重组大肠杆菌 BL21(pUC19-Hyp)产羟脯氨.doc

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1、精品论文重组大肠杆菌 BL21(pUC19-Hyp)产羟脯氨酸的补料分批培养袁春伟1,2，张胜利1,2，刘合栋1,2，何艳春1,2，张震宇1,25（1. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122） 摘要：利用本实验室构建的组成型重组大肠杆菌 BL21(pUC19-Hyp)为出发菌株，在 7 L 发酵 罐中，运用间歇流加、指数流加、恒速流加三种流加碳源的方式进行补料分批培养。结果表 明：以 0.3 g/min 恒速流加为最优，在发酵开始 44 h 时羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)的浓10度达到最高，浓度

2、为 42.50 g/L，脯氨酸（Proline，Pro）转化率为 81，此时细胞干重为 21.33 g/L，残糖浓度为 0.17 g/L。Hyp 含量与摇瓶发酵时的 1.39 g/L 相比提高了大约 30 倍，比日 本株式会社的发酵产量提高了 1.50 g/L1，发酵过程中消耗的葡萄糖与产生的 Hyp 质量之比约为 4:1。发酵液中的氨基酸分析结果表明，除 Pro、Hyp 外的其他氨基酸含量均低于 1 mg/L，发酵液中主要氨基酸为 Pro 和 Hyp。15关键词：发酵工程；重组大肠杆菌；羟脯氨酸（Hyp）；恒速流加中图分类号：Q819Production of Hydroxyproline

3、by fed-batch culture of novel recombinant Escherichia coli BL21(pUC19-Hyp)20Yuan chunwei1,2, Zhang shegnli1,2, Liu hedong1,2, He yanchun1,2, Zhang zhenyu1,2(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, JiangSu WuXi 214122;2. School of Biotechnology, Jian

4、gnan University, JiangSu WuXi 214122)Abstract: We processed the supplementary fe-batch cultivation in the 7 L fermentor by use of the25constitutive recombinant escherichia coli BL21 (pUC19 - Hyp), starting strain,constructed in our lab and three different ways of flow and carbon source which contain

5、s intermittent flowaddition, index flow addition and constant speed flow. The results showed that the optimal method was constant speed flow with 0.3 g/min. After 44 hours of fermentation, the concentration of Hydroxyproline was the highest which was 42.50 g/L; Proline conversion rate is 81%; the ce

6、ll dry30weight is 21.33 g/L; residual sugar concentration is 0.17 g/L. Compared with shaking flaskfermentation with concentration of 1.39 g/L, Hyp content improved about 30 times and at the same time, the fermentation yield improved 1.50 g/L than Japan Ltd 1. In the process of fermentation, the rati

7、o of glucose consumption and product of Hyp is about 4:1. The analysis of amino acids in the fermentation liquid showed that, Pro and Hyp are the main amino acids in35fermentation liquid, and except for Pro and Hyp, the other amino acids are less than 1 mg/L.Keywords: fermentation engineering; recom

8、binant Escherichia coli; Hydroxyproline; constant feeding0引言40羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)属于手性分子，不属于 20 种常见氨基酸，共有 8 种同 分异构体。本实验所产 Hyp 为反式-4-羟基-L-脯氨酸（Trans-4-Hydroxy-L-proline）以下均简 称 Hyp。Hyp 的分布很广，是胶原、明胶、植物细胞壁蛋白质和微生物次生代谢产物的重要基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（200802951036）；国家自然科学基金（30800018）；国家 自然科学基金（30970058）；工业生物技术

9、教育部重点实验室主任基金（KLIB-ZR200801） 作者简介：袁春伟，（1988-），男，在读硕士研究生，主要研究方向：发酵工程。 通信联系人：张震宇，（1976-），男，教授，主要研究方向：分子生物学，发酵工程。 E-mail:- 11 -组成成分2。近些年来 Hyp 在食品、医药、化妆品方面发挥了不可替代的作用，可以作为婴幼儿食品3和一些非哺乳动物的饲料添加剂,还起到调节脂肪乳化4、抗肿瘤、抗高血压545等作用，另外在化妆品方面也可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用6。Hyp是哺乳动物胶原的重要成分7，目前国内生产Hyp的方法主要是利用水解法直接从 胶原中提取。至于化学合成法

10、，由于生产成本高昂，一般不被采用。水解法存在众多负面作 用8，例如：生产和纯化的步骤较多导致最终产率很低；在生产过程中必须加入一些有毒害 作用的溶剂或试剂（亚硝酸等）；有废料产生等。微生物发酵法产Hyp则避免了这些负面影50响，且对发酵底物的利用率高，过程无毒害是一种替代传统水解法的理想方法。1材料与方法1.1 材料1.1.1菌种和质粒大肠杆菌 BL21(pUC19-Hyp)由本实验室构建，其中脯氨酸羟化酶基因由多拷贝质粒55pUC19 携带转入宿主菌。1.1.2培养基LB 培养基：胰蛋白胨 10 g/L；酵母提取物 5 g/L；氯化钠 10 g/L；pH 值为 7.0-7.2。加 入 20

11、g/L 的琼脂为 LB 固体培养基。发酵培养基：葡萄糖 10 g/L；甘油 5 g/L；胰蛋白胨 8 g/L；硫酸铵 5 g/L；磷酸氢二钾 1 g/L；60氯化钠 2 g/L；以下分开灭菌：硫酸镁 0.2 g/L；硫酸亚铁 3 mM；氯化钙 0.015 g/L；脯氨酸400 mM。补料培养基：葡萄糖 400 g/L。 补料培养基：质量分数 30 左右的氨水。 培养基在接种前加入 0.05 g/L 的氨苄青霉素（AMP）。651.1.3主要设备德国 BioFlo415 7 L 发酵罐；SBA - 40 C 型生物传感分析仪；日立 L-8900 氨基酸分析仪。1.2 培养方法菌种活化：将冷藏于-

12、80 冰箱的菌种划线接种于 LB 固体培养基，37 培养过夜，70用活化后的菌种制备斜面种子，保存待用。 种子制备：从斜面培养基挑取单菌落，接种至装有 30 mL LB 培养基的 250 mL 三角摇瓶中，37 ，220 r/min 摇床培养 8 h。7 L 发酵罐中补料分批培养：将种子以 6 的接种量接种于装液量为 4 L 的 7 L 发酵罐 中，温度为 35 ，用质量分数为 30 的氨水控制 pH 值为 6.5 以上，通气量为 1-3 vvm，75搅拌转速为 400-900 r/min，在发酵过程中，将通气量和搅拌转速一同与溶氧关联，控制发酵 罐中的溶氧水平保持在 40 以上，当到达一定时

13、间不能满足 40的溶氧时便保持最高通气 量和最大搅拌速率。每次取样测定 A600 及发酵液中剩余葡萄糖含量等参数，以残糖的耗尽 为标志开始补料，在 8 h 时残糖降低到 0.05 g/L 左右，此时开始运用不同的流加方式开始补 料。801.3 检测与分析溶氧测定：本实验中溶氧电极校准方法为：转速和通气量均设为初始值（400 r/min，1 vvm），断开溶氧电极与电脑的连接线，此时校准为零，然后所有料液添加完毕，溶氧稳定 之后，接种前校准为 100 。葡萄糖浓度测定: 发酵液 12000 r/min，4 冷冻离心 2 min 后,取上清，用 SBA - 40 C 型85生物传感分析仪测定(山东

14、省科学院生物研究所)。 全氨基酸测定：日本日立氨基酸分析仪。600细胞干重测定方法 : 分光光度计测定 A值，然后依照 Korz D J9等人的方法,根据实9095100105110验数据拟合细胞干重（Dry Cell Weight）和菌液 A600 值的回归方程为 DCW（g/L）=0.54A600。Hyp 的测定方法:氯胺 T 法10。具体步骤如下：配制 Hyp 标准液：浓度分别为 1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、5 mg/L。空白溶液为水。待测样：取发酵液 12000 r/min，离心 2 min,稀释 一定的倍数以保证分光光度计在一定的测量范围内读数，在试管中均定容到 250

15、0 L。加 入 1 mL 氯胺 T， 20 min 后再加入 1 mL 显色剂，加盖混匀，置于 60 水浴锅中加热 20 min， 取出后置于冷水中静置 1 min。用分光光度计在 560 nm 处测 A560，然后根据标准曲线计算 出待测样的 Hyp 浓度。2结果与讨论在发酵 8 h 时残糖基本耗尽，经测定葡萄糖含量为 0.05 g/L，但此时的溶氧并未出现上 升的迹象，主要是因为脯氨酸在羟基化的过程中需要大量氧气的参与，如图（1），这也是 发酵过程中溶氧始终维持较低水平的一个重要原因，从而确定初次流加培养基的标志不是溶 氧的突然上升而是残糖的基本耗尽。图（1）羟脯氨酸的生物转化Fig.1

16、Biotransformation of Trans-4-Hydroxy-L-proline2.1 间歇流加间歇流加是将流加操作分为几个间断进行，在各个流加间断的起始即完成流加，其余时 间均为分批发酵。间歇流加可以迅速补糖，对发酵的各个间断的葡萄糖消耗情况加以控制， 间歇发酵又可分为基于指数关系的间歇流加、基于恒速关系的间歇流加和基于反馈方式的间 歇流加等等，本实验中采用基于恒速关系的间歇流加。实验分两组进行，间隔两小时补料一 次，组每次流加 20 g 葡萄糖溶液，组每次流加 40 g 葡萄糖溶液，间隔 4 h 取一次样（在 补料前取样）。结果如图(2)-（4）。图（2）间歇流加时残糖浓度变化

17、Fig.2 The variation tendency of residual glucose concentration during the intermittent flow addition fermentation115图（3）间歇流加时吸光度变化Fig.3 The variation tendency of absorbance during the intermittent flow addition fermentation图（4）间歇流加时 Hyp 浓度变化Fig.4 The variation tendency of Hyp concentration during th

18、e intermittent flow addition fermentation120125130135140流加葡萄糖后组和组的葡萄糖瞬时浓度分别接近 5 g/L 和 10 g/L，但是每次取样在补料前进行，所以测得葡萄糖浓度是经过菌体一段时间消耗后的残糖浓度。由图（2）可知， 组葡萄糖在每次补料前基本耗尽，组的葡萄糖呈现累积的趋势，说明菌体消耗葡萄糖的 速率介于二者之间。由图（3）可知在发酵 8-16 h 之间低浓度的葡萄糖有利于菌体生长，但 是随着菌体的生长葡萄糖含量逐渐成为组菌体生长的限制性因素，而组在 16 h 后可较 快速生长。但是组在 44 h 后由于副产物、代谢产物的生成和残

19、糖浓度过高等一系列因素 导致生长趋于稳定，组菌体密度继续呈上升趋势。由图（4）可知，在 44 h 之前组的 Hyp 产量略高于组，之后组略低于组，并且两组 Hyp 产量均有所降低，主要是副产 物或菌体自溶产生的物质将 Hyp 分解所致，最终组在 44 h 获得最高 Hyp 产量为 27.546 g/L。间歇发酵过程中，葡萄糖浓度变化剧烈，虽然有些发酵实验中间歇流加取得了较好的成 果，但是本实验证明间歇流加并不利于 Hyp 的生产，因此我们就需要寻求另外的流加方式 来进一步优化，从本实验中可以看出菌体的耗糖量在 10-20 g/h 之间。2.2 指数流加菌体的生长需要一个合适的流加速率，流加速率

20、过高容易产生代谢副产物，流加速率过 低影响生产强度的提高。指数流加是一种基于物料平衡理论对某些参数进行合理假设的前置 流加控制策略，可使底物的流加与发酵罐中菌体的增长相适应。流加速率 F 的计算公式11：F=(X0V0)/Y(SF-S) et公式中， 为比生长速率；t 为流加时间；X0 为细胞浓度；V0 培养物体积；（X0V0）也就是发酵罐中的细胞量，在每次流加前测量；Y 为细胞得率；SF 为流加培养基浓度；S 为底 物浓度。表 1 指数流加策略中相关参数的设定Table 1 The setting values of relevant parameters in index flow add

21、ition strategy/ h-1 Y/gg-1 SF/g L-1 S/g L-1设定值 0.36 400 10145150为满足菌体生长时的物料平衡，在菌体的快速生长期采用对数流加策略，快速生长期过后则保持前段时间的流加速率采用恒速流加。由于流加速率 F 是一个与时间 t 有关的指数函 数，采用流加软件控制流加速率，使流加速率 F 随时间 t 的改变而时时改变。根据间歇发酵 的平均比生长速率，该实验分三组进行，比生长速率 设定为：表 2 指数流加策略中比生长速率 的设定Table 2 The setting values of specific growth rate in index

22、flow addition strategy分组 组 组 组 比生长速率/ h-1 0.12 0.08 0.05利用上面的函数公式计算出相应时刻的流加速率 F（Lh-1），并以此速率流加发酵。图（5）指数流加时残糖浓度变化Fig.5 The variation tendency of residual glucose concentration during the index flow addition fermentation155160图（6）指数流加时吸光度变化Fig.6 The variation tendency of absorbance during the index flo

23、w addition fermentation图（7）指数流加时 Hyp 浓度变化Fig.7 The variation tendency of Hyp content during the index flow addition fermentation165170175180185190195从残糖的角度来看，如图（5）所示，在 8-12 h 由于流加速度较慢，此时残糖基本耗尽，在 12-20 h 根据比生长速率的不同，残糖浓度逐渐出现差距。定时取样测定残糖浓度和及时 调控流加速率 F 可以有效避免葡萄糖过大积累，组、组和组分别在 12 h、16 h、28 h 开始恒速流加，流加速率 F

24、分别为：0.561 g/L、0.439 g/L、0.393 g/L。恒速流加后残糖浓度 与发酵时间基本呈一次函数上升，说明后期葡萄糖的单位时间消耗量基本恒定。从发酵液吸 光度方面来看，如图（6）所示，在流加初期组流加速度较快，碳源供应充分，细胞密度 迅速上升，其余两组细胞密度随残糖的降低而降低，但是后期高浓度的残糖和代谢副产物共 同影响菌体生长，细胞密度又随残糖浓度的增大而减小。至于 Hyp 的产量，如图（7）所示， 由于残糖浓度过高带来的危害导致三组 Hyp 均过早降解，第组在 40 h 时 Hyp 的最大产量 为 24.809 g/L，尽管指数流加较间歇流加平稳的多，但最终产量却并不理想。

25、菌体不适合指数流加，对此我们进一步分析。在菌体生长阶段采用指数流加必须具备一 些条件，其一:菌体的生长遵循 Monod 方程12。Monod 方程:=maxS(KS+S)公式中，max 为最大比生长速率，S 为限制性基质浓度，KS 为基质半饱和常数，即：细 胞比生长速率为 max 的一半时的基质浓度。该方程是用来描述无抑制的细胞生长模型，脯 氨酸羟化酶为生长偶联型，在羟基化反应中与细胞竞争氧气明显抑制了细胞生长。在接种后5 h，发酵罐中的溶解氧降低到 4左右，从而使得溶解氧成为菌体生长时不可忽略的因素之 一。一般发酵时，随着菌体密度的增大葡萄糖消耗量也随之增大，但是本实验中脯氨酸羟化 酶的量也

26、在增大，相应需要更多氧气参与脯氨酸的羟基化，从而使得菌体生长受到一定抑制， 很难正常指数生长，进而确定该发酵过程不是无抑制的菌体生长，不适合指数流加方式。从 残糖浓度看出，菌体对葡萄糖的利用基本恒定，下面采用恒速流加方式进行优化。2.3 恒速流加恒速流加相对于指数流加在操作上更为简单，只需在补料开始时设定流加速率，不必在 过程中改变流加速率。恒速流加时遵循以下物料平衡方程13：细胞平衡：d(VX)/dt=Vrx 碳平衡：d(VS)/dt=Vrs+FS0 产物平衡：d(VP)/dt=Vrp其中：V 为培养物体积（L）；X 为培养基中细胞密度（g/L）；rx 为细胞生长速率g/(Lh)； S 为培

27、养基中碳源浓度（g/L）；rs 为碳源的消耗速率g/(Lh);F 为流加速率（L/h）；S0 为补 料培养基碳源浓度（g/L）；P 为培养基中产物浓度（g/L）；rp 为产物形成速率g/(Lh)；t 为时间（h）。实验时对初始流加葡萄糖速率进行控制，测定发酵液中的残留葡萄糖浓度， 然后再结合各项指标确定最适流加速率。实验分三组进行，设定的流加速率 F 分别为：表 3 恒速流加策略中流加速率 F 的设定Table 3 The setting values of flow velocity in the constant speed flow strategy分组 组 组 组 流加速率/(g/mi

28、n) 0.20 0.30 0.40图（8）恒速流加时残糖浓度变化Fig.8 The variation tendency of residual glucose concentration during the constant speed flow fermentation200图（9）恒速流加时吸光度变化Fig.9 The variation tendency of absorbance during the constant speed flow fermentation图（10）恒速流加时 Hyp 浓度变化Fig.10 The variation tendency of Hyp con

29、centration during the constant speed flow fermentation205210215220225230235关于溶氧问题，以恒速流加的第组为例进行分析，初始设定溶氧不低于 40 ，但是在发酵第 6 h 搅拌转速和通气量均为最大才能满足，在第 7 h 溶氧便迅速降到 4 且以后一 直保持这种低溶氧状态，直到发酵结束菌体开始自溶后溶氧才略有上升的趋势。其它流加方 式和流加速率的溶氧也与此种类似，流加速率较低的溶氧略高点，如：恒速流加的第组由 于碳源不足溶氧从 7 h 的 4 上升到放罐时的 30 。细胞只有在葡萄糖浓度合适的情况下 才能既保证自身的生长，又

30、有足够的能量和氧气合成 Hyp，如果葡萄糖不足，细胞只能维持 自身的生长，从而没有多余的能量用来很成 Hyp。从残糖方面分析，如图（8）所示，前两组残糖都稳定在一定范围，其中组残糖浓度 维持在 0.05-0.10 g/L 之间，组残糖浓度维持在 0.10-0.20 g/L 之间，但是当流加速率再次 提高时残糖含量不在继续稳定在一定范围内，而是产生积累现象，例如：组在 16 h 之后 残糖浓度几乎成一次函数趋势上升，说明此时在物料平衡方面，碳源的输入已经大于细胞的 消耗，葡萄糖浓度随时间的增长成一次函数上升说明细胞对葡萄糖的消耗为匀速消耗，即：F-rs=kF 为流加速率；rs 为碳源的消耗速率，

31、k 为发酵液中残糖浓度的增长速率，由上图可知残糖浓度随时间的增长成一次函数上升，说明 k 近似为常数，又因为该流加方式为恒速流加， 所以 F 也是一个恒定值，因此 rs 也近似为恒定值。在菌体密度方面，如图（9）所示，组由于碳源严重不足，限制菌体的生长，无论是生长速率还是最大细胞密度都不如其他两组，组由于残糖浓度过高易产生代谢副产物影响 菌体生长，菌体密度低于组，大致趋势相似，在 36 h 达到稳定期。最后在 Hyp 方面进行 分析，在 24 h 之前，三组数据几乎近似一样，没有明显差距，在稳定期（36 h 后）差距较 为明显，组在 44 h 时出现最大 Hyp 产量 42.5 g/L，Pro

32、 转化率为 81，可见以 0.3 g/min 的流加速率对于稳定期产 Hyp 还是比较有利的，比同种流加方式的其他两种流加速率拉开 了较大的差距。结合菌体密度和 Hyp 浓度变化曲线可以看出，Hyp 的产生是非生长依赖型 的，图（10）中组的 Hyp 在发酵中后期产率迅速上升，和其他两组迅速拉开差距，但是 在细胞密度方面和组几乎相似，从而可以确定，由于溶氧的限制，合适的流加速率在细胞 生长方面帮助较小，在 Hyp 的产率和稳定性方面有较大帮助。在工业生产中较低的糖酸比（发酵中消耗的葡萄糖质量与产生的 Hyp 质量之比）能给 企业节约生产成本带来更大的经济效益，以 0.3 g/min 的流加速率

33、恒速流加时，在 44 h 共消 耗葡萄糖 688 g，产生 Hyp 170 g，质量比约为 4:1。以 0.2 g/min 的流加速率恒速流加时，在40 h 共消耗葡萄糖 424 g，产生 Hyp 57.76 g，质量比约为 7.3:1。以 0.4 g/min 的流加速率恒 速流加时，在 44 h 共消耗葡萄糖 904 g,产生 Hyp 108 g，质量比约为 8.4:1。对本实验中的发酵液进行氨基酸分析，分析在发酵过程中是否有其他氨基酸产生及其含 量，以及脯氨酸的残留量。使用日本日立氨基酸分析仪，注射 20 uL 样品，分析图像如（11）-（13）：240245250图（11）氨基酸分析图谱

34、Fig.11 The analysis chart of amino acids in fermentation broth测定的各种氨基酸分析结果如图（12）和（13）所示：图（12）氨基酸分析结果Fig.12 The analysis result of amino acids图（13）脯氨酸分析结果Fig.13 The analysis result of Proline255从图（11）-（13）可以看出，除羟脯氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸的含量都很低，其中苯丙氨酸（Phe）的含量为 0.49 mg/L，为杂氨基酸中含量最高。NH3 浓度较高主要是因 为在流加发酵过程中以流加氨水的方式

35、调节 pH，致使最终的 NH3 浓度会较高。3结论重组大肠杆菌发酵生产 Hyp 过程中发现，采用恒速流加策略实现了大肠杆菌的高产， 产量达到了 42.50 g/L。残糖浓度对菌体的生长特别是最终产物的产量影响较大，较低的残260265糖浓度使菌体的生长保持较低的比生长速率，有效缓解了过高比生长速率产生乙酸带来的危害，比生长速率的降低又减少了菌体对氧气的消耗，可以保持一定的溶氧以满足 Pro 羟基化 过程中的溶氧需求。尽管菌体的比生长速率较低，但是溶氧却一直很难满足菌体生长的需要，实验中通入的 是无菌空气没有使用纯氧，整个发酵过程溶氧都成为限制性因素，之后的优化可以在增加溶 氧方面展开，如：在菌

36、体中导入血红蛋白基因提高细胞的氧气利用率、增加罐压和通入纯氧 等等。参考文献 (References)2702752802851Shibasaki T.; Ozaki A.and Mori H. Enzymatic production of trans-4- hydroxy-L-proline by regio- and stereospecific hydroxylation of L-proline.Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 2000,64(4):746750.2Kuttan R and Radhakrishnan AN.Bio

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