《氟对小胶质细胞过度产生活性氧自由基作.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氟对小胶质细胞过度产生活性氧自由基作.doc（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、精品论文氟对小胶质细胞过度产生活性氧自由基作用的研究颜凌，刘子酉，王菲，刘盛男，颜南，席淑华5（中国医科大学公共卫生学院地球化学性疾病研究室，沈阳 110001） 摘要：目的： 观察氟作用下小胶质细胞氧化应激状况，为进一步研究氟致中枢神经系统损 伤机制提供实验依据。方法：用 1、10 和 50mg/L 的 NaF 处理 BV-2 小胶质细胞 24h 后,检测 细胞内活性氧（ROS）、超氧阴离子自由基（O2-）和硝基酪氨酸（NT）含量。结果：BV-2 小胶质细胞细胞染毒 24h 后，50mg/L NaF 处理的细胞内 ROS 含量显著高于对照组（p0.01）；101、10 和 50 mg/L N
2、aF 染毒组细胞内 O2-含量均显著高于对照组（p0.05）；10 和 50 mg/L NaF 处理的细胞内 NT 也显著高于对照组，三种活性氧自由基产物的含量均与染氟浓度呈显著地 正相关关系。结论：氟能激活小胶质细胞，使其产生较多的活性氧自由基，可能在氟所致的 中枢神经系统损伤中起一定的作用。关键词：关氟；小胶质细胞；ROS；O2- ；NT15The Study on Generation of Reactive Oxygen and Free radicals in Fluoride-Treated BV-2 Microgla CellsYan Ling, Liu Ziyou, Wang
3、Fei, Liu Shengnan, Yan Nan, Xi Shuhua(School of Public Health,China Medical University, ShenYang 110001)20Abstract: Objective: Observing oxidative stress of BV-2 microglia after treated by fluoride.Methods: BV-2 microglia cells were treated with 1, 10 and 50 mg/L NaF for 24h, and intracellularROS, O
4、2- and nitrotyrosine (NT ) were measured. Results: Contents of ROS and O2- increased inNaF-treated cells as compared with control cells, NT concentrations also increased significantly in10 and 50 mg/L NaF-treated cells compared with the control cells. The contents of intracellular25ROS, O2- and NT s
5、ignificantly increased with fluoride concentrations in a dose-dependent manner. Conclusion：Fluoride could activate microglia and induce microglia to produce more ROSand free radicals, which possibly resulted in central nervous system damage.Keywords: fluoride; microglia; ROS; O2-; NT300引言氟（F）是反应活性极强
6、的负电性元素，在自然界中广泛分布，是生物体必需的微量元 素之一。然而，世界上有 50 多个国家和地区，由于岩石土壤中氟含量过高，导致地方性氟 中毒的发生。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨症外，一些氟中毒患者常伴有神经系统症状，表 现为头痛、头晕、记忆力减退等中枢神经系统功能障碍症状。目前研究较多的是慢性氟中毒35引起的智力改变，认为高氟摄入与儿童智商呈显著负相关1,2。由于氟的反应活性极强，可 直接攻击氧，干扰氧代谢，影响抗氧化酶的活性，导致活性氧、自由基增多，引起细胞损伤。 研究显示，过量氟摄入的大鼠脑组 ROS、自由基明显增高，抗氧化水平下降3,4。小胶质细 胞是脑组织中的免疫细胞，一些内外因素
7、均可使其激活，活化后的小胶质细胞可通过NADPH 氧化酶和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）产生大量的 ROS，是脑组织活性氧和活性氮的来源基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（编号 20112104110021）作者简介：颜凌，（1987-），女，硕士研究生，地方性氟中毒。通信联系人：席淑华，（1964-），女，教授，地方性氟、砷中毒。E-mail: - 5 -405-7。因此，小胶质细胞活化后，通过诱导神经元氧化应激而产生神经毒性作用。来源于 NADPH 氧化酶的 O2-能与 iNOS 催化产生的 NO 反应生成过氧亚硝酸阴离子(ONOO- )， ONOO-能与生物大分子结合引起
8、DNA 断裂和脂质过氧化。硝基酪氨酸（NT）就是 ONOO- 与蛋白结合的产物，可作为氧化损伤的标志物。本研究以小鼠小胶质细胞（BV-2 细胞）为 受试对象，观察氟对小胶质细胞氧化应激的作用，为进一步揭示氟对神经系统损伤的机制提45供依据。1材料与方法1.1 主要仪器及试剂NaF，上海生工生物工程有限公司；DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶，HyClone 生物公司生产； DMSO，Sigma 公司；2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)和二50氢乙啡腚(DHE)，碧云天生物技术研究所。超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；CO2 恒温培养箱，荷兰 Heraeus 公司；
9、倒置显微镜，Nikon 公司；流式细胞仪，FACScan； SHHW2-1Cr 型恒温水浴箱，北京长安科学仪器厂；3K18 型低速离心机，Sigma 公司；Sunrse508I 型自动酶标分析仪，瑞士 TECAN 公司。1.2 小胶质细胞的培养与染毒55小鼠小胶质细胞（BV-2）由中国协和医科大学基础医学细胞中心提供。BV-2 培养在含10%的胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中，放置于 37的含 5%CO2 细胞培养箱中增殖生长。 取对数生长期，生长良好的 BV-2 细胞，分别用浓度为 1、10、50mg/L 的氟化钠染毒 24h 后， 进行各项指标检测。1.3 细胞内 ROS 的相对含量检测
10、60细胞以 4104 个/ml 的密度接种于 6 孔板，2.5 ml/孔。设一不加 DCFH-DA 探针的孔为 阴性对照。放入 CO2 细胞培养箱中继续培养 23d 后，加入浓度为 0、1、10、50mg/L 的氟 化钠，染毒 24h，温 PBS 洗两次后加入 1ml 20mM DCFH-DA 工作液/孔，继续孵育 30min。 胰酶消化后加培养液离心取细胞沉淀，加入 1ml PBS 悬起细胞。使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长检测刺激后的荧光强度。每次计数 10000 个细胞，用 Cell Quest 软件进行分析，以65DCF 的平均荧光强度表示 ROS 生成量。最终实验数据
11、以实验组的平均荧光强度与对照组的 平均荧光强度的相对比值（相对荧光强度）表示。1.4 细胞内 O2-的相对含量检测细胞以 4104 个/ml 的密度接种于 6 孔板，2.5 ml/孔。放入 CO2 细胞培养箱中继续培养23d 后，加入浓度为 0、1、10、50mg/L 的氟化钠，染毒 24h，温 PBS 洗两次后加入 1ml 5M70DHE 工作液/孔，继续 37孵育 30min。胰酶消化后加培养液离心取细胞沉淀，加入 1ml PBS 悬起细胞。使用 300nm 激发波长，610nm 发射波长检测刺激后的荧光强度。最终实验数据 以实验组的平均荧光强度与对照组的平均荧光强度的相对比值（相对荧光强
12、度）表示。1.5 细胞内硝基酪氨酸（NT）水平检测0、1、10、50mg/L 氟化钠处理的细胞提取物加入到 96 孔酶标板（包被有偶联抗原），75按照 ELISA 试剂盒说明书提供的操作步骤进行实验，设定酶标仪于 450nm 处（用双波长450/630nm 检测，在 5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。绘制标准曲线，以标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，即为样本中硝基酪氨酸的实际浓度。1.6 统计学分析用 SPSS 13.0 for Windows 软件进行数据统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）80进行组间比较，组间两两比较采用 LSD 检验，以 P0.05
13、为差异有统计学意义。2结果细胞内 ROS 含量 DCF 荧光密度的变化来评价。图 1 可见，细胞内 DCF 荧光密度随着 氟浓度的增加而增高，呈显著的剂量反应关系(r=0.851,P0.01)，以 50mg/L NaF 处理的细胞 为最高，显著高于对照组细胞（P0.01)。细胞内 O2-含量用 DHE 荧光密度检测，BV-2 细85胞内 O2-含量也随染氟剂量增加而增高(r=0.943, P0.01)，1, 10 和 50 mg/L NaF 处理的细胞内 O2含量均显著高于对照组，见图 2。NT 是细胞内 O2-和 NO 反应形成的产物，在 10 和50 mg/L NaF 处理的细胞内显著升高
14、，高于对照组，并且也存在剂量反应关系(r=0.603, P0.05)，见图 3。ROS (DCF fluorescenceintensity fold of control)32.5#(r=0.851，p0.01)21.510.500 1 10 50NaF concentrations (mg/L)90图 1 氟致小胶质细胞 ROS 水平增加Fig. 1 The effects on ROS concentrations of BV-2 cells treated with fluorideO2- (DHE fluorescenceintensity fold of control)1.61.
15、41.210.80.60.40.20(r=0.943,p0.01) #*0 1 10 50NaF concentrations (mg/L)图 2 氟对小胶质细胞 O2- 含量的影响Fig. 2 The effects on O2- contens of BV-2 cells treated with fluoride12001000NT (ppb)800#(r=0.603,p0.05)*60040020000 1 10 50NaF concentrations (mg/L)95图 3 氟对小胶质细胞 NT 含量的影响Fig. 3 The effects on NT levels of BV-
16、2 cells treated with fluoride1001051101151201253讨论细胞的氧化还原平衡对维持机体生理功能非常重要，但如果自由基产生过多就会引起细 胞各种功能紊乱，引起组织氧化损伤。小胶质细胞作为大脑一种休眠的免疫细胞，可被外来 物质快速激活，活化的小胶质细胞一方面能够清除细胞废物和病原体，另一方面过度活化可 产生大量的 ROS 和活性氮（RNS），参与了神经毒性作用8-10。本实验研究结果显示，BV-2 细胞暴露氟后，能引起 ROS 和 O2-显著增加。尽管 ROS 对维持细胞的正常功能有必要作用 11，但过多能产生病理作用，引起细胞损伤和死亡12,13。有研究
17、报告各种脑损伤后小胶 质细胞增殖和激活14，因此，可以推测小胶质细胞氧化应激可能是氟致脑神经毒性的原因 之一。细胞内过度产生的 O2-还能与 NO 发生快速的非酶促反应，形成氧化作用更强的过氧 亚硝基阴离子（ONOO-），内源性 ONOO-诱生后，在生物体内可选择性与蛋白质分子中的 酪氨酸残基发生不可逆反应，生成稳定的代谢物硝基酪氨酸（NT）。NT 的含量可反映 ONOO- 量的变化，做为 ONOO-在体内生成的标志物。本研究也发现 10 和 50 mg/L NaF 引起 BV-2 细胞内 NT 显著升高，说明氟能激活小胶质细胞，使活性氧和活性氮含量的增加，而引起生 物大分子的损伤。4结论本实
18、验研究结果表明一定剂量的氟可激活小胶质细胞，释放活性氧自由基，引起一定的 氧化损伤，说明氧化应激可能在氟所致的中枢神经系统损伤中起一定的作用，其机制还需进 一步研究。参考文献 (References)1Tang QQ, Du J, Ma HH, Jiang SJ, Zhou XJ. Fluoride and Childrens Intelligence: A Meta-analysis. Biol TraceElem Res, 2008,126(3):115-120.2Xiang Q, Liang Y, Chen L, Wang C, Chen B, Chen X, Zhou M. Effec
19、t of fluoride in drinking water on childrens intelligence. Fluoride, 2003, 36:84-94.3Zhang M, Wang AG, He WH, He P, Xu BY, Xia T, Chen XM, Yang KD. Effects of fluoride on the expressionof NCAM, oxidative stress, and apoptosis in primary cultured hippocampal neurons. Toxicology, 2007,236:208216.4邢德利,
20、徐淑艳,张文岚,李广生. 过量摄氟对大鼠脑组织氧化侵袭与细胞凋亡的影响.中国地方病防治杂志，2006，21(1):7-9.1301351401455Colton CA and Gilbert DL.Production of superoxide anions by a CNS macrophage, the microglia. FEBS Letters,1987, 223(2):284288.6Banati RB, Gehrmann J, Schubert P, Kreutzberg GW. Cytotoxicity of microglia. Glia, 1993, 7(1):11111
21、8.7 Gehrmann J, Matsumoto Y, Kreutzberg GW. Microgia: intrinsic immuneffector cell of the brain. BrainResearch Reviews, 1995, 20(3):269287.8Boje KM and Arora PK. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal celldeath. Brain Research, 1992, 587(2):250-256.9Chao CC, H
22、u S, Molitor TW, Shaskan EG, Peterson PK. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunoloy, 1992, 149(8):27362741.10Dringen R. Oxidative and antioxidative potential of brain microglial cells. Antioxidants and Redox Signaling,2005, 7(9-10):12231233.1
23、1 Le Bel le JE, Orozco NM, Paucar AA, et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell, 2011, 8(1):5971. 12Li Q and Engelhardt JF. Interleukin-1 induction of NF-B is partially regulated b
24、y H2O2-mediated activation of NF-B-inducing kinase. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(3):14951505.13Jenner P. Oxidative mechanisms in nigral cell death in Parkinsons disease. Movement Disorders, 1998,13(supplement1):2434.14Vezzani A, Monhemius R, Tutka P, Milani R, Samanin R. Functional activation of somatostatin- andneuropeptide Y-containing neurons in the entorhinal cortex of chronically epileptic rats. Neuroscience, 1996,75(2):551557.