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1、基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （30370673） 作者单位： 430060 武汉大学人民医院内分泌科 （文重远、 陈小琳） ， 检验科 （李燕） ， 心内科 （王腾、 李庚山） ； 武汉 大学基础医学院病理生理教研室 （吴勇、 欧阳静萍） 论著 2 型糖尿病大鼠心肌葡萄糖转运体 4 的变化 及其对葡萄糖和脂肪酸代谢的影响 文重远 吴勇 李燕 陈小琳 王腾 欧阳静萍 李庚山 【摘要】 目的 探讨 2 型糖尿病大鼠心肌葡萄糖转运体 4 （GLUT4） 的表达与葡萄糖及其脂肪酸 氧化代谢的关系， 同时观察罗格列酮使用后上述指标的变化。方法 24 只 SD 雄性大鼠随机分为实 验治疗组 （6
2、 只） 、 实验对照组 （6 只） 、 正常治疗组 （6 只） 和正常对照组 （6 只） 。采用高脂喂养 （40% 脂肪、 42%碳水化合物和18%蛋白质） 4 周及小剂量链脲佐菌素 （35 mg/ kg） 一次性腹腔注射建立2 型 糖尿病大鼠模型。实验治疗组和正常治疗组给予罗格列酮3 mgkg -1d-1灌胃2 周； 各组大鼠进行 30 min 等容离体心脏 Langendorff 灌注， 灌注液含100 U 胰岛素、 5 mmol/ L 葡萄糖、 0. 4 mmol/ L 3H 软 脂酸， 测定样本葡萄糖含量及3H2O 计数， 评估心肌葡萄糖和脂肪酸氧化率； Western 印迹法检测心肌
3、 细胞膜 GLUT4 表达水平。结果 与正常对照组比较， 实验对照组大鼠心肌葡萄糖总氧化量明显较少 （55 6）mol/ g 干重 vs（69 6） mol/ g 干重， P 12 mmol/ L 为 2 型糖尿病模型成功。糖 尿病大鼠随机分为 2 组：实验治疗组 （HFD/ STZ/ RSG， 6 只） ， 在成模后继续给予高脂饮食喂养， 同时 按3 mgkg -1d-1给予罗格列酮 （美国 Smith Kline Beecham 公司， 溶于蒸馏水， 2. 5 ml/ kg 体重） 灌胃 2 周； 实验对照组 （HFD/ STZ， 6 只） 除高脂喂养外， 给予生理盐水灌胃。正常大鼠为普通
4、饮食喂养 （12%脂肪、 60% 碳水化合物和 28% 蛋白质） ， 也分 为 2 组： 正常治疗组 （control/ RSG， 6 只） 给予上述同 剂量的罗格列酮治疗， 正常对照组 （control， 6 只） 生 理盐水灌胃。 2. 离体心脏灌注： 开胸迅速取出心脏， 置于4 的 Krebs-Henseleit 液（ K-H 液 ）中 含 NaCl 118 mmol/ L、 KCl 4. 7 mmol/ L、 KH2PO41. 2 mmol/ L、 MgSO47H2O 0.6 mmol/ L、 CaCl22H2O 2.5 mmol/ L、 NaHCO325 mmol/ L、 葡萄糖 5
5、 mmol/ L、 乙二胺四乙 酸 （EDTA） 0. 5 mmol/ L ， 排尽心腔内血液， 立即主 动脉插管， 悬挂于 Langendorff 灌注装置上， 整个灌 注系统及心脏周围用恒温水浴循环器维持在 37 1， 灌注压为 90 cm H2O （1 cm H2O =0. 098 kPa） 。给予 K-H 液10 min 的基础灌注后， 通过一蠕 动泵进行 30 ml 等容循环灌注， 时间 30 min， 灌注流 速为15 ml/ min。灌注液含100 U 胰岛素、 3%小牛 血清蛋白、 5 mmol/ L 葡萄糖、 0. 4 mmol/ L 软脂 酸3H软脂酸 （标记软脂酸的配置方
6、法为每 100 毫 升灌 注 液 加 9， 103H 软 脂 酸 5 Ci， 购 自 英 国 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited 公司， 比活 度 53. 0 Ci/ mmol） 。灌注液以 95% O2和 5% CO2充 分饱和， 用 NaOH 调制成 pH 7. 4。每灌注10 min 取 样 0. 1 ml 测定葡萄糖浓度。灌注结束后取 0. 5 ml 灌注样品依次加入 1. 88 ml 氯仿: 甲醛 （1: 2， V: V） ， 0. 625 ml 氯仿， 0. 625 ml 的 2 mol/ L KCl: 0. 4 mol/ L HCl， 35
7、00 r/ min 离心 10 min， 上层水相进行3H2O 计 数 （液闪计数仪： 美国 2000A， Tri-CarbPackard） ， 按 下列公式分别计算葡萄糖和脂肪酸氧化率 4， 5。实 验完毕， 取部分心尖组织 -20保存备用， 1 周内完 成指标检测。心脏称重后置 100烘箱隔夜烘干后 计算干湿比例。 3. 脂肪酸氧化率计算： 脂肪酸摄取量 = 心脏 灌流 量 （ ml/ min） 灌 注 前 后3H2O 差 值 （ dpm/ ml） / 灌注前放射活性 （dpm/ mol） ； 脂肪酸氧化率 （molmin -1g 干重-1）= 脂肪酸摄取量/ （灌注 时间 心肌干重） 。
8、 4. 葡萄糖氧化率计算： 葡萄糖摄取量 = 灌注前 后葡萄糖浓度差值 （mol/ L） 灌注容积 （L） ； 葡萄 糖氧化率 （molmin -1g 干重-1）= 葡萄糖摄取 量/ （灌注时间 心肌干重） 。 5. 心 肌 细 胞 膜 制 备： 冰 冻 心 肌 组 织 置 含 1641中华医学杂志 2005 年 6 月 8 日第 85 卷第 21 期 Natl Med J China，June 8， 2005，Vol 85，No. 21 20 mmol Tris-HCl 溶液中匀浆， 匀浆物 1000 g 离心 10 min 后取上清 40 000 g 离心 1 h， 沉淀物用含 1% Tr
9、itonX-100 的缓冲液超声降解后再次40 000 g 离心 1 h， 提取膜蛋白， 用 BCA 法测定蛋白质浓度。 6. Western 印迹法检测 GLUT4 水平： 取膜蛋白 标本 50 g 进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳 （SDS-PAGE） ， 在 105 V 恒压下转移至硝酸纤 维素膜上， 用 ECL 试剂盒 （美国 KPL 公司） 提供的 封闭液进行封闭， 加入抗 GLUT4 抗体 （美国 R ! D Systems 公司） ， 孵育、 洗涤后加入辣根过氧化物酶标 记的二抗 （ECL 试剂盒提供） ， 孵育洗涤， 加入等量 底物 A、 B， 凉干， X 光胶片上曝光
10、， 随后显影、 定影， 用激光光密度扫描仪 （Scion image 公司定量分析软 件） 测定蛋白条带的光密度， 进行定量分析。 7. 其他指标检测： 空腹血糖测定采用葡萄糖氧 化酶法， 血浆胰岛素放免测定试剂盒购于中国原子 能研究所， 游离脂肪酸由全自动生化分析仪 （奥林 巴斯 AU1000） 上机完成。 8. 统计学处理： 采用 SPSS 10. 0 软件所有数据 以 -x s 表示， 组间差异比较用 t 检验。 结果 1. 2 型糖尿病大鼠与正常大鼠基础状况比较： 与正常对照组比较， 成模 2 周后的糖尿病大鼠有明 显的高血糖 （P 0. 05， 表 2， 3） 。 表 2 5 mmo
11、l/ L 葡萄糖及 0. 4 mmol/ L 软脂酸灌注条件下 大鼠心肌葡萄糖摄取量的比较 （mol/ g 干重， -x s， 每组 鼠数 =6） 组别10 min20 min30 min 正常对照组36 454 569 6 正常治疗组39 450 570 7 实验对照组23 3*37 3*55 6* 实验治疗组31 5#48 8#64 6# 注： 与正常对照组比较， *P 0.01； 与实验对照组比较，#P 0.05 表 3 30 min 灌注后各组大鼠心肌葡萄糖与脂肪酸氧化率 比较 （molmin -1g 干重-1 ， - x s， 每组鼠数 =6） 组别心肌葡萄糖脂肪酸氧化率 正常对照组
12、2. 1 0. 26. 4 0. 4 正常治疗组2. 1 0. 46. 6 0. 3 实验对照组1. 7 0. 3*7. 8 0. 8* 实验治疗组2. 0 0. 2#6. 1 0. 7# 注： 与正常对照组比较， *P 0.05； 与实验对照组比较，#P 0.05 3.心肌细胞膜 GLUT4 蛋白含量的比 较： Western 印迹法显示， 实验对照组大鼠心肌细胞膜上 GLUT4 的表达明显较少， 为正常组水平的 47% （P 0. 01） ， 而给予罗格列酮 2 周的实验治疗组大 鼠 GLUT4 含量明显较高， 达到正常组的 92%。罗 格列酮处理对正常大鼠心肌 GLUT4 表达无影响。
13、讨论 临床和实验研究均证明， 在糖尿病早期即可出 现心功能的改变， 且冠状动脉疾病常导致更严重的 左室功能障碍， 表明糖尿病可以直接导致心肌细胞 的损害， 使心肌对缺血的反应性增强。由于糖尿病 所具有的糖利用障碍特征， 能量代谢的异常被认为 可能是引起心肌损伤的重要物质基础 2， 6， 7。 本实验中离体心脏灌注时， 糖尿病大鼠心肌 30 min的葡萄糖总摄取量明显少于正常组， 代表脂 2641中华医学杂志 2005 年 6 月 8 日第 85 卷第 21 期 Natl Med J China，June 8， 2005，Vol 85，No. 21 肪酸氧化的3H2O 生成明显较多， 葡萄糖和脂
14、肪酸的 氧化比例与正常大鼠比较， 差异有统计学意义， 显示 2 型糖尿病早期心肌已出现能量底物的代谢变化即 葡萄糖氧化降低而脂肪酸氧化增加。 心肌细胞有氧代谢产生 ATP 的主要底物来自 于脂肪酸和葡萄糖， 生理状态下， 脂肪酸氧化提供心 脏 60% 70%的能量需求， 另外 30% 40% 来自于 葡萄糖氧化， 二者维持相对的平衡。根据葡萄糖-脂 肪酸循环学说， 当脂肪氧化增加时可以抑制葡萄糖 的氧化， 同样， 葡萄糖氧化的增加也可以抑制脂肪酸 的氧化， 两者之间存在着代谢竞争。心肌脂肪酸氧 化的增强一方面与血浆游离脂肪酸水平增加有关， 另一方面与心肌细胞对葡萄糖摄取能力的减退亦有 密切的关
15、系 7。葡萄糖转运进入细胞是心肌葡萄 糖氧化的主要限速步骤， 这一过程依赖细胞膜上特 定转运蛋白即 GLUT4 完成 8， 膜上 GLUT4 数量增 多， 则外源性葡萄糖被摄取率随之升高、 氧化率增 加， 因此 GLUT4 在心肌细胞膜上的表达量决定了细 胞葡萄糖氧化速率。在我们的研究中， 2 型糖尿病 大鼠心肌细胞膜上 GLUT4 的表达量明显低于正常 大鼠， 其结果必然会导致葡萄糖的跨膜转运减少， 这 与心肌葡萄糖摄取量和氧化率的降低相一致， 而葡 萄糖氧化能力的减弱也使脂肪酸氧化更趋活跃。 已有证据表明， 葡萄糖氧化的损害及脂肪酸氧 化的过度可以导致心肌组织机械功能障碍和心力衰 竭的进展
16、， 因为脂肪酸作为能量来源不如葡萄糖有 效， 需要消耗更多的氧才能产生等量 ATP， 使心脏机 械效率 （心脏作功/ 氧耗） 下降； 另外， 对脂肪酸的依 赖性增加， 将导致心肌组织中脂肪酸中间体如长链 乙酰辅酶 A 和长链酰基肉碱以及 H + 的堆积， 这些 介质可以直接损害细胞膜的完整性和细胞器 功能 9， 10。 IR 作为 2 型糖尿病的主要病理生理改变， 细胞 质膜 GLUT4 含量减少所致的受体后缺陷是其中重 要的环节之一。糖尿病导致 GLUT4 表达降低的原 因可能包括胰岛素信号传导障碍、 高糖及 FFA 水平 增高抑制 GLUT4 基因表达等 11， 12。罗格列酮作为 胰岛素
17、增敏剂， 通过激活靶组织 PPAR， 加强胰岛 素的信号转导， 增加 GLUT4 在细胞膜上的表达， 可 以改善 IR 13。离体研究也表明： 罗格列酮可增加 鼠心肌细胞对葡萄糖的转运以及 GLUT4 的表达。 本研究显示， 与糖尿病对照组比较， 糖尿病治疗 组大鼠心肌细胞膜上 GLUT4 的含量明显增加， 同时 心肌在 30 min 的灌注期内对葡萄糖的总摄取量明 显增加， 葡萄糖氧化率提高、 脂肪酸氧化率降低， 表 明罗格列酮通过增加细胞膜 GLUT4 的表达改善了 糖尿病的心肌能量代谢。 我们的实验结果证实， 由于心肌细胞膜上 GLUT4 表达减少所致的葡萄糖摄取能力的降低， 可 能是
18、2 型糖尿病心肌能量底物代谢改变的重要原 因。早期给予罗格列酮可以增加 GLUT4 在细胞膜 上的表达， 提高心肌对葡萄糖的利用， 增加葡萄糖氧 化。已有研究表明， 将能量底物的来源从脂肪酸代 谢转向葡萄糖代谢将有益于心脏 14， 因此， 我们认 为， 通过改善胰岛素抵抗、 提高心肌葡萄糖氧化率， 将有助于减轻 2 型糖尿病心肌细胞损伤， 增强心肌 对抗可能出现的缺血性损害的能力。 参考文献 1Mahgoub MA，Abd-Elfattah AS.Diabetes mellitus and cardiac function. Mol Cell Biochem， 1998， 180： 59-64
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