《鲈鱼 PPARα 基因荧光定量 PCR 质粒标准品的构建1.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鲈鱼 PPARα 基因荧光定量 PCR 质粒标准品的构建1.doc（5页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、精品论文鲈鱼 PPAR 基因荧光定量 PCR 质粒标准品的构建1方雯，钱云霞 宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波（315211） E-mail：摘要：利用SYBR荧光定量PCR技术，制备用于鲈鱼PPAR基因实时荧光定量PCR检测的 质粒标准品。通过PCR扩增出目的片断，纯化后连接至pMDI8-T载体，转化宿主菌E.coliDH5，通过PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析，确认重组质粒完整正确，抽提重组质粒， 测定其拷贝浓度，10倍梯度稀释成标准品模板，进行荧光定量PCR分析。结果显示，循环阈值(ct)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。 关键词：鲈鱼；PPAR 基因；实时荧光定量 P
2、CR；重组质粒；标准品中图分类号：Q786文献标识码：A过氧化物酶体增殖剂激活受体 (peroxisome proliferators activated receptors ,PPAR)是一 类能被内源性脂肪酸以及外源性过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators ,PP)激活的甾 体激素受体超家族成员1,2。与其它甾体激素受体一样，PPAR也是配体激活转录因子，通过 与位于某些基因上游的特异的DNA反应元件（peroxisome proliferator responsive element， PPRE)相互作用而调控基因表达3。目前在哺乳动物、鸟类、两栖动物中发现
3、PPARs存在三 种亚型：PPAR、PPAR ( 也称PPAR) 和PPAR，分别由不同的基因编码。其中，PPAR 的主要功能是激活脂质分解代谢中的相关基因并且与过氧化物酶体增值有关4；PPAR参与 基础脂质代谢及胚胎植入和生长5；PPAR则在脂肪细胞分化中起关键作用6。许多研究发现，一些有机污染物（多环芳烃PAH、多氯联苯PCB、雌性激素、某些杀虫 剂和除草剂）能引起鱼体过氧化物酶体增值反应7。近几年来，中外学者在鱼中相继发现不 同亚型的PPAR基因8,9,10，以及在各个组织中的分布表达情况，但是具体功能尚不清楚。因 而建立一种高效、灵敏的PPAR基因检测方法至关重要。实时荧光定量 PCR
4、 技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在 PCR 反应体系中加入荧光基 团，对整个 PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着 反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线11，通过这个标准曲线对 未知模板进行精确定量分析的方法。而标准品是制备标准曲线的前提，本文介绍了用于实时 荧光定量 PCR 检测鲈鱼 PPAR 基因的质粒标准品的构建方法。l. 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 动物和宿主菌花鲈购买于宁波水产品大世界， 宿主菌为 Ecoli DH5a，由本实验室保存。1本课题得到（1. 国家自然科学基金、鲈鱼 PEP
5、CK 基因启动子的克隆及其 PPAR 应答元件的鉴定、编号30671608 2. 宁波市科技局、鲈鱼过氧化物酶体增殖作为海洋污染的生物标记物研究、编号 2006A610088 ） 的资助。- 5 -1.1.2 主要试剂和仪器Trizol Reagent (Invitrogen)，PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TAKaRa）， pMD18-T Vector(TaKaRa)，Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶 SalI 和 EcoRI(TaKaRa)， TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit，
6、Biospin Gel Extraction Kit(杭州博日)，Bio-Rad PCR 仪，荧光定量 PCR 仪（Stratagene）。1.2 实验方法1.2.1 RNA的提取解剖花鲈，迅速取鲈鱼肝脏50-100mg，液氮速冻，参照Trizol Reagent试剂说明书进行。 提取的RNA（图1）用DEPC处理灭菌纯水20-40uL溶解，-70 oC保存。1.2.2 cDNA的合成图1 RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA参照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TAKaRa
7、）说明，用Oligo dT Primer进行逆转录合成鲈鱼cDNA，-20 oC保存。1.2.3 重组标准品质粒的制备PCR扩增引物为Pl：5GCTGAAGGCGGAGATGGTAAC3；P2：5ACCCAGGGACG- GACTTTGC3。由上海英峻生物技术公司合成。PCR反应体系为：cDNA模板1uL，引物P1 (10mol/L)、P2 (10mol/L)各1uL，10Xbuffer 5uL，dNTPs (各2.5mmol/l) 4uL，Taq DNA聚合 酶0.5uL，用水补充至总体积50uL。PCR扩增在Bio-Rad PCR仪上进行，反应条件：95预变 性3 min；然后95 50
8、s，57 40 s，72 30 s，33个循环；72 2 min。扩增产物的长度为344bp ，经1琼脂糖凝胶电泳后，目标条带用Gel E x tractio n Kit 进行纯化、回收。 纯化的PPAR扩增片断连接到pMD18-T载体上，转化至DH5a宿主菌。挑取经Amp抗性 筛选出的转化菌落进行扩繁，对重组质粒分别进行PCR、双酶切鉴定，将阳性克隆送往上海 I n vi t r ogen 公司测序。测序结果进行比对，对测序完全正确的菌株，低温冻存保种。1.2.4 重组质粒标准曲线的建立 根据测得的重组质粒的质量浓度C0(g/uL)换算成重组质粒的拷贝浓度C(copy/uL)，换算公式：C=
9、( C0 X6.02 X 1023 )/MW 。将母液浓度调整至1X1010copy/uL作为原液，并取部分原液作10倍系列稀释成108-104 copy/uL 的梯度浓度标准品，分装冻存备用。 荧光定量PCR的引物为FP：GGCCTACCTCAAGAACTTCAACA；RP：5 CGACCATCTT-TGCCACCAG3，由上海英骏生物技术公司合成。引物跨内含子设计，并经严格比对，保证 其特异性，扩增片断长度为141 bp。以梯度浓度标准品为模板，反应体系为：SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 12.5uL，引物FP(10mol/L)、RP(10mol/L)各0.5uL，RO
10、X Reference Dye（50 X）0.5uL,质粒模板2uL，以水补充至25uL。反应条件：95 10s，95 5s，56 30 s，72 20s。读板，40个循环。反应结束后，联机生成标准曲线。2. 结果2.1 重组质粒的鉴定以重组质粒DNA为模板，用引物P1和P2从中扩增出预期的344 bp的条带（图2）。根据 pMD18-T质粒的多克隆位点，用SalI和EcoRI对提取的重组质粒进行双酶切，从琼脂糖凝胶 电泳的结果(图3)可见大、小2个条带，与预期的结果相符，对重组质粒DNA的测序结果经blast 分析，插入DNA片段的序列与原始序列片段的同源性达到100，说明所插入的外源基因为
11、 目的基因片段，即质粒连接、转化成功，标准质粒构建成功。图2 重组质粒的PCR鉴定图3 重组质粒的双酶切鉴定Fig.2 The identification of recombinant plasmid by PCRFig.3 The identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion2.2 标准曲线的构建2.2.1 标准品质粒的PCR检测 纯化的标准品重组质粒的质量浓度为0.096ug/uL，其摩尔质量为1.975 X 106g/mol，通过换算得其拷贝浓度为3.139 X 1010copy/uL 。将母
12、液稀释3.139倍，得到1 X 1010copy/uL的原液，再按10倍比例稀释成1 X 108-1 X 104的梯度浓度标准品。以此梯度浓度标准品为模板，FP、 RP为引物，经PCR扩增，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合，条带亮度按模 板浓度依次递减(图4)。图4 梯度浓度标准品PCR检测Fig.4 The PCR detection of serially diluted plasmid standards M.DNA Marker-DL2000；1-6分别为108，107，106，105，104 （copy/uL） 的质粒标准品和阴性对照M.DNA Marker-DL2000；
13、Lane 1- Lane 6 represent plasmid standards of108，107，106，105，104 （copy/uL）and no template control respectively2.2.2标准品质粒的荧光定量PCR检测模板为系列稀释的108-104 copy/uL 的梯度浓度标准品，每个梯度设三个重复。荧光定 量PCR结果显示（图5）：各梯度起始模板拷贝浓度(log值)与循环阈值(Ct)之间呈良好的线性 关系，扩增效率Eff = 100.8%，重复性良好。由曲线（图6）看出，起始模板与Ct值之间呈良 好的线性关系，相关系数R20.998。系统生成的回归
14、方程为：y=-3.302x+43.36. 经系统自动 分析，扩增峰值单一，产物的解链温度值非常均一，为86.6(见图7)，说明产物扩增具有特 异性。图5 质粒标准品的扩增曲线Fig.5 The amplification plots of plasmid standards图6 质粒标准品的标准曲线Fig.6 The standard curve of plasmid standards3. 讨论图7 质粒标准品的溶解曲线Fig. 7 The dissociation curves of plasmid standards实时定量PCR技术检测的准确性首先取决于合格标准品的构建，质粒DNA、体
15、外逆转录的RNA及纯化的dsDNA都可以作为标准品用于构建标准曲线，但是无论是体外转录的RNA 还是dsDNA用作标准品构建标准曲线时其稳定性与重复性都不及质粒DNA12。SYBR Green I是一种双链DNA结果染料，在Real-time PCR对核酸的灵敏检测和定量中广泛应用13。在本实验中，采用SYBR Green I荧光染料法，以不同浓度标准品质粒DNA分别进行荧光定量PCR扩增，重复性好，起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系，建立了检测PPAR基因的Real-time PCR标准曲线，为准确测定花鲈体内的PPAR基因表达量提供了必要的技术平台。参考文献1 张乾勇.PP AR 的
16、结构与功能及其生物学作用J.国外医学卫生分册.2000m27（5）:284-288. 2 李利平 m 付方明. PPAR 研究进展J. 国外医学内分泌学册,2003,23(1):29-32.3Boukouvala E, Antonopoulou E, Favre-Krey L .Molecular characterization of three peroxisome proliferator-activated receptors from the sea bass (Dicentrarchus labrax).Lipids.2004,39(11):1085-92.4 Schoonjans
17、 K,Staels B,Auwerx J.The peroxisome proliferator activated receptors（PPARs）and their effects onlipid metabolism and adipocyte differentiationJ.Biochim Biophys Acta,1996,1302:93-109.5 Kersten S,Desvergne B,Wahli W. Roles of PPARs in health and diseaseJ. Nature,2000,405:421-424.6 Peters JM,Lee SST,Li
18、W,et al. Growth,adipose,brain,and skin alterations resulting from targeted disruption of the mouse peroxisome proliferator-activated receptor（）J.Mol Cell Biol ,2000,20:5119-5128.7Cajaraville MP,Orbea A, Ibabe A,et al. Peroxisome proliferation as a biomarker in environmental pollution assessmentJ. Mi
19、cros Res Tech,2003,61:191-202.8 Andersen O,Eijsink VG,Thomassen M. Multiple variants of the peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)gamma are expressed in the liver of atlantic salmon (Salmo salar) J. Gene,2000,255(2):411-418.9 Michael J L, Evridiki B, Efthimia A, et al . Three Peroxisome P
20、roliferator-Activated Receptor Isotypes from Each ofTwo Species of Marine FishJ. Endocrinology ,2004, 146（7）:3150-3162.10 Maglich JM, Caravella JA, Lambert MH, et al .The first completed genome sequence from a teleost fish (Fugu rubripes) adds significant diversity to the nuclear receptor superfamil
21、yJ .Nucleic Acids, 2003 ,31:40514058.11 Steuerwald N,Cohen j,Herrera R J.An alysis of gene expression in single oocytes and embryos by realtime rapid cycle fluorescence monitored RT-PCRJ.Brenner CAMol HumReprod,1999,5(11):1034-1039.12 Bustin S A.Absolute quantification of mRNA using real-time revers
22、e transcription polymerase chain reaction assaysJ.J Mol Endo,2000,25:169-193.13 Simpson D A,Feeney S,Boyle C,et a1.Retinal VEGF mRNA easured by SYBR green I fluorescence:Aversatile approach to quantitative PCR J.Mol Vis,2000,6:178-183.Construction of plasmid standards for detectingLateolabrax japoni
23、cus PPAR gene by real-time PCRFANG Wen, QIAN Yun-xiaFaculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo (31521l)AbstractThis experiment is to construct recombinant plasmid as the standards for Lateolabrax japonicusPPAR gene detection by real- time fluorescence quantitative PCRA 344-
24、bp DNA fragment wasamplified by PCR, cloned into pMD18-T vector, transformed into bacterium DH5 and sequenced. The concentration of purified plasmid DNA solution was determined and ten-fold serially diluted into 108 to104 copy/uL. Standard curves were constructed by real-time PCR detection with the series of plasmid standards . The results indicated that the standard curves were shown to be of high linearity.Key words:Lateolabrax japonicus; PPARgene; Real- time fluorescence quantitative PCR; Recombinant plasmid; Plasmid standards作者简介：方雯（1986），女，硕士研究生，主要研究方向为生物化学与分子生物学。