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1、精品论文硒对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺Fas/FasL 表达的影响1谭龙，孙伟，桑仲娜，张万起 天津医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，天津（300070） E-mail: 摘要：目的 研究适碘条件下不同硒摄入水平对实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）大鼠甲状腺细胞凋亡蛋白 Fas/FasL 表达的影响。方法 将 32 只雌性 Lewis 大鼠随机分成 4 组,分 别设为对照组(C 组)，模型组(M 组)，补硒+模型组(Se+M 组)，缺硒+模型组(Se-+M 组)，在适碘条件下（含 I 0.90 mg/kg）对各组先施加不同水平的硒(Se+M 组 2 mg/kg, C 与 M 组
2、 0.20 mg/kg，Se-+M 组 0.02 mg/kg)干预两周后，再采用猪甲状腺球蛋白免疫大鼠建立实验性自身免疫性甲状腺炎模型，取甲状腺组织制成石蜡切片，采用免疫组化检测、比较 Fas/FasL 表 达情况的差异。结果 EAT 大鼠甲状腺 Fas 及 FasL 较对照均出现表达增加，其中 Fas 的表达有随补硒水平的升高而下降的趋势，Se+M 组(光密度值 OD 0.0360.004)与 Model 组(OD0.0590.006)相比，Fas 表达明显受到抑制（F=4.888，P=0.007, q=11.591），与 Se-+M 组(0.0500.005)相比，Se+M 组 Fas 呈
3、较低表达水平(q=7.055, P=0.000)；但补硒对 FasL 的表 达无明显影响。结论 补硒能减少 Fas 在甲状腺细胞中的表达，对 AITD 的发展具有抑制作用。 关键词：甲状腺炎；自身免疫性；硒；凋亡自身免疫性甲状腺疾病（AITD）是常见的一种自身免疫性疾病，约有 1.5%的人群受到 该病的影响。有研究发现对 AITD 患者进行补硒治疗可以在一定程度上抑制疾病的发展1， 但其机制目前尚不清楚，虽然进行了许多研究，但关于补硒对 AITD 甲状腺细胞凋亡的影响 鲜有报道。笔者借助动物模型探究硒在自身免疫性甲状腺炎甲状腺细胞凋亡中所起的作用， 以期为进一步研究其作用机制提供参考和依据。1
4、. 材料与方法1. 实验动物与分组：清洁级 Lewis 大鼠 32 只，雌性，8 周龄，购自北京维通利华实验 动物技术有限公司。购进后将大鼠按随机数字表法分成 4 组，分别为正常对照组（C 组）、 模型组（M 组）、补硒+造模组（Se+M 组）、低硒+造模组（Se-+M 组），每组 8 只。动物分 组后经适应性喂养两周后，对 M 组立即进行免疫，对 Se+M 组、Se-+M 组再以不同饲料干 预两周后再进行免疫，C 组动物不做免疫和干预。M 组和 C 组喂饲普通饲料（含 I 0.90 mg/kg, Se 0.20 mg/kg）和自来水，Se+M 组、Se-+M 组分别喂饲不同 Se 浓度的适碘
5、饲料，Se 浓度 分别为 2.00 mg/kg, 0.02 mg/kg, I 浓度均为 0.90 mg/kg，每日摄碘量约为 18 g，每日硒摄入 量约为：C 组 4 g，M 组 4 g，Se+M 组 40 g， Se-+M 组 0.4 g。低硒饲料由哈尔滨医科 大学克山病研究所配制，为保证实验条件的一致性，低硒饲料加入与对照组等量的碘酸钾和 维生素 E。2.实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)动物免疫方法2：采用猪甲状腺球蛋白（pTG）和完 全弗氏佐剂（CFA）作为免疫试剂（均购自sigma公司），用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0） 将pTG完全溶解后与等量CFA充分乳化混匀制成混悬液对大
6、鼠进行免疫。免疫用量为0.8 mg/ 只，免疫部位为两后足垫，每两周1次，共3次，第3次免疫完成继续按干预条件饲养一个月 后处死动物取材检测。1本课题得到国家自然科学基金（30471440）的资助。- 5 -3.病理分析：动物处死后去甲状腺组织，于10%的福尔马林中保存，常规脱水、透明、浸腊、包埋，甲状腺组织连续切片，厚度5 m，裱于载玻片上，60 烤箱烘烤1 h后备用。 常规HE染色，封片，光镜下观察甲状腺组织的炎细胞浸润程度。4.甲状腺自身抗体的测定：采用放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA）测定甲状腺 微粒体抗体（TMAb）和甲状腺球蛋白抗体（TGAb），试剂盒购自
7、天津九鼎医学生物工程有 限公司，检测方法严格按照试剂盒说明书操作。5.凋亡相关分子 Fas/FasL 的表达：采用免疫组织化学法（immunohistochemistry, IHC） 检测 Fas/FasL 的表达，Fas 及 FasL 兔多克隆抗体购自美国 NeoMarkers 公司，广谱二抗由天 津津脉生物科技有限公司提供。操作方法参照试剂盒说明书进行。6. 免疫组化分析：Fas/FasL 阳性表达信号为甲状腺滤泡上皮细胞胞浆和胞膜有棕黄色 颗粒，定量分析采用在光学显微镜下每张玻片任选 5 个视野（2020），计数每个视野中甲状 腺细胞总数和阳性细胞数，计算每 100 个细胞中的阳性细胞数
8、。利用 Image-Pro Plus 图像分 析软件测量平均光密度和累积吸光度值（IOD）。7. 统计分析方法：计量指标均以 x s 差表示，实验数据采用 SPSS11.0 统计软件分析。 多组间比较用单因素方差分析（F 检验），若组间差别有统计学意义，采用 SNK-q 检验进行 两两比较，检验水准 =0.05。2. 结果1. 模型的判定：模型建立是否成功的标准主要有两条3：（1）出现甲状腺自身抗体；（2） 甲状腺组织有淋巴细胞浸润。本研究中 M 组经过免疫后两项甲状腺自身抗体水平较 C 组均 呈现明显升高（表 1），且病理学检查也发现甲状腺组织出现不同程度的淋巴细胞浸润，部 分小叶的结构及滤
9、泡受纤维组织浸润而遭到破坏（图 1），说明模型的建立是成功的。表 1 各组血清中甲状腺自身抗体水平（ x s ，n=8）组别TGAb（%）q 值TMAb（%）q 值CM6.761.4555.3415.45a-13.625.921.6860.9411.48a-20.44Se+M50.137.99a12.1655.897.40a18.57Se-+M57.0610.12a14.1061.546.51a20.67a：与 C 组比较，P0.05。12图 1正常及接受免疫大鼠的甲状腺 HE 染色比较（10）1 为 C 组，甲状腺滤泡结构完整，大小均匀，为检验性细胞浸润；2 为 M 组甲状腺滤泡破坏，有明显
10、炎性 细胞浸润Se+M 组、Se-+M 组与 M 组相比较，自身抗体 TGAb、TMAb 水平明显增高(TGAb： F=10.909，P=0.000；TMAb：F= 5.148，P=0.006)，但自身抗体水平有随补硒剂量增高而下 降的趋势。2. Fas/FasL 的表达：Fas/FasL 主要定位于滤泡上皮细胞的胞浆内，胞膜也有少量表达。 免疫组化结果显示 C 组 Fas 值仅有少量表达，染色浅，与 C 组相比，其他 3 组 Fas 细胞数明显增多，且表达量也显著增加(F=4.888, P0.05)，3 组的变化显示 Fas 表达量有随硒摄入 水平的升高而减少的趋势，Se+M 组与 M 组相
11、比，Fas 下降明显（q=12.256,P0.01）。EAT 大鼠甲状腺 FasL 较 C 表达明显增加（P0.05），随着补硒剂量的增加 FasL 的表达 又下降的趋势，但差异无统计学意义，且免疫组化结果显示组织染色较浅，呈散在分布。详 见表 2、图 2。表 2 各组 Fas/FasL 的检测结果（ x s ，n=8）(保留小数位)组别每 100 个细胞中的阳性细胞数平均光密度值IODFasFasLFasFasLFasFasL42 399.486C21.296.502.380.770.0290.0070.0020.001417.062 345.97913.96M88.914.30ab33.6
12、75.99f0.0590.006ij0.0200.017o84 443.549231.56rsSe+M66.007.18c27.837.90g0.0360.004k0.0160.008p52 397.606023.86tSe-+M84.603.05de33.785.71h0.0500.005lm0.0260.016q72 364.438278.56uv28 883.1925047.73w23 506.1111528.18x37 203.9523665.10ya:与 C 组比较，P0.01；b:与 Se+M 组比较，P0.01。注：表达 Fas 的阳性细胞数F=26.033，P=0.000。a:
13、M 组与 C 组比较，q=34.689，b：M 与 Se+M 相比，q= 11.753；c：Se+M 与 C 比，q=22.936；d：Se-+M 与 C 比，q=32.478，e： Se-+M 与 Se+M 比，q=9.542。P0.01。表达 FasL 的阳性细胞数F=6.235，P=0.002。f：M 与 C 相比，q=15.436；g：Se+M 与 C相比，q=12.555；h：Se-+M 与 C 相比，q=15.490，P0.01。Fas 平均光密度F=4.888，P=0.007。i：M 与 C 相比，q=15.119，j：M 与 Se+M 相比，q=11.591； k：Se+M 与
14、 C 相比，q=3.528；l：Se-+M 与 C 相比，q=10.583，m：Se-+M 与 Se+M 相比， q=7.055。P0.01。FasL 平均光密度F=3.585, P=0.026。o：M 与 C 相比，q=4.123；p：Se+M 与 C 相比，q=3.207；q：Se-+M 与 C 相比，q=5.497。P0.01。Fas 的 IODF=4.851，P=0.008。r：M 与 C 相比，q=15.641，s：M 与 Se+M 相比，q=11.922； t：Se+M 与 C 相比，q=3.719；u：Se-+M 与 C 相比，q=11.147，v：Se-+M 与 Se+M 相比
15、， q=7.428。P0.01。FasL 的 IODF=4.523，P=0.010。w：M 与 C 相比，q=4.130；x：Se+M 与 C 相比，q=3.293；y：Se-+M 与 C 相比，q=5.425。P0.01。ABCD图 2 EAT 大鼠甲状腺 Fas 免疫组化照片（400 倍视野）A：C 组甲状腺组织无炎症反应，Fas 表达不明显；B：M 组出现甲状腺滤泡破坏，Fas 表达明显增加； C：Se+M 组 Fas 少量表达，未见明显滤泡破坏；D：Se-+M 组 Fas 大量表达，滤泡破坏明显3. 讨论Fas/FasL 介导的凋亡是近年来受到广泛关注。Fas 抗原属于肿瘤因子/神经生
16、长因子受体 家族， FasL 属于肿瘤坏死因子家族， FasL 是 Fas 的天然配体，细胞通过产生的 FasL 与其 受体即 Fas 结合，即启动细胞凋亡程序。Graves disease(格雷夫斯氏病，GD)和桥本甲状腺 炎(HT)同属于甲状腺自身免疫性疾病，但由于各自的发病机理不一样，细胞凋亡蛋白在这两 种疾病中的表达情况也存在差异，最终表现为在临床表现上的不同。研究表明 HT 患者甲状 腺细胞 Fas 表达增强，且具有细胞凋亡的形态学改变，表明 HT 患者甲状腺细胞破坏受到细 胞凋亡机制的调节。但在 GD 患者甲状腺细胞中 Fas 的表达上存在争议，有研究发现 GD 患 者甲状腺 Fa
17、s 表达较正常对照明显减少，表明细胞凋亡受到抑制，与患者的临床症状相符4， 也有人发现其 Fas 表达增强但在临床却表现为甲状腺增生5，对此有人分析为同时存在的 bcl-2 等凋亡抑制蛋白的高表达削弱了 Fas 诱导凋亡的作用6。我国是受低碘危害较严重的国家之一，自实行全民食盐加碘以后这种状况有所改善7,8， 但随着加碘食盐的普遍和推广，人群中碘性甲状腺疾病的患病率出现增高。近年来由研究发 现硒具有抑制自身免疫性甲状腺炎的作用，因此有必要明确硒在其中发挥作用的相关机制， 确定在正常碘摄入条件下预防甲状腺炎发生所需硒的安全摄入量。本研究在适碘条件下对实 验动物人为建立实验性自身免疫性甲状腺炎模型
18、，并对实验动物进行补硒干预，以观察硒对 自身免疫性甲状腺炎的预防效果，研究结果显示，在适碘水平下补硒对大鼠甲状腺细胞 Fas 表达具有明显的抑制作用，并且其抑制作用随补硒量的增加呈增强趋势，与相关文献结果一 致9，补硒在一定程度上还可减少 EAT 大鼠自身抗体的产生。补硒对 FasL 表达也有一定影 响，但本次研究中未发现不同剂量组之间变化的差异，考虑可能由于机体内环境的复杂性， 影响 FasL 的因素有多种，硒可能只是其中之一，此外剂量大小也可能是其众多因素之一，因此造成此次研究未能发现 FasL 的变化趋势。可见补硒虽对 FasL 的表达作用不明显，但可减少甲状腺细胞自身凋亡蛋白 Fas
19、的表达，抑制甲状腺细胞发生凋亡，进而可对自身免疫性 甲状腺疾病的发展起到抑制作用。参考文献1Turker O, Kumanlioglu K, Karapolat I, et al. Selenium treatment in autoimmune thyroiditis: 9-month follow-up with variable doses. J Endocrinol, 2006, 190(1): 151156. PMID: 168376192孙富军,赵树君,田恩江,等. 碘对易感性不同大鼠诱发自身免疫性甲状腺炎的影响. 中国地方病学杂志.2005,24(3):251-254.3Weig
20、le WO. Analysis of autoimmunity through experimental models of thyroiditis and allergic encephalomyelitis. Adv Immunol, 1980, 30:159-273. PMID: 61607394Bossowski A, Stasiak-Barmuta A, Czarnocka B, et al. Cytofluorometric analysis of chosen markers of apoptosis CD95/CD95L (Fas/FasL) in thyroid tissue
21、s from young patients with Graves disease and Hashimotos thyroiditis. Endokrynol Diabetol Chor Przemiany Materii Wieku Rozw, 2006; 12(2): 83-90. PMID: 168137115Basolo F, Giannini R, Faviana P, et al. Thyroid papillary carcinoma: preliminary evidence for a germ-line single nucleotide polymorphism in
22、the Fas gene. J Endocrinol. 2004, 182(3): 479484. PMID: 153501896Mezosi E, Wang SH, Utsugi S, et al. Induction and Regulation of Fas-Mediated Apoptosis in HumanThyroid Epithelial Cells. Mol Endocrinol, 2005, 19(3): 804811. PMID: 155635457徐志鑫,王瑞琴,蔡旭,等. 不同人群尿碘水平监测结果分析. 中国地方病防治杂志. 2006,21(6): 366-367.
23、8次仁,马兵成,尼珍,等. 西藏林芝地区19952005年碘缺乏病监测结果分析. 中国地方病防治杂 志.2006,2l(5):286-287.9Lehmann P, Rank P, Hallfeldt KL, et al. Dose-related influence of sodium selenite on apoptosis in human thyroid follicles in vitro induced by iodine, EGF, TGF-beta, and H2O2. Biol Trace Elem Res, 2006, 112(2):119-130. PMID: 1702
24、8378The Study on the Effect of Selenium on the Expression ofFas/FasL in EAT Rats Thyroid with Adequate IodineTAN Long, SUN Wei, SANG Zhong-na, ZHANG Wan-qiDepartment of Nutrition and Food Security, Public Health College, Tianjin Medical University, Tianjin (300070)AbstractObjective To study the effe
25、ct of different selenium intake on the expression of apoptosis proteinFas/FasL in Experimental Autoimmune Thyroiditis (EAT) Rats thyroid with adequate iodine. Method32 female lewis rats were divided stochastically into 4 groups as C group, M group,Se+M group, Se-+M group, reprectively, and pretreate
26、d with feedstuffs contain different concentration of selenium (Se+M group 2 mg/kg, C and M group 0.20 mg/kg, Se-+M group 0.02 mg/kg, respectively) for twoweeks, then immunized the rats with porcine thyroglobulin (pTg) to build an experimental autoimmune thyroidism model, killed the rats at the endpo
27、int and derived thyroid gland, embedded in mineral wax and sliced,then detect the expression of Fas/FasL with immunohistochemistry and compare the difference from control. ResultBoth the expressions of Fas and FasL of EAT rats were increased compared with control. The expression of Fas in rats thyro
28、id follicular cells with EAT was down-regulated as the increased selenium intake, compared with Model group (optical density, OD:0.0590.006), the expression of Fas of Se+M (OD: 0.0360.004) group was inhibited significantly(F=4.888，P=0.007, q=11.591), and Fas was expressed less in the Se+M group than Se-+M (OD:0.0500.005) group(q=7.055, P=0.000), seleniums effect on FasL was not detected. Conclusion Increasing the intake of selenium can decrease the expression of Fas on thyroid follicular cells and restrain the promotion of EAT, it can.Key words：Thyroiditis; autoimmune; Selenium; Apoptosis