1800 MHZ电磁波暴露对大鼠海马N甲基D天冬氨酸受体表达的影响.pdf

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1、基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30640116） 作者单位： 650032 云南， 昆明医学院公共卫生学院环境卫生学教研室 通信作者： 吴锡南 论著 1800 MHz 电磁波暴露对大鼠海马 N-甲基-D-天冬氨酸受体表达的影响 黄春桃 刘苹 武慧欣 王静林 吴锡南 【摘要】 目的 观察 1800 MHz 电磁波暴露对大鼠海马内 NMDA 受体亚单位 NR2A、 NR2B 表达 的影响。方法 将 4 周龄雌性 Wistar 大鼠随机分为 4 组 （0. 5 和 1. 0 mW/ cm2剂量组， 各实验组分别 设置 1 个对照组） ， 每组 12 只。其中 2 个实验组大鼠每天 12 h

2、 暴露于频率为 1800 MHz、 功率密度分 别为 0. 5 mW/ cm2和 1. 0 mW/ cm2的电磁波环境中， 共暴露 21 d， 同时， 采用免疫组织化学和图像处 理方法分析海马 CA1、 CA3、 齿状回 NR2A 和 NR2B 的表达。结果 （1） NR2A 蛋白表达： 0. 5 mW/ cm2 剂量组在 CA3 区表达的免疫反应灰度值为 （8. 5 1. 5） ， 与对照组的 （11. 1 1. 8） 比较， 差异有统计学 意义； 在 CA1 区和齿状回表达的免疫反应灰度值与对照组比较， 差异无统计学意义。1. 0 mW/ cm2剂 量组在 CA1 和 CA3 区表达的免疫

3、反应灰度值分别为 （7. 9 1. 6） 和 （8. 4 1. 7） ， 与对照组的 （9. 7 1. 5） 和 （11. 1 1. 8） 比较， 差异有统计学意义； 在齿状回表达的免疫反应灰度值差异无统计学意义。 （2） NR2B 蛋白表达： 0. 5 mW/ cm2剂量组在 CA1 和 CA3 区表达的免疫反应灰度值分别为 （16. 4 1. 0） 和 （9. 6 1. 9） ， 与对照组的 （17. 8 1. 6） 和 （11. 2 2. 1） 比较， 差异有统计学意义； 在齿状回表达 的免疫反应灰度值差异无统计学意义。1. 0 mW/ cm2剂量组在 CA1、 CA3 和齿状回表达的免

4、疫反应 灰度值分别为 （13. 1 2. 4） 、（9. 3 1. 4） 和 （7. 3 0. 1） ， 与对照组的 （17. 8 1. 6） 、（11. 2 2. 1） 和 （8. 5 1. 0） 比较， 均差异有统计学意义。结论 在本实验条件下， 1800 MHz 电磁波暴露可影响大鼠 海马 NMDA 受体的表达。 【关键词】 辐射； 大鼠； 海马 Effects of NMDA receptor expression in rat s hippocampus after exposure to 1800MHz radiofrequency field HUANG Chun-tao，LIU

5、 Ping，WU Hui-xin，WANG Jing-lin，WU Xi-nan. Department of Environment，School of Public Health， Kunming Medical College，Yunnan 650032，China Corresponding author：WU Xi-nan 【Abstract】 Objective To identify the effects of NMDA receptor subunits NR2A and NR2B expression in rat s hippocampus after exposure

6、to 1800 MHz radiofrequency radiation. Methods Four- week old female Wistar rats were randomly divided into four groups，with 12 animals for each. The subjects in two experimental groups had been continuously exposed to 1800 MHz microwave radiation（CW）with respective power density of 0. 5 mW/ cm2and 1

7、. 0 mW/ cm212 hours each day for 21 days. Meanwhile， sham-controls were carried out.The brain tissue sections were performed by immunohistochemistry to demonstrate both expressions of NR2A， NR2B immune-activity in the hippocampal CA1， CA3 and DG by using computer-assisted image analysis system. Resu

8、lts In NR2A：the expression of 0. 5 mW/ cm2power density group was significantly lower than 0 mW/ cm2power density group in CA3 （8. 5 1. 5）vs（11. 1 1. 8） ，P 0. 01and had not been significantly changed in CA1 and DG. The expression of 1. 0 mW/ cm2 power density group was significantly lower than 0 mW/

9、 cm2power density group in CA1 and CA3 （7. 9 1. 6）vs（9. 7 1. 5） ； （8. 4 1. 7）vs（11. 1 1. 8） ，respective P 0. 05， P 0. 01and had not been significantly changed in DG. In NR2B： the expression of 0. 5 mW/ cm2power density group was significantly lower than 0 mW/ cm2power density group in CA1 and CA3 （1

10、6. 4 1. 0）vs（17. 8 1. 6） ； （9. 6 1. 9） vs（11. 2 2. 1） ，respective P 0. 05 .The expression of 1. 0 mW/ cm2power density group was significantly lower than 0 mW/ cm2power density group in CA1，CA3 and DG （13. 1 2. 4）vs（17. 8 12中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med，January 2006，Vol 40，No. 1 1.

11、6） ； （9. 3 1. 4）vs（11. 2 2. 1） ； （7. 3 0. 1）vs（8. 5 1. 0） ，respective P 0. 01，P 0. 05，P 0. 05 . Conclusion There were findings of the effects on NMDA receptor subunits in different hippocampus sections after exposure to 1800 MHz radiofrequency radiation. 【Key words】 Radiation； Rats； Hippocampus 近半个世

12、纪以来， 随着科学技术的迅速发展， 信 息传输、 无线电工具和各种家用电器已经成为人类 文明生活不可缺少的伴侣， 人们暴露于电磁辐射的 机会与日俱增， 而中枢神经系统是电磁辐射的高度 敏感靶部位， 其受辐射后的突出表现就是出现神经 行为学障碍 1。谷氨酸是中枢神经系统中重要的 兴奋性氨基酸， N-甲基-D-天冬氨酸 （N-methyl-D- aspirate， NMDA） 受体是谷氨酸受体的一种， 在生物 发育过程中有着重要的生理作用， 可调节神经元的 存活， 树突、 轴突结构发育和突触可塑性， 在神经回 路的形成及学习记忆过程中亦起着关键作用 2， 3。 但有关电磁波暴露， 尤其是低强度电磁

13、波对 NMDA 受体蛋白表达影响的报道甚少。因此， 我们采用免 疫组织化学和图像分析方法观察分析了不同强度电 磁波暴露对大鼠海马 NMDA 受体亚单位 NR2A、 NR2B 蛋白表达的影响， 期望为电磁波暴露对人群 的危害提供实验依据。 材料与方法 1. 实验动物与分组： 出生后 4 周龄清洁级雌性 Wistar 大鼠 48 只 （由取得合格证的中国科学院上海 动物饲养中心提供） 。随机分为 4 组： 0. 5 mW/ cm2 剂量组及其对照组、 1. 0 mW/ cm2剂量组及其对照 组， 每组 12 只。 2. 材料： SP 试剂盒、 驴血清、 羊抗 NR2A 和 NR2B 多克隆抗体、

14、生物素化兔抗羊抗体和链霉菌 抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液均为美国 Santacruz 公司产品， 3， 3-二氨基联苯胺 （DAB） 显色剂 （洛阳 华美生物工程公司） 。 3. 暴露系统及暴露参数测定： 暴露系统参照德 国国家环境与健康研究中心毒理所提供的标准欧洲 数字式 GSM 移动通信暴露装置制作 4， 采用 7620 型微波辐射测试仪 （美国 Narda 公司） 、 8592C 频谱 分析仪 （美国惠普公司） 定期测试暴露参数， 暴露期 间温度、 湿度、 背景噪声等环境条件稳定。实验室发 射电磁场背景值频宽范围为 （1800 500） MHz， 功能 密度为 30 70 W/ m2。当

15、暴露室微波发生器开或 关产生实验要求照射强度时， 假暴露室内上述频宽 范围功能密度仍然在 30 70 W/ m2之间波动。 4. 暴露强度及方式： 用 1800 MHz 射频波， 功率 密度分别为0. 5 mW/ cm2或1. 0 mW/ cm2， 同时各自 设置一对照组。对大鼠每天全身暴露 12 h， 连续 21 d。 5. 切片制备： 最后一次暴露后， 将大鼠腹腔注 射戊巴比妥钠 （60 mg/ kg） 麻醉， 开胸， 经左心室做 主动脉插管， 剪开右心耳， 用生理盐水约 250 ml 快 速冲去血液， 随即灌注含4%多聚甲醛0. 1 mol/ L 的 磷酸盐缓冲液 （pH =7. 4）

16、， 以 2 ml/ min 的速度灌流 30 min。注射完毕立即取出脑组织浸于相同的固定 液内， 4 下固定 24 h， 然后转入 30% 蔗糖溶液内 4 下过夜， 行冰冻连续冠状切片， 片厚 20 m。切 片顺序分为 3 套， 分别作 HE 染色、 NR2A 和 NR2B 免疫染色。 6. 免疫组织化学反应： 每个鼠脑取 3 套切片， 按 SP 试剂盒说明书的步骤， 切片经0. 01 mmol/ L 磷 酸盐缓冲液 （PBS） 漂洗 3 次， 每次 3 min； 放入 3% H2O2中室温孵育 30 min； 放入 10% 正常驴血清中 37 孵育 30 min， 不洗； 分别放入 1:

17、60 和 1: 400 的 羊抗 NR2A 和 NR2B 多克隆抗体中， 4 孵育 24 h； 放入生物素化兔抗羊抗体中， 37 孵育 30 min； 放 入链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液中， 37 孵育 30 min； 放入新鲜配制的100 l DAB 显色剂中 显色3 10 min， 显微镜下控制显色时间。以上各步 骤完成后， 均用 0. 01 mmol/ L PBS 冲洗 3 次， 每次 3 min。对照组除用 0. 01 mmol/ L PBS 代替一抗外， 其 余步骤相同。将所有切片裱于涂有明胶的载玻片 上， 晾干、 脱水、 透明、 封片。 7. 图像处理：免疫组织化学反应切片采

18、用 HPIAS-1000 高清晰彩色病理图文报告分析系统进 行图像分析。各剂量组随机抽取 3 只大鼠， 从每只 大鼠的每套免疫组织化学反应切片中各取 3 张切 片， 分别测量海马 CA1 区、 CA3 区锥体细胞层和齿 状回 （各区取 3 个测量点， 各点的像素量基本一致） 颗粒细胞层的灰度值， 并用测量值减去相应背底灰 度值后的平均值作为海马结构各区的最终灰度值。 8. 统计学方法： 采用 SPSS 11. 5 统计软件中的 两独立样本 t 检验和方差分析进行统计学处理。经 t 检验， 2 个对照组免疫反应灰度值的差异无统计学 22中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期

19、 Chin J Prev Med，January 2006，Vol 40，No. 1 意义， 遂合并为 1 个对照组。 表 1 大鼠海马各区 NR2A、 NR2B 表达的免疫反应灰度值比较 （-x s） 剂量组 （mW/ cm2）鼠数 （只） NR2A CA1CA3齿状回 NR2B CA1CA3齿状回 0. 538. 7 1. 68. 5 1. 5#8. 9 1. 116. 4 1. 0*9. 6 1. 9*7. 9 1. 4 1. 037. 9 1. 6*8. 4 1. 7#7. 6 0. 913. 1 2. 4#9. 3 1. 4*7. 3 0. 1* 对照组69. 7 1. 511. 1

20、 1. 88. 0 1. 317. 8 1. 611. 2 2. 18. 5 1. 0 灰度值为各测量点灰度值减去相应背底灰度值后的平均值； 与对照组比较， *P 0. 05， #P 0. 01 结果 1. 图像分析结果： 对照组大鼠海马的 CA1 和 CA3 区锥体细胞层和齿状回区颗粒细胞层均有 NR2A 表达， 以 CA3 区最强， CA1 区次之， 齿状回最 弱； 细胞周边可见深染棕色颗粒状物质， 胞质淡染， 且对照组的 CA1 区辐射层和腔隙分子层内可见大 量密集排列的锥体细胞顶树突， 着色较深。0. 5 和 1. 0 mW/ cm2剂量组与对照组比较， 细胞排列疏松、 紊乱， 阳性细

21、胞部位颜色减弱， 表达强度降低。 NR2B 在假暴露组大鼠海马的 CA1、 CA3 区锥体细 胞层和齿状回区颗粒细胞层都有大量的表达， 细胞 排列整齐、 密集， 其中以 CA1 区最强， CA3 区次之， 齿状回区最弱。各区其他层仅有很少量散在的阳性 细胞， 0. 5 mW/ cm2及1. 0 mW/ cm2电磁波暴露组与 假暴露组比较， 细胞排列疏松、 紊乱， 部分神经细胞 胞体浓缩， 顶树突消失； 对照组大鼠海马切片均无特 异性着色。 2. 免疫组织化学分析结果： 大鼠海马各区 NR2A、 NR2B 表达的免疫反应灰度值比较结果见 表 1。 讨论 电磁波作为一种全新的环境因素， 其生物效应

22、 越来越受到重视， 流行病学调查和动物实验结果均 表明， 长期低强度电磁辐射具有明显的中枢神经损 伤效应 5。 海马作为边缘系统的重要组成部分， 一方面是 学习记忆的关键部位， 参与学习和记忆、 认知、 突触 可塑性和神经发育等重要的生理功能 6。谷氨酸 是中枢神经系统中重要的兴奋性氨基酸， NMDA 受 体是谷氨酸受体的一种， 在生物发育过程中有着重 要的生理作用， 可调节神经元的存活， 树突、 轴突结 构发育和突触可塑性， 在神经回路的形成及学习记 忆过程中亦起着关键作用 2， 3。NMDA 受体是由两 个 NR1 和一种或两种 NR2 亚单位分子组成的四聚 体或五 聚 体 7。不 同 的

23、 NR2 亚 基 参 与 组 成 的 NMDA 受体具有不同的组织分布特异性和电生理特 征， 因而在学习记忆功能中的作用也不同。NR2 由 NR2A、 NR2B、 NR2C 和 NR2D 亚基组成， 其中 NR2A 和 NR2B 是分布于海马的主要调节亚单位， 它们以 多种方式构成完整的 NMDA 受体复合体， 对其活性 进行调节。 NMDA 受体活性的改变与其蛋白表达直接相 关， 因而 NMDA 受体蛋白表达的变化， 导致 NMDA 受体活性改变是引起学习与记忆改变的原因之一。 阿尔茨海默病等变性疾病引起智能损害的脑标本 中， 海马内 NMDA 受体亚基 NR2B mRNA 表达水平 明显降

24、低 8。衰老引起的认知障碍机制研究结果 也表明， 海马内 NMDA 受体 NR2B 亚基表达减 少 9。本次实验采用免疫组织化学方法， 结果表 明， 与对照组比较，0. 5 mW/ cm2电磁波暴露时， NR2A 在 CA3 区的蛋白表达就有明显下调； 1. 0 mW/ cm2电磁波暴露时， CA1 和 CA3 区的蛋白表达 均有明显下调。0. 5 mW/ cm2电磁波暴露时， NR2B 在 CA1 和 CA3 区的蛋白表达明显下调； 1. 0 mW/ cm2电磁波暴露时， CA1、 CA3 和齿状回区的蛋白表 达均明显下调。表明该强度的电磁波可影响大鼠海 马 NMDA 受体亚单位 NR2A

25、和 NR2B 的表达， 提示 该强度电磁波可损害大鼠的学习记忆功能， 这与文 献报道的结果一致 4。 此外， 我们还观察到， 不同强度电磁波暴露对 NR2A 和 NR2B 在大鼠海马各区的表达存在明显的 差别， CA3 区较 CA1 区 NR2A 的表达易受损， 而 CA1 区较 CA3 区 NR2B 的表达更易受损， 亚单位的 这种表达模式可能与不同亚单位对电磁波暴露损伤 的敏感性不同及海马学习功能的区域特异性有关。 含有 NR2B 的 NMDA 受体在长时程增强诱导过程 中扮演抑制角色， 而 NR2A 通过增强离子通道开放 调节突触的 NMDA 受体的活化功能， 在长时程抑制 形成中起重要

26、作用 10。海马 CA3 区 NMDA 受体为 32中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med，January 2006，Vol 40，No. 1 联想式记忆所必需 11， 而海马 CA1 区 NMDA 受体 依赖的突触强化是新近记忆转为长期记忆过程中的 关键步骤 12。基因敲除实验结果证实， NR2A 基因 敲除可降低海马 CA3 区的兴奋性突触后电流 （EPSC） 13， 明显降低 NMDA 受体电流和长时程增 强， 损害空间学习能力。NR2A 基因缺失小鼠的眼 睑条件反射损害， 运动学习能力降低。NR2A 的定 点突变 （F637A） ，

27、 使由其组成的 NMDA 受体无功 能 14。NR2B 基因敲除后小鼠记忆能力下降， 而移 植转染 NR2B 基因细胞可使大鼠记忆明显增高， 学 习过程也可以提高 NR2B 通道蛋白的磷酸化程度， 因此， NR2B 又被命名为 “聪明基因” ， 并产生了该基 因就是记忆基因的新论点。短暂性前脑缺血实验结 果也证实， 大鼠海马 CA1 区对缺血性损伤敏感， 而 CA3 区和齿状回对缺血性损伤则呈现相对耐受性。 因此， NMDA 受体不同亚单位在海马各区蛋白表达 的不同可能意味着其功能特性的改变。本实验中不 同强度电磁波暴露对大鼠海马各区 NMDA 受体亚 单位 NR2A 和 NR2B 的表达存在

28、明显差别， 表明不 同强度的电磁波暴露对大鼠海马各区学习记忆的损 害存在选择性， 这种选择性可能与不同的 NMDA 受 体亚单位特性不同有关。 然而， 电磁波损伤大鼠学习与记忆的影响因素 是复杂的， 本次实验仅从 NR2A、 NR2B 亚基蛋白表 达变化角度来探讨其机制， 有关这方面的研究我们 将继续进行。 志谢 昆明医学院环境卫生学教研室刘毅老师、 神经研究所王 廷华所长和胡艳丽老师在实验中给予帮助 参考文献 1Koivisto M，Revonsuo A，Krause C，et al.Effects of 902 MHz electromagnetic field emitted by ce

29、llular telephones on response times in humans. Neuroreport， 2000， 11： 413-415. 2Villarreal DM，Do V，Haddad E，et al. NMDA receptor antagonists sustain LTP and spatial memory：active processes mediate LTP decay. Nat Neurosci， 2002， 5： 48-52. 3Lee I，Kesner RP. Differential contribution of NMDA receptors

30、in hippocampal subregions to spatial working memory. Nat Neurosci， 2002， 5： 162-168. 4吴锡南， 程天民， 刘苹， 等 . 出生前暴露 1800 MHz 电磁场大鼠 Morris 迷宫测试 . 环境与健康杂志， 2003， 20： 10-12. 5Kramarenko AV，Tan U. Effects of high-frequency electromagnetic fields on human EEG： a brain mapping study. Int J Neurosci， 2003， 113：

31、1007-1019. 6Hrabetova S，Serrano P，Blace N，et al. Distinct NMDA receptor subpopulations contribute to long-tem potentiation and long-term depression induction. J Neurosci， 2000， 20： RC81. 7Liu Y， Zhang J. Recent development in NMDA receptors. Chin Med J（Engl） ， 2000， 113： 948-956. 8Bi H，Sze CI.N-meth

32、yl-D-aspartate receptor subunit NR2A and NR2B messenger RNA levels are altered in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer s disease. J Neurol Sci， 2002， 200： 11-18. 9Clayton DA，Mesches MH，Alvarez E，et al. A hippocampal NR2B deficit can mimic age-related changes in long-term potentiation a

33、nd spatial learning in Fischer 344rat.J Neurosci， 2002， 22： 3628-3637. 10Rossi P，Sola E，Taglietti V，et al. NMDA receptor 2（NR2）C- terminalcontrolofNRopenprobabilityregulatessynaptic transmission and plasticity at a cerebellar synapse.J Neurosci， 2002， 22： 9687-9697. 11Nakazawa K，Quirk MC，Chitwood RA

34、，et al.Requirement for hippocampal CA3 NMDA receptors in associative memory recall. Science， 2002， 297： 211-218. 12Shimizu E，Tang YP，Rampon C，et al. NMDA receptor-dependent synaptic reinforcement as a crucial process for memory consolidation. Science， 2000， 290： 1170-1174. 13Ito I，Kawakami R，Sakimur

35、a K，et al. Input-specific targeting of NMDA receptor subtypes at mouse hippocampal CA3 pyramidal neuron synapses. Neuropharmacology， 2000， 39： 943-951. 14Ronald KM，Mirshahi T，Woodward JJ.Ethanol inhibition of N- methyl-D-asparate receptors is reduced by site-directed mutagenesis of a transmembrane domain phenylalanine residue.J Biol Chem， 2001， 276： 44729-44735. （收稿日期： 2005-07-04） （本文编辑： 周星） 更正 本刊 2005 年第 39 卷第 5 期 中国 18 岁及以上人群血 脂水平及分布特征 一文中第 304 页左栏第 6 行 “总胆固 醇” 应改为 “甘油三酯” ， 特此更正。 感谢山东曲阜师范大学校医院防疫科蔡敏医生对本刊 的关注。 本刊编辑部 42中华预防医学杂志 2006 年 1 月第 40 卷第 1 期 Chin J Prev Med，January 2006，Vol 40，No. 1