来考察涂层的生物相容性。以 HA/Ag 复合涂层为 实验组，3 个平行样。将试样置于 24 孔培养板内，再将 MC3T3-E1 细胞接种于试样表面， 接种密度为 1105/ml，每孔加入 -DMEM（含 15 %FBS）1.0 ml，CO2 培养箱中 37培养。1、3 天后，试样分

15、别用 PBS 漂洗 3 次，2.5的戊二醛溶液中固定，然后用乙醇脱水，再用乙酸乙酯脱醇，临界点干燥后在试样上镀金，最后用 SEM 观察细胞的形貌。3. 结果和讨论在总的通电时间为 7200s，导通 100s，关断 100s，脉冲电沉积法制备的复合涂层的 XRD 图谱如 2 所示。可以看出，HA 的主要衍射峰对应的晶面（211），（002），（300），（313），（222） 均出现于谱图中，其中谱图中 HA 的最强的衍射峰为 31.7处，对应（211）晶面，二强峰是25.8处，对应（002）晶面与标准谱（# 74-0566）完全吻合。HA/Ag 复合涂层中的 Ag 的最 强衍射峰为 38.1处

16、（111）和基底钛的（002）面的衍射峰重叠在一起，二强峰为 44.2（200） 处，与标准图谱（# 04-0783）也完全吻合，且衍射峰较强。以上分析可知，复合涂层的成 分为 HA 和 Ag，且结晶较好。图 2 脉冲电化学沉积得到的 HA/Ag 复合涂层的 XRD 图谱.Fig. 2 XRD pattern of the HA/Ag composite coatings obtained by pulsed electrochemical deposition图 3 是脉冲电沉积的复合涂层 HA/Ag 的 SEM 图片。从图 3（a）可以看出，涂层比较 致密，为均匀的纳米级晶粒，近似球状颗粒

17、均匀地覆盖于钛基底上，且涂层表面相对平坦。 图 3（b）是涂层高倍的 SEM 图片，可知球状颗粒的粒径在 100-300nm 之间，球状颗粒之间 相互紧密堆积，形成致密的涂层。涂层表面能谱分析如图 4，从图中可以看出 HA/Ag 复合 涂层中主要元素是 Ti、Ca、P、Ag 和 O。电化学沉积 HA 或 HA/Ag 涂层的文章中17, 23指出，在恒电流或恒电位的条件下沉积所 得到的 HA 或 HA/Ag 涂层为多孔状，且涂层比较疏松。研究发现，电化学沉积过程中往往 会因溶液本体中的离子向电极表面扩散速度太慢而造成浓差极化，使产物膜以枝晶形式生 长，造成膜层疏松24, 25。在本研究中，利用脉

18、冲电沉积代替了单一的恒电流（或恒电位模 式），较好地解决了浓差极化的问题。在恒电流或恒电位进行沉积时，由于沉积离子趋近阴 极不断被沉积，因而不可避免地引起浓差极化，而在脉冲电位条件下，阴极表面的微反应区域的活化极化程度加大，同时在关断电流时阴极周围的反应离子能快速恢复到初始浓度，降低阴极表面微反应区域的浓差极化，使得反应离子在反应界面均匀成核，物质的电结晶生长 主要采取向上生长模式，这样周期的连续重复脉冲电位最终得到致密的复合涂层，从而改善 涂层的物化性能，得到综合性能较好的生物医用材料。图3.HA/Ag 复合涂层的 SEM 图片.(a)低倍下的 SEM 图，(b)是（a）图中局部放大的图片F

19、ig 3. (a)SEM macrograph of HA/Ag composite coatings; (b) Amplified image of the rectangular area in (a)图 4.HA/Ag 复合涂层的 EDS 图谱Fig.4.EDS spectrum of HA/Ag composite coatings图 5 是 HA/Ag 复合涂层的面扫描图谱，可知 Ca、P 和 Ag 元素均匀地分布于 Ti 基底的表面，Ag 元素的均匀分布就保证了涂层的抗菌功效。面扫描的结果显示，Ca 与 P 的原子 比，即 Ca/P=1.63 稍微低于羟基磷灰石中 Ca/P 的 1

20、.67。HA/Ag 复合涂层中 Ca/P 比略有降低， 可能是由于 Ag+替代部分的 Ca2+的原因。(a)(b)(c)(d)图5.Ti基底上HA/Ag涂层的面扫描图片:(a) Ti元素;（b）Ca元素;（c）P元素;（d）Ag元素Fig 5.Element mapping of HA/Ag on Ti substrate: (a) Ti; (b) Ca; (c) P; (d) Ag.涂层图 6.涂层断面形貌和元素扫描分析图Fig 6. (a)SEM micrograph of metallurgical cross section; (b) and the concentration pro

21、files of Ti, Ag, P and Ca.脉冲电沉积的 HA/Ag 复合涂层的断面元素线扫描能谱图见图 6 所示。从图中可以看出， 涂层的厚度约为 30m，Ag 元素在涂层中分布均匀。涂层中的 Ca 元素与 P 元素线扫描曲线 的变化趋势一致，说明了在涂层中 Ca 元素和 P 元素彼此相互地结合在一起。综上可知，采用脉冲电化学沉积法可以制备出均匀的 HA/Ag 纳米复合涂层，且 Ag 元素在涂层的纵向和横向分布比较均匀，这就保证了涂层的抗菌功效。为了考察脉冲电化学沉积得到 HA/Ag 纳米复合涂层的抗菌效果，利用平板涂布法对 HA/Ag 复合涂层进行定性抗菌研究，分为两个实验组（a）

22、HA/Ag、（b）HA，见图 7。采用 两个菌种大肠杆菌和白色葡萄球菌进行对比试验，浓度都为 1.0108 cell/ml。其结果表明： 与 HA 和纯 Ti 相比，HA/Ag 复合涂层对两种细菌均有较强的杀菌能力，在恒温培养 12h 后， 图片（a1）中没发现大肠杆菌的菌落，（b2）中存在这零星的白色葡萄球菌体，表明在高浓 度的菌液中，HA/Ag 复合涂层保持着对细菌有着较好杀菌效果。同时可以看出，HA/Ag 涂 层对白色葡萄球菌的抗菌效果稍差于大肠杆菌。而其他图片（b1）、（b2）中细菌的生长状态 良好，许多的菌落堆积在一起形成菌苔，并且肉眼可以观察到菌体上有一层白色的看似粘稠 状的物质，

23、说明细菌的代谢比较旺盛。（a1）（b1）（a2）（b2）图.7 平板涂布法的结果（a）HA/Ag，（b）HA，其中（1）大肠杆菌，（2）白色葡萄球菌，菌液的浓度为 108cell/mlFig.7.The spread plate method of (a) HA/Ag, (b) HA, with 108 cell/ml of(1) Escherichia coli and (2) Staphylococcus albus表 1.HA/Ag 复合涂层对大肠杆菌和白色葡萄球菌的抗菌率（XS）(n3) Table.1.HA/Ag antimicrobial rate of Staphylococcu

24、s albus（XS）(n3)菌系HA/AgHA抗菌率大肠杆菌035811.52100%白色葡萄球菌1.670.47318.6714.8299.47%采用薄膜表面粘附法对 HA/Ag 复合涂层的抗菌性能进行了定性分析，数据见表 1。HA/Ag 复合涂层对大肠杆菌的抗菌率为 100，对白色葡萄球菌的抗菌率为 99.47。说明HA/Ag 复合涂层对两种细菌有这较好的抗菌效果，对大肠杆菌的抗菌效果好于白色葡萄球菌。定量实验结果和定性实验结果相吻合。从上述定性和定量的抗菌实验研究结果可知，HA/Ag 纳米复合涂层具有较好的抗菌性能。可能是由于 HA/Ag 纳米复合涂层中，Ag 粒径 降低到纳米级，随着

25、颗粒直径的减少，比表面积显著增大，位于表面的原子占有相当大的比 例，纳米颗粒表面原子具有很高的活性，最终会引起比表面能和抗菌性能的提高。因此，涂 层中只需含有少量的纳米 Ag 即可达到较好的抗菌效果，这样就降低了细胞毒性。同时，Ag 均匀地分散于复合涂层中，使得 HA/Ag 纳米复合涂层具有持久的抗菌效果。即使表层的 Ag 有所减少或损失，内层的 Ag 也能保证复合涂层的长期抗菌力。(a)(b)图.8 HA/Ag 复合涂层表面成骨细胞的 SEM 图片 (a) 1 天； (b) 3 天Fig8. SEM photographs of osteoblast cell on the surface

26、of HA/Ag composite coating. (a) one day; (b) three days.HA/Ag 纳米复合涂层作为一种生物医用材料，虽然显示出了很好的抗菌性能，但是 Ag 的存在不可避免地对成骨细胞造成一定影响。为了检测纳米抗菌 HA/Ag 复合涂层的生物 相容性，本研究对电沉积制备的 HA/Ag 复合涂层进行了 MC3T3-E1 成骨细胞培养，观察细 胞在复合涂层表面的形态及黏附、铺展。图 8 是 MC3T3-E1 成骨细胞在 HA/Ag 复合涂层表 面的粘附、铺展的电镜图片。体外细胞培养 1 天后（图 8a），细胞在 HA/Ag 复合涂层表面 粘附、铺展较好，可以

27、明显看细胞伪足。细胞培养 3 天后（见图 8b），细胞几乎完全铺展于 材料的表面，生长情况良好。体外成骨细胞培养 1、3 天的细胞形态可知，HA/Ag 复合涂层 有着较好的生物相容性。4. 结论本研究采用脉冲电化学沉积法中的一步沉积模式成功的制备出银粒子在 HA 涂层中分 布均匀的 HA/Ag 纳米复合涂层。HA/Ag 纳米复合涂层较致密，形貌近似球状，结晶较好， 且钙磷盐成分单一。抗菌实验的研究结果表明，HA/Ag 复合涂层对大肠杆菌和白色葡萄球 菌的抗菌率在 99以上，有着较好的抗菌性，且复合涂层对大肠杆菌的杀菌能力高于白色 葡萄球菌。同时，MC3T3-E1 成骨细胞在 HA/Ag 复合涂

28、层表面粘附、铺展较好。脉冲电化 学沉积法制备的 HA/Ag 纳米复合涂层具有很好的抗菌性能及较好的生物相容性，是一种优 异的生物医用抗菌复合材料。参考文献1 王鹏, 罗建斌, 李洁华, 等. 生物技术通讯, 2004 ,15 (6): 649-651.2 Kawashita M, Tsuneyama S, Miyaji F, et al. Biomaterials, 2000, 21(4): 393-398.3 Zhao Q, Liu Y, Wang C. Applications of Surface Science, 2005, 252(5): 1620-1627.4 Betts AJ,

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35、n2, Feng bo2, Weng jie21School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu（610031)2Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials (Ministry of Education), School ofMaterials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu（610031）AbstractThe uniform,

36、dense nano-spherical HA/Ag composite coatings were fabricated by pulseelectrochemical deposition on biomedical titanium surface. The thin film was characterized by XRD and SEM.Escherichia coli and Staphylococcus albus were utilized to test the antibacterial ability of the HA/Ag composite coatings. T

37、he biocompatibility of composite coatings was evaluated by MC3T3-E1 osteoblasts cell culture test.The results demonstrated that Ag evenly distributed in the composite coating without reunion. The coatings have good antibacterial effects on two types of bacteria. With regard to the antibacterial effe

38、cts, 100% of Escherichia coli and nearly 100% of Staphylococcus albus were killed.The composite coatings have a better antibacterial effect on Escherichia coli than on Staphylococcus albus, The MC3T3-E1 osteoblast cell culture indicates that HA/Ag composite coatings have good biocompatibility. In summary, the HA/Ag composite coatings prepared by pulse electrochemical deposition have good Antibacterial and biocompatibility.Keywords: Pulsed Electrochemical Deposition; Composite Coating；Antibacterial；Biocompatible作者简介：张柏林，男，1985，在读硕士，四川成都西南交通大学生命科学与工程（610031）。