稻属核糖体内转录间隔区的遗传多样性分.doc

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1、精品论文稻属核糖体内转录间隔区的遗传多样性分析及系统学意义戴小军5（湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081）摘要：通过对稻属 AA,BB,CC,EE,FF,GG,CCDD,BBCC8 种基因组型, 21 个种 74 个品种的 ITS序列进行了序列比较和系统分析,结果表明稻属变异位点占 67.48%,信息位点占 36.30%;ITS长度在 414-460 之间.PAUP 和 Mega 软件系统分析发现.利用 ITS 序列可明显区分稻属不同基 因型,AA 基因组归为一支,CCDD,CC,EE 基因组归为一支,而 BB,BBCC 为另一支,说明 CC,EE10较 BB 有更近的亲缘关系,CCD

2、D 与 EE 亲缘关系较近;AA 基因组内不同种之间亲缘关系比较 复杂,但能较好区分栽培稻种内籼粳稻。关键词：稻属；内转录间隔区 ITS；系统树中图分类号：S332.215Analysis of ITS sequences of nuclear ribosomal DNA onOryza L.and their phylogenetic implicationsDAI xiaojun(College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)Abstract: In the study, the inte

3、rnal transcribed spacer(ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA20of the genus Oryza.L(a total of 57 accessions belonging to 21 species of 8 genomes) were cloned and sequenced. The results revealed the length of ITS sequences varied from 414bp to 460bp inwhich 298 characters(67.48%) were variable and

4、 167 characters(36.30%).were informative. Twophylogenetic trees were reconstructed using neighbor-joining and maximum parsimony methods based on ITS fragments of Oryza L.which the topologies weresimilar. two main clusters were25identified, one well-defined cluster is formed by total AA genomes, in t

5、he other cluster, CC,DDand CCDD genomes formed one clade, BB and BBCC formed the other one. This indicated that CC and EE has closer relationship than with the BB genome. CCDD and EE have closer relationship. It is limited to distinguish the interspecific and intraspecific relationships of the AAgen

6、ome using ITS sequences, nevertheless ,to Oryza.sativa species, indica and japonica subspecies30formed separate clades clearly.Key words: Oryza.L; internal transcribed spcer(ITS); phylogenetic tree.引言高等植物的细胞核中，编码核糖体 RNA 的基因是高度重复的串联序列。其中编码 18S、355.8S 和 26S 的 rDNA 为一个转录单位，在该转录单位中，ITS(internal transcri

7、bed spacers)是 介于 18S 和 5.8S 之间(ITS1)以及 5.8S 和 26S 之间(ITS2)的非编码转录区。编码 18S、5.8S 和26S 的序列为高度保守区，ITS 序列为进化速度较快的中度保守序列，且各重复单元间具有 同步进化的特点。因此，ITS 作为基因标记很快成为在序列水平上探讨系统发育和进化研究 的有效手段1-5。相比之下，ITS 序列在裸子植物中变异十分复杂6，而在被子植物中变化很40有规律，已广泛应用于被子植物的科内、近缘属间以及种间关系的研究7-9。稻属有 10 种染色体组类型,目前许多稻属不同基因组 ITS 序列被测定并应用于系统学或基金项目：教育部

8、博士点基金资助项目(新教师基金课题)(20094306120005)作者简介：戴小军(1976-),男,讲师,植物发育与分子生物学. E-mail: hello_- 11 -分类研究,周毅等10以 ITS1 序列对普通野生稻、药用野生稻、疣粒野生稻和栽培稻进行了亲 缘关系分析，结果表明仅以 ITS1 序列构建的 3 种野生稻和栽培稻的系统发育关系与前人用 同功酶、叶绿体 DNA、线粒体 DNA 和核 DNA 资料构建的稻属系统发育关系基本一致;葛颂4511利用 ITS 序列探讨了药稻复合体二倍体物种 BB,CC,EE 基因组 12 个材料的系统发育关系, 发现 C 染色体组和 B 染色体组的亲

9、缘关系要比它们和 E 染色体组的更近。同时利用 ITS 限 制性片段多态性(RFLP)分析,可以快速将稻属 CD 染色体组物种区别开来12。但 ITS 序列能 否很好的对整个稻属二倍体基因组和四倍体基因组进行系统分析,能否应用于稻属遗传多样 性非常丰富的栽培稻种内,至今尚未见报道。50本研究拟通过比较稻属 8 种基因组 20 种 57 个 ITS 序列, 全面探讨稻属 ITS 序列的遗 传多样性及系统学意义。1 材料与方法1.1 材料供试材料为稻属不同种材料，其中含栽培稻籼稻（Oryza sativa ssp. indica）南京 11 号55(Nanjin11)、广陆矮四号(Guanglua

10、i4)、余赤 231-8(Yuchi231-8)、R288、明恢 63(Minghui63) 和 9311，密阳 46、R402、株 1S；粳稻(Oryz sativa ssp. japonica)日本晴(Nipponbare)、秋光 (Qiuguang)、矮子糯(Aiziluo)、农垦 58S、P002、Lemont。两个普通野生稻海南野生稻,茶陵 野生稻(见表 1)。表 1 稻属不同种基因组型及其 GenBank 序列号60 Table 1 Plant materials used in the study 分类群基因型GenBank 编号TaxonGenomeGenBank Number

11、s1高杆野生稻 O.altaCCDDAF513602,AF513603,AF513604AF514913,AF514916,AF514917阔叶野生稻2O. latifoliaCCDDAF513599, AY126015,AF513589,AF513590AY151356,AY151355,AF513565,AF513566大颖野生稻3O.grandiglumisCCDDAY151367,AF520780,AY1513684根茎野生稻O.rhizomatisCCAF479065, AF4790665药用野生稻O.officinalis紧穗野生稻6CCAF479063, AF479076,AF4

12、79064CCAF479068,AF479069, AY181994,AY181995O.eichingeriBBCCAY188664,AY188665,AY1886667小粒野生稻O.minutaBBCCAY188606,AY188607,AY1886088非洲野生稻O.schweinfuthianaBBCCAY188598,AY1885999马蓝普通野生稻O.malampuzhaensisBBCCAY188643澳洲野生稻10O. australiensisEEAF520777, AF52077811斑点野生稻O.punctataBBAF479070,AF47907112南方野生稻O.me

13、ridionalisAAAF017676, AY74936713长雄蕊野生稻O.longistaminataAAAF017669, AY749365,AY76878014短舌野生稻O.barthiiAAAF017668, AY74936615展颖野生稻O.glumaepatulaAAAF017675, AY74936316普通野生稻O.rufipogonAAAF017672, AY749361 ,DQ35527617非洲栽培稻O.glaberrimaAAAF017667, AY74936418一年生野生稻O.nivaraAAAF029377, AY749362栽培稻19O.sativaDQ35

14、5266(Nipponbare), DQ355267(9311),DQ355268(Nanjing11), DQ355269(R288), AADQ355270(Minghui63), DQ355271(Yuchi231-8),DQ355274(Akihikali), DQ355275(Aizinuo)20大颖野生稻O.granulateGGAF52077921短花药野生稻O.brachyanthaFFAF0293891.2 方法1.2.1DNA 提取取供试材料的幼叶，用传统的 SDS 法提取 DNA。1.2.2PCR 扩增65ITS 序列采用双引物 ITS1+ITS2 扩增。根据 GeneB

15、ank 中的水稻序列用 Primerer 软件设 计引物，由上海生工合成。双引物的序列分别为 5-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3和 5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GCT TAA -3。反应体系为：Buffer5l,25mM MgCl2 4l,10mMdNTP 1l, 50mM 引物各 1l,DNA 40ng,Taq DNA polymerase0.4l，总体积 50l。扩增程序为：95预变性 5min，接着以 951min、5630S、721min70循环 32 次，最后 72保温 10min。1.2.3 克隆测序PCR 产物用上

16、海生工胶回收试剂盒回收，连接到宝生的 PMD 18-T Vector 载体中,再转 化到大肠杆菌 DH5，涂板，PCR 检测，然后摇菌，提取质粒，将菌液送到上海博亚测序。1.2.4 数据分析75所得序列采用 DNAMAN 和 clustalw 软件进行排序和 G+C 含量分析，然后用 MEGA和 PAUP4.0 软件对序列进行统计分析并构建系统树。2 结果与分析2.1 稻属 ITS 序列变异稻属供试材料 ITS 总长度 414-460bp 之间,有 46 个碱基的长度差异。其中 ITS1 有 35 个80碱基长度差异,ITS2 有 23 个碱基长度差异。GC 含量 73.78%76.56%，变

17、异位点 298 个,占64.78%,信息位点 167,占 36.30%(表 2)。可见稻属 ITS 变异位点和信息位点都十分丰富,ITS1中完全一致的碱基数为 67 个,仅占 27.7%;ITS2 中完全一致的碱基为 68 个,占 26.1%.对不同基表 2 稻属 ITS 序列变异分析Table 2 Description of sequences from the ITS(ITS1 and ITS2) data sets in Oryza.LCharactersticsITS1ITS2ITS1+ITS2长度 Length(bp)差异位点 No.variable sites1872221302

18、15238168414460298(64.78)信息位点No.informative sites8285167(36.30%)G+C 含量G+C content(%)72.1878.9274.2477.0073.7876.5685因组之间整个 ITS1+5.8S+ITS2 序列相似性进行了分析(表 3),FF 和 GG 基因组与其他基 因组有较远的亲缘关系;当分析 AA,BB,CC,EE,BBCC,CCDD 基因组之间相似性时,发现 EE 基 因组 CC 基因组亲缘关系较近,而与 AA 基因组较远；CC 基因组与 BB 基因组相似性为95.8%-97.5%,与 CCDD 基因组为 92.5%-

19、98.0%,与 BBCC 基因组为 95.0%-97.3%,与 AA 基因90组为 91.0%-94.8%;从相似性来看似乎 CC 基因组与 CCDD,BBCC,BB 基因组亲缘关系差异不 是很明显,只与 AA 基因组差异较大。但在分析 CCDD 基因组时看的出其较其他基因组与 CC 基因组相似性更高，BBCC 基因组与 BB 基因组相似性较高。表 3 稻属不同基因组相似性比较95 Table 3 Homology analysis of Oryza.L AA(%)BB(%)CC(%)EE(%)BBCC(%)CCDD(%)FF(%)GG(%)AA91.2-100BB93.2-95.6100CC

20、91.0-94.895.8-97.597.3-99.5EE89.0-91.395.3-95.494.5-95.799.5BBCC91.1-95.198.3-99.595.0-97.393.7-94.996.5-99.8CCDD84.0-92.992.0-94.892.7-98.092.7-95.791.2-95.590.8-99.7FF81.6-83.683.982.0-83.782.9-83.483.6-85.180.4-83.7-GG88.7-90.991.189.1-90.791.7-91.989.8-91.084.9-89.081.3-100不同基因组内相似性比较,CCDD 和 AA

21、基因组 ITS 序列分化较大.但在分析 AA 基因组ITS 序列时发现其具有相对保守性,特别是在 ITS2 第 31 到 35 的位置有五个碱基是 AA 基因 组 32 个 ITS 序列的特征性碱基(TATCC), 而其他基因组型 43 个 ITS 序列各不相同(表 4).表 4AA 基因组与其他基因组相比较的标志性碱基Table 4 The particular ITS2 segment from 31 to 35 sites to different genomes of Oryza.L基因型 GenomeITS2 第 31-35 位点ITS2 segment from 31-35 sit

22、esAATATCCBBMissingCCGA(G)C(G)CCCCDDGAC(A)CCBBCCMissingEEMissingFFAGTCCGGMissing1051102.2 利用稻属 ITS 序列系统树的构建以 wheat 的 ITS 序列为外类群,分别采用 PAUP 软件,MEGA 软件归类并采用邻接法和 最大简约法行系统发育分析，并得到两个非常相似的系统树(图 1),稻属 AA 基因组全部自 动构成一支,且两种构建方法的置信度都为 100%;CCDD 基因组与 CC,EE 基因组构成一支,显 示其较近的亲缘关系, 其中 CCDD 基因组中的 O.alta,O.grandiglumis

23、和 O.latifoliau 位于不同 分支，BB 基因组与 BBCC 基因组构成一组,FF 和 GG 基因组与其他基因组距离较远.但 AA 基因组中各种之间亲缘关系比较复杂,利用最大简约法和邻接法构建的系统树中各种之间亲 缘位置有一定差异，但我们仍可以看出栽培稻籼粳亚种明显各自归为一支,利用 ITS 序列能 将栽培稻籼粳亚种区分开来。A:MP115B:NJ120图 1 利用 MP 和 NJ 法构建的稻属材料的系统树A 利用 MP 法构建的稻属 21 个种的系统树,其中 Tree length=589,CI=0.7250, RI=0.8912B 利用邻接法构建的稻属 21 个种的系统树Figu

24、re 1Phylogenetic trees inferred from nrDNA data sets.A: A maximum parsimony trees based on nrDNA ITS sequences from 21 species of Oryza.L by PAUP4.0(Tree length=589,CI=0.7250, RI=0.8912),Bootstrap values greater than 50% are indicated above the branches.B: A neighbor-joining tree resulting from the

25、sequence analysis of the ITS spacers plus the 5.8S rDNA from 21 species of Oryza.L by PAUP4.0,using wheat(AY450266) as outgroup. Bootstrap values greater than 50% are expressed in percentages.1251301351401451501553 结论稻属可分 AA,BB,CC,BBCC,CCDD,EE,FF,GG,HHJJ,HHKK10 种基因组,稻属中的野生种 由于其分布极其广泛,生态环境的复杂多样,在长期的野

26、生状态下,经受了各种灾害的不良环 境的自然选择,抗逆性较强,是天然的基因库,保存有栽培稻不具备的或已经消失了的遗传基 因,它们在育种中具有独特作用,是水稻育种和生物技术研究的雄厚物质基因。稻属中,染色体组 B,C,E 之间的系统发育关系一直存在着争议, Wang 等13采用核 限制性片段长度多态性(RFLP)方法研究了稻属 21 个种的亲缘关系,在单独探讨二倍体亲缘关 系时,他们认为染色体组和染色体组的关系要近于和染色体组的关系,但是在他们对全 部 21 个物种构建的聚类图上,染色体组却明显位于染色体组和染色体组共同的分支之 外,显示染色体组和另两个染色体组间较远的关系。Li 等14利用双探针

27、原位杂交技术表明 CC 和 BB 基因组之间的分化程度很大, CC 基因组与 EE 基因组之间的关系较近而同 BB 基因 组关系较远。但 Aggarwal 等15利用 AFLP 技术,Joshi 等16利用 ISSR 方法, 葛利用多基因片 段17对稻属系统发育关系研究发现表明和染色体组的关系要近于它们和染色体组的 关系.本研究通过 ITS 序列用邻接法和最大简约然法对稻属进行系统分析,都可看出稻属 A,B,C,D,E 基因组可以明显地分为三大类群, CC,CCDD,EE 基因组构成一类, BB,BBCC 基因 组构成一类,EE,GG 基因组与他们亲缘关系较远。表明 C 与 E 的亲缘关系要近

28、于 C 与 B 的亲 缘关系,与别人用 RFLP,GISH 方法结果一致.而葛利用 ITS 序只对 B,C 和 E3 个染色体组列分 析时发现 C 染色体组和 B 染色体组的亲缘关系要比它们与 E 染色体组更近,与本实验结果完 全不同,这可能与葛利用的 ITS 序列不太多,而 BBCC,CCDD 基因组提供了新的信息位点有 关。四倍体BBCC、CCDD基因组中,虽同一物种不同克隆ITS序列都存在差异，但系统分析 它们仍都可各自归为一类，例如O.latifolia种，我们选取了三个材料8个克隆的ITS序列，系 统分析时它们都组成了一支，表明ITS序列对多倍体材料的亲缘关系分析也具有较好的应用 价

29、值。以前研究表明CD基因组来自一次简单杂交,但其二倍体父母本仍然不明,当前许多工作 已经证实C基因组是做为其亲本,但另一个亲本却一直存在争议,这是因为没有二倍体的D基 因组18-19,现在存在着几种假设,一种认为D基因组消失,只存在于CD基因组中，Fukuit 20通过 GISH方法认为C基因组来源于D基因组, Wang14利用RFLP方法发现E基因组在CD基因组的 形成中起到重要作用, Li15 通过GISH分析发现E基因组较D基因组更近于C基因组,认为E基 因组可能没有直接参与CD基因组的形成.葛21用核Adh基因和叶绿体matK基因发现E基因与 CD基因组有非常高的相似性,认为是E基因组

30、参与了CD基因组的形成,后又采用matK, trnL, trnF, Adh1, Adh2和GPA1基因验证了此观点12。本研究利用ITS序列构建的系统树中,也可发 现C、CD、E基因组明显归为一支,显示三者非常近的亲缘关系.从而进一步证实了此观点的 正确性。另对CCDD基因组3个种,它们是通过单次杂交起源的，近来研究已经表明,O.alta和 O.grandiglumis应归为一个种,而O.latifolia应该保持不变22，本研究通过ITS序列对比和系统160165170175180185190195200205210215树分析也表明,前两者确实亲缘非常近而与O.latifolia较远。对

31、AA 基因组，Ren23采用 RAPD 和 SSR 标记分析了 AA 基因组的关系,虽对大部分材 料有较好区分，但仍存在少数种之间的混乱，葛利用插入序列分析了 AA 基因组,但仍不能 得出非常满意的结果24。可见 AA 基因组各种之间关系复杂。本研究系统分析发现 AA 基因 组完全构成一类,且与其他基因组存在着标志性碱基,可见虽 AA 基因组种类较多,但仍表现出 一定同源性；但另一方面,ITS 序列构建的系统树中,由于提供的信息位点有限，两种方法构 建的系统树 AA 基因组有着较大差异。利用 ITS 序列分析 AA 基因组存在相当局限性，但对 栽培稻却可以较好区分。参考文献 (Referenc

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