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1、1 8 2 8 实用预防医学2 0 0 8 年1 2 月第1 5 卷第6 期P r a c t i c a lP r e v e n t i v eM e d i d n e D e c2 0 0 8 ，V o l1 5 ，N o 6 文章编号：1 0 0 6 3 1 1 0 ( 2 0 0 8 ) 0 6 1 8 2 8 0 3 2 0 0 7 年湖南省犬只感染狂犬病病毒情况调查 刘运芝。黄一伟，张红，戴德芳，高立冬，黄凰，刘富强，李俊华 摘要：目的了解湖南省犬狂犬病病毒感染状况，为防制狂犬病提供科学依据。方法在湖南省1 4 个市( 州) 的1 5 个县( 区) 采集集市所售家犬脑组织，采用
2、直接免疫荧光法标本狂犬病毒抗原，阳性者再用巢式R T P C R 方法检测 标本狂犬病毒核酸。结果共检测8 4 5 份犬脑组织标本，犬只狂犬病病毒感染率为2 6 0 ，其中茶陵县、湘乡市、邵阳 县分别为1 2 9 0 、6 3 8 和1 9 3 5 ，其他1 2 个县未检出狂犬病病毒。雄性、雌性犬只感染率分别是2 9 4 和1 3 7 。 放养、圈养犬只感染率分别是2 6 5 和0 0 0 ；不同性别、不同养殖方式的犬只病毒感染率差异无统计学意义( P 均 0 0 5 ) 。与2 0 0 5 、2 0 0 6 年相比，2 0 0 7 年湘潭、邵阳两市的犬只狂犬病病毒感染率上升显著。结论湖南省家
3、犬狂犬病 病毒感染率较高，需加强犬只管理和免疫，有效预防和控制狂犬病的发生。 关键词：犬；感染；狂犬病；狂犬病病毒 中图分类号：R 3 7 3 9文献标识码：A A n a l y s i so fD o gI n f e c t i o nR a t ew i t hR a b i e sV i r u si nH u n a nP r o v i n c ei n2 0 0 7 L I UY u n z h i ，H U A N GY i w e i ，Z H A j 、G H o n g ，e ta 1 ( H u n a nP r o v i n c i a lC e n t e rf
4、 o rD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n ，C h a n g s h a4 1 0 0 0 5 ，H u n a n ) A b s t r a c t ： O b j e t t i v e T ou n d e r s t a n dt h es i t u a t i o no fd o gr a b i e si nH u n a nP r o v i n c e ，a n dt op r o v i d es c i e n t i f i ce v i d e n c e f o rr a b i e sc o
5、n t r o la n dp r e v e n t i o n M e t h o d s D o g sb r a i ns p e c i m e n sw e r ec o l l e c t e di nt h em a r k e t sO f1 5c o u n t i e s ( d i s - t r i c t s ) o f1 4c i t i e s ( p r e f e c t u r e s ) j nH u n a nP r o v i n c e a n dd e t e c t e db yd i r e c tj m m u n o f l u o r
6、e s c e n c ea s s a y ( D F A ) a n dR T P C R m e t h o d s R e s u l t s At o t a Io f8 4 5s p e c i m e n sw e r et e s t e da n dt h ei n f e c t i o nr a t eo fd o gr a b i e sw a s2 6 0 T h er a t e so f C h a l i n g ，X i a n g x i a n ga n dS h a o y a n gw e r e1 2 9 0 ，6 3 8 a n d1 9 3 5
7、r e s p e c t i v e l y A n dr a b i e sv i r u sw a sn o td e t e c t a b l ei n o t h e r1 2c o u n t i e s T h ei n f e c t i o nr a t e so fm a l ea n df e m a l ed o g sw e r e2 9 4 a n d1 3 7 T h ei n f e c t i o nr a t e so fw i l da n dc a p t i v ec l o g sw e r e2 6 5 a n d0 0 0 B u tt h e
8、 r ew a sn Os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei ni n f e c t i o nr a t e so fd i f f e r e n tg e n d e ra n dd i f f e r e n t f a r m i n gm e t h o d s ( B o t hP 0 0 5 ) A sc o m p a r e dw i t h2 0 0 5a n d2 0 0 6 ，t h ei n f e c t i o nr a t e so fX i a n g t a na n dS h a o y a n gh a
9、di n - c r e a s e di n2 0 0 7 C o n c l u s i o n sT h ei n f e c t i o nr a t eo fd o gr a b i e si sh i g hi nH u n a nP r o v i n c e S t r e n g t h e n i n gt h ed o gq u a r a n t i n e a n dm a n a g e m e n ti sn e c e s s a r yf o rt h ep r e v e n t i o no fr a b i e s K e yw o r d s ：D o
10、 g s ；I n f e c t i o n ；R a b i e s ；R a b i e sv i r u s 作者单位：湖南省疾病预防控制中心微生物分子生物学湖南省莺点实验室( 湖南长沙4 1 0 0 0 5 ) 作者简介：刘运芝( 1 9 7 4 一) ，女，湖南泸溪人，本科学历，副主任技师主要从事微生物检验工作。通讯作者：李俊华。 统、呼吸系统、恶性肿瘤、损伤和中毒已成为严重威胁湘西自治 州居民健康主要因素，说明今后在继续控制传染病的同时，应 加大对上述四类因素的防治力度。为进一步提高当地居民的 健康水准和预期寿命，作者建议应该大力加强以下三项工作： 1 ) 积极开展健康教育和行为
11、干预，改善饮食结构，完善社区医 疗服务加强对慢性病的防治，减少慢性病的发病率；2 ) 政府及 相关部门应加强交通安全和安全生产防范意识，制定相关措 施，加强基础交通设施建设和安全教育；3 ) 重视对环境保护，加 大对工业。三废”以及汽车尾气的整治和治理力度，提倡使用环 保能源。 参考文献】 1 郭志忠，覃平，熊伯华，等常德市2 0 0 4 2 0 0 5 年居民死亡原因分析 J 实用预防医学，2 0 0 7 1 4 ( 3 ) ：7 5 2 7 5 3 2 李晓铷，辛宇睛2 0 0 5 年合肥市城区居民主要死因分析 J 疾病控 制杂志。2 0 0 6 1 0 ( 6 ) ：6 2 8 6 2
12、9 3 陈红娟，温怀加，瘳晓伟，等瑞安市2 0 0 4 年居民死因分析 J 上海 预防医学杂志2 0 0 6 1 8 ( 5 ) ：2 3 9 2 4 0 4 陈妙芬，钏诚，梁子良，等佛山市南海区2 0 0 4 年居民死亡原因分析 J 现代预防医学杂志2 0 0 6 ，3 3 ( 1 2 ) ：2 3 5 3 2 3 5 4 5 周峰，宋桂香林松柏等上海市居民预期寿命的分析 J 中国卫 生统计，2 0 0 1 1 8 ( 2 ) ：8 6 6 汤军克李惠英，田秀红等上海市闵行区居民死亡年龄分析 J 上海预防医学杂志，2 0 0 3 1 5 ( 2 ) ：9 0 一9 1 ( 收稿日期：2 0
13、0 8 1 0 2 8 ) 万方数据 实用预防医学2 0 0 8 年1 2 月第1 5 卷第6 期P r a c t i c a lP r e v e n t i v eM e d i c i n e ，D e c 2 0 0 8 ，V o l1 5 ，N o 6 1 8 2 9 狂犬病是由弹状病毒科的狂犬病病毒引起的一种世界性 人畜共患传染病，病死率几乎1 0 0 。近年来我国狂犬病持续 高发，自2 0 0 3 年起全国年报告病例数均在20 0 0 例以上。湖 南省是狂犬病老疫区和高发区，白2 0 0 2 年以来狂犬病发病人 数高居全国第1 4 位旧l 。为了解湖南省狂犬病流行因素、掌 握狂
14、犬病的疫情特点与流行趋势，更有效地预防控制狂犬病疫 情提供科学依据，我们自2 0 0 5 年1 0 月开始对湖南省自然状况 下犬只感染狂犬病病毒情况开展调查，2 0 0 7 年首次在全省1 4 个市州1 5 个项目县( 其中湘西自治州2 个) 开展监测工作。现 将2 0 0 7 年结果分析如下。 1 材料与方法 1 1 标本来源 湖南省1 4 个市( 州) 的1 5 个县( 区) 采集的 8 4 5 份犬脑组织。 1 2标本采集方法 在项目县的犬肉食用餐馆或集市收集 犬脑组织：用塑料吸管从犬头部枕骨大孔或能看见脑组织的地 方向眼眶处斜插，使塑料管通过犬脑的大、中、小脑部位，然后 反折并压紧塑料
15、管尾部，阻断塑料管尾部与外界大气压，拔出 塑料管。将吸管中的脑组织标本放入1 5m l 无菌离心管中并进 行编号，一2 0 冻存待检。 1 3 直接免疫荧光法( d i r e c ti m m u n o f l u o r e s e e n e ea s s a y ，D F A ) 检测狂犬病病毒抗原每一份脑组织标本分别取大脑、中脑 和小脑3 个部分的横断面直接印片室温干燥后冷丙酮( 4 ) 固定1 0m i n ，用荧光素标记的狂犬病病毒核衣壳蛋白单克隆抗 体( R a b i e sI F AR e a g e n t 美国C h e m i c o n 公司) 染色，3 7 湿盒
16、孵 育3 0m i n ，磷酸盐缓冲液( P B S ) 振洗2 遍，蒸馏水振洗1 遍，吹 干，9 0 甘油( 用P B S 稀释) 封片，荧光显微镜观察结果。在荧 光显微镜下可观察到翠绿色的点状荧光，检测结果即可判为阳 性。否则为阴性。 1 4巢式R T P C R 法检测狂犬病病毒核酸将D F A 法初 检为阳性和疑似阳性的标本继续进行狂犬病病毒特异性核蛋 白基因片段的检测。 1 4 1 R N A 的提取每份标本分别取不同部位的脑组织共 约1 0 0m g ，加1m l T R I z o l ( 美国I n v i t r o g e n 公司) 研磨均匀，室温 放置5m i n ；加
17、0 2m l 氯仿，迅速颠倒离心管3 0s ，室温放置5 m i n ；4 1 20 0 0g 离心1 5m i n ；转移上层水相于一新管中，加入 0 6m l 异丙醇，轻柔混匀室温放置1 0m i n ；4 1 20 0 0g 离心 1 0r a i n ；加3 5 弘I D E P C 处理水溶解沉淀，即为试验所需的R N A 。 1 4 2 逆转录将3 5 “lR N A6 5 水浴1 0m i n 后，立即冰浴 2r a i n ；转移3 2mR N A 液至逆转录反应管( R e a d y T o G oY o u P r i m eF i r s t S t r a n dB
18、e a d s ，美国A m e r s h a m 公司) 中，加入1p l 随机引物P d ( N ) 6 ( 日本T a K a R a 公司) ，使总体积达到3 3p l ；室 温放置1m i n 充分混匀，瞬时离心；3 7 水浴中反应1h 。得到 c D N A ，作为巢式R T P C R 检测的模板。 1 4 3 巢式R T P C R 除模板和引物外，其他所有P C R 试剂 ( G oT a qG r e e nM i x ) 均购白美国P r o m e g a 公司；所用引物序列： N 1 2 7 ：5 一A T G T A A C A C C T ( ? r A C A
19、 A T G G 一37 ，N 8 m ：5 一 C A G T ( 1 Y T C N G c C A T ( ? r 一3 N 5 7 7 ：5 。一A A G A T G T G Y G C Y A A Y T G G A G 一3 ，N 8 2 9 ：5 一G C C C T G G T T C G A A C A T T C 一3 ，。采用上游引物N 1 2 7 和下游引物N 8 m ，进行第一次P C R 扩增循环，循环条件为：9 4 3r a i n ；9 4 3 0s ，5 6 3 0s ，7 2 1 0 0s 。共3 5 个循环；7 2 1 0r a i n 。第一次P C
20、R 反应产物作 为第二次P C R 反应的模板，上游引物为N 5 7 7 、下游引物为 N 8 2 9 ，反应条件为：9 4 3m i n ；9 4 3 0s ，5 6 3 0s ，7 2 4 0 s ，共3 5 个循环；7 2 1 0m i n 。第二次P C R 产物在1 5 凝胶 上电泳，观察结果。出现与阳性对照位置相同且长度为2 5 5b p 大小的条带即可判为阳性，否则为阴性。 2 结果 2 1标本采集情况2 0 0 7 年，根据湖南省2 0 0 7 年狂犬病监 测实施方案 的要求，全省1 4 个市州均设立了1 个项目县( 湘西 自治州2 个县) 。全年1 5 个项目县共采集8 4
21、5 份( 例) 标本，各 县采集标本数量具体见表1 。 表12 0 0 7 年各监测县标本的检测结果 2 2 标本检测结果对8 4 5 份标本全部进行D F A 检测，共筛 查出狂犬病病毒阳性及疑似阳性标本3 9 份；初筛的3 9 份标本 继续进行巢式R T P C R 法检测。两种方法均阳性的为确诊阳 性，共2 2 份，标本检测阳性率为2 6 0 ，其中茶陵县、湘乡市、 万方数据 1 a 3 0实用预防医学2 0 0 8 年1 2 月第1 5 卷第6 期P r a c t i c a lP r e y e n t i v eM e d i c i n e ，D e c 2 0 0 8 V o
22、 l1 5 ，N o 6 邵阳县阳性率分别为1 2 9 0 、6 3 8 和1 9 3 5 ，其他1 2 个县 未检出阳性标本。各县标本检测D F A 初筛阳性数、R T P C R 复核阳性致以及阳性率见表l 。 2 3 不同性别犬只狂犬病病毒感染情况8 4 5 份犬脑组织 中，雄性犬标本5 1 0 份，阳性1 5 份，狂犬病病毒感染率为 2 9 4 ；雌性犬标本2 9 1 份，阳性4 份，狂犬病病毒感染率为 1 3 7 ，两者差异无统计学意义( P 0 0 5 ) ，见表2 。 2 4 不同饲养方式犬只狂犬病病毒感染情况榆测放养犬 7 1 7 只。阳性1 9 只，狂犬病病毒感染率为2 6
23、5 ；检测圈养犬 6 1 只，阳性0 只，狂犬病病毒感染率为O 0 0 ，但两者差异无 统计学意义( P 0 0 5 ) ，见表3 。 2 5 2 0 0 7 年犬只感染狂犬病病毒与2 0 0 5 年、2 0 0 6 年比较 与2 0 0 5 、2 0 0 6 年相比，2 0 0 7 年湘潭、邵阳两市的犬只狂犬病病 毒感染率猛然卜升，特别是邵阳市感染率足2 0 0 6 年的5 倍多。 而常德、永州、湘西均未检出病毒。见表4 。 表2湖南省2 ( 1 0 5 年不同性别犬狂犬病病毒的感染情况 表3湖南省2 0 0 5 年不同饲养方式犬狂犬病病毒的感染情况 表42 0 0 5 2 0 0 7 年犬
24、只狂犬病病毒感染率比较( ) 3 讨论 湖南省是我同狂犬病高发省份之一，1 9 9 9 2 0 0 4 年发病例 数一直呈较快卜升趋势2 0 0 5 年开始有所F 降3 。有资料证 明，超过8 5 的狂犬病通过犬感染3 4 。因此，对于犬只感染狂 犬病病毒情况调查对于狂犬病的防治有着十分莺要的意义。 本研究发现2 0 0 7 年湖南省监测地区的犬只狂犬病病毒感染率 为2 6 0 ，各个地区高低不等，只犬只感染率与入狂犬病发病 率两者早线性相关；冉者，从小同例养方式犬只感染狂犬病病 毒情况来看，虽然放养犬与圈养犬的带毒率之间差异无统计学 意义，但从监测的绝对数可以看出，放养犬比崩养犬更易感染 狂
25、犬病毒。因此，加强对犬只的管理和免疫是预防与控制狂犬 病的首要T 作。 D F A 是世界卫牛组织推荐检测狂犬病病毒抗原的金标准 方法，但足结果判断对于检测人员的水平要求较高，需要一定 的荧光显微镜观察经验；巢式R T P C R 具有很高的灵敏度，但 是极易污染，造成假阳性，并且由于引物的设计的不足，有u T 能 导致漏检。本研究采取监测方案要求的先使用D F A 初筛再用 巢式R T P C R 复核的方法，能有效节省人力财力。但是，在人 力物力条件允许的基础上，如果能采用2 种方法同时进行，可 以更好的提高检测的敏感性和准确度。 李浩等5 研究发现我冈狂犬病高发省I ) ( 存在犬的普遍
26、感 染的情况。本次蒯奁1 5 个县I | 有1 2 个县未检出狂犬病病毒， 特别足常德、永州、湘两均未检出病毒，这可能是由于标本数量 减少导致。2 0 0 5 和2 0 0 6 年的每个监测点的样本数在1 0 0 1 7 0 例之间，2 0 0 7 年由于监测点的增多，导致每个监测点采集的标 本数量减少，比如常德市2 0 0 5 、2 0 0 6 年每年均采集了1 0 2 份标 本，而2 0 0 7 年只有4 5 份。另外，也可能与采集地点的位置和数 目选取等闲索自关。由于本研究采集的样本数较少。因此还不 能完全说明犬只携带狂犬病病毒的真实情况。下一步需要开 展范围更大、采样数量更多、以犬为主
27、的宿主动物带毒状况调 查，以便更令面的J ，解宿主动物狂犬病病毒的带毒状况，掌握 狂犬病的流行趋势，预防和控制狂犬病发生，保障人民群众的 健康。 【参考文献 1 唐青李浩中国狂犬病流行近况及相关冈素分析 J 中华流行病 学杂志，2 0 0 5 2 6 ( 3 ) ：2 2 3 2 2 4 2 唐青。赵秀芹，陶晓燕中国人问狂犬病流行近况分析 J 中华流 行病杂志。2 0 0 1 2 2 ( 1 ) ：8 1 0 3 许真，唐青。宋淼等2 0 0 5 年中国人问狂犬病流行特征及分析 J 疾病监测2 0 0 6 ，2 1 ( 7 ) ：3 6 0 3 6 3 4 刘富强郭绶衡胡世雄，等湖南省1 9 9 9 2 0 0 3 年人间狂犬病流行 情况分析 J 中华流行病学杂志2 0 0 4 2 5 ( 1 2 ) ：1 0 8 8 5 李浩陶晓燕，宋淼，等狂犬病商发地区犬只感染情况调查分析 J 中华实验和临床病毒学杂志。2 0 0 8 ，2 2 ( 3 ) ：1 6 1 1 6 4 ， ( 收稿日期：2 0 0 8 1 1 2 5 ) 万方数据