5氮2脱氧胞苷与三苯氧胺协同抗雌激素受体α阴性乳腺癌的体外实验研究.pdf

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1、书书书 普通外科基础研究 作者单位： 400038 重庆， 第三军医大学西南医院乳腺中心 （唐波、 姜军） ， 全军消化内科中心 （彭志红） 通讯作者： 姜军， Email：jcbd medmail. com. cn 5 氮 2 脱氧胞苷与三苯氧胺协同抗雌激素 受体 阴性乳腺癌的体外实验研究 唐波 彭志红 姜军 【摘要】 目的 观察5 氮2 脱氧胞苷 （5-aza-CdR） 对雌激素受体 （ER） 阴性人类乳腺癌细胞 株 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435ER 基因诱导表达作用； 5-aza-CdR 联合三苯氧胺 （TAM） 对 ER 阴 性乳腺癌细胞的体外抑制作用。方法 应用甲基

2、化特异性 PCR （MSP） 检测 MDA-MB-231 和 MDA- MB-435 细胞和 20 例 ER 阴性乳腺癌组织 ER 基因核心启动子区 CpG 岛甲基化情况； 5-aza-CdR 处 理 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435 细胞， 逆转录 PCR （RT-PCR） 检测 ERmRNA 表达； 5-aza-CdR、 TAM 分别或联合作用于 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435 细胞， MTT 比色法分析细胞生长抑制作用， 流式细 胞仪测定细胞周期分布和凋亡率。结果 适当浓度的 5-aza-CdR 能诱导 MDA-MB-231 和 MDA-MB- 435 细胞

3、表达 ERmRNA， 抑制细胞生长、 阻滞细胞周期于 G0/ G1期， 诱导细胞凋亡； TAM 对 MDA-MB- 231 和 MDA-MB-435 细胞生长、 细胞周期无影响； 而两药联合时能显著抑制细胞生长， 诱导细胞凋亡， 凋亡率分别为 48. 8% 和 53. 1%。结论 5-aza-CdR 能诱导 ER 阴性乳腺癌表达 ERmRNA， 恢复 ER 阴性乳腺癌细胞对 TAM 的敏感性， 联合 TAM 能协同抑制 ER 阴性乳腺癌细胞生长， 诱导细胞 凋亡， 从而为 ER 阴性乳腺癌开辟新的内分泌治疗途径提供实验依据。 【关键词】 乳腺肿瘤； 受体， 雌激素； 脱氧胞苷； 甲基化； 三苯

4、氧胺 The synergistic inhibitory effect of 5-aza-2-deoxycytidine and Tamoxifen on estrogen receptor alpha negative breast cancer cell lines in vitro TANG Bo*， PENG Zhi-hong，JIANG Jun. *Department of General Surgery，Southwest Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400038， China Corresp

5、onding author：JIANG Jun，Email：jcbdO medmail. com. cn 【Abstract】 Objective To observe if ER alpha gene can be induced by 5-aza-CdR in ER alpha negative human breast cancer cell lines（MDA-MB-231 and MDA-MB-435）and the synergistic inhibitory effects of 5-aza-CdR and Tamoxifen on these two cell lines in

6、 vitro. Methods The status of 5CpG island methylation of ER alpha gene in ER alpha negative （MDA-MB-231 and MDA-MB-435）human breast cancer cell lines and 20 cases of breast cancer tissue was studied by MSP， the expression of ER alpha mRNA was inspected by using RT-PCR after these two cell lines were

7、 treated with 5-aza-CdR. Cell proliferation was evaluated by MTT assay， distribution of cell cycle and rate of apoptosis were determined by flow cytometry after these two cell lines were treated with 5-aza-CdR or TAM alone， or in combination in vitro. Results The 5CpG island is methylated in the cor

8、e promotor of ER alpha gene in ER alpha negative（MDA-MB-231 and MDA-MB-435）human breast cancer cell lines and the methylating rate is 25. 0%， 66. 7%， 83. 3%， 100% in 20 cases of breast cancer tissue of stage ， ， ， ， respectively. The expression of ER alpha mRNA was induced in these two cell lines af

9、ter treated with 5-aza-CdR， MTT array showed the proliferation activity of these two cell lines was obviously reduced in 5-aza-CdR group and the inhibitory effect on proliferation was enhanced when 5-aza-CdR combined with TAM compared with control group， the induction of apoptosis was 11. 20% and 8.

10、 71% respectively by 5-aza-CdR， while the rate of apoptosis is 48. 8% and 53. 1% when these two cells were treated with 5-aza-CdR combined with TAM. Conclusions 5-aza-CdR can re-express ER alpha by demethylating and sensitive ER alpha negative human breast cancer cell lines to TAM， 5-aza-CdR and TAM

11、 synergistically inhibite proliferation and induce apoptosis in ER alpha negative human breast cancer cell lines， thus offer a new way for the treatment of ER alpha negative breast cancer. 【Key words】 Breast neoplasms； Receptors，estrogen； Deoxycytidine； Methylation； Tamoxifen 5451中华外科杂志 2005 年 12 月第

12、 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 雌激素受体 （ER） 阴性乳腺癌恶性度高， 对 以三苯氧胺 （TAM） 为代表的内分泌治疗不敏感， 目 前尚无有效治疗策略。ER 阴性乳腺癌中 ER 基 因表达沉默的机制不清， 推测与其启动子区 CpG 岛 甲基化有关。探索 ER 基因表达沉默机制， 恢复 ER 基因表达对于 ER 阴性乳腺癌治疗有重要意 义。我们利用甲基化特异性 PCR （MSP） 检测两株 ER 阴性人类乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和 MDA- MB-435 和 20 例 ER 阴性乳腺癌组织 ER 基因核

13、 心启动子 CpG 岛甲基化情况； 观察 5 氮 2 脱氧胞苷 （5-aza-CdR） 能否诱导 MDA-MB-231 和 435 细胞 ER 基因表达， 恢复其对 TAM 的敏感性； 并观察 5- aza-CdR 与 TAM 联合应用对这两株细胞生长、 细胞 周期及凋亡的影响， 旨在探索 5-aza-CdR 与 TAM 作 为 ER 阴性乳腺癌联合内分泌治疗方案的可行性， 为临床提供实验依据。 材料与方法 一、 材料 人乳腺癌细胞株 MCF-7、 MDA-MB-231 和 MDA- MB-435 购自中科院上海细胞所， 逆转录聚合酶链反 应 （RT-PCR） 试剂盒为日本 TaKaRa 公司

14、产品， 二甲 基亚砜 （DMSO） 、 5-Aza-CdR、 TAM 为美国 Sigma 公 司产品， DNA 标准分子量标记物为宝生物工程 （大 连） 有限公司， -actin 为鼎国公司产品， RT-PCR 引 物由上海生工生物工程有限公司合成。 二、 方法 1. 细胞培养： 人乳腺癌细胞株 MCF-7、 MDA- MB-231 和 MDA-MB-435 贴壁生长于含葡萄糖 4500 mg/ L DMEM 培养液中 （美国 GIBCO 公司） ， 内含 10%的胎牛血清 （杭州江滨生物技术有限公司） ， 青 霉素、 链霉素各 100 U/ ml， 于 37、 含体积分数为 5%CO2的饱和

15、湿度箱中培养， 每 4 5 d 消化传代 1 次。 2. ER 阴性乳腺癌组织来源： 收集我院 2001 2003 年经病检证实的石蜡包埋乳腺癌标本， 经免疫 组化复检证实 ER 阴性， 共 20 例， 年龄为 35 76 岁， 平均 57 岁。TNM 分期： 期 4 例， 期 9 例， 期 6 例， 期 1 例。病理组织学分型： 浸润性导管癌 11 例， 浸润性小叶癌 7 例， 浸润性导管癌伴粘液腺 癌 1 例， 导管内癌 1 例。 3. 培养细胞和组织基因组 DNA 提取： 取对数生 长期乳腺癌细胞， 离心、 收集细胞团块， 乳腺癌组织 标本， 经常规脱蜡、 水化、 蛋白酶 K 消化， 酚

16、-氯仿-异 戊醇法提取基因组 DNA， 紫外分光光度计测定 DNA 含量， 吸光度 （A） 260/ A2801. 8。 4. DNA 亚 硫 酸 盐 修 饰：按 CpGenome DNA Modification Kit （Intergen， 美国） 说明书进行， 其简要 步骤为： 取 1 g DNA 经 3 mol/ L NaOH 变性 10 min， 加入新鲜配制的 DNA 修饰试剂 550 l， 56 水浴 16 20 h。第 2 天， 加入修饰试剂 5 l 和修 饰试剂750 l 继续修饰， 然后用 70%乙醇和 90% 乙醇分别洗涤 DNA 2 次， 最后用30 l TE 缓冲液洗

17、 脱修饰好的 DNA，储存于 -15至 -25备用或继 续行 MSP。 5. MSP： MSP 引物参照参考文献 1 ， 具体序列 见表1， ER-M 和 ER-U 分别用于扩增 ER 基因核心 启动子区甲基化和非甲基化等位基因。 表 1 ER 基因核心启动子 MSP 引物 引物序列 ER-Uf5-TTTTGGGATTGTATTTGTTTTTGTTG-3 ER-Ur5-AAACAAAATACAAACCATATCCCCA-3 ER-Mf5-TTTTGGGATTGTATTTGTTTTCGTC-3 ER-Mr5-AACAAAATACAAACCGTATCCCCG-3 注： M 示甲基化引物，U 示非甲

18、基化引物，f 与 r 分别示正向与 反向引物 MSP 反应体系：（1） 50 l 反应体系： 5 buffer： 终浓度 1 ； 亚硫酸盐修饰后 DNA 1 g； dNTP： 终浓 度 400 mol/ L； 引物终浓度 0. 8 mmol/ L； Taq 酶 2. 5 U； MgCl2终浓度 2 mmol/ L； 其余加去离子水。 （2） 反应条件： 95 5 min，94 30 s， 5930 s， 7230 s， 35 个循环， 7210 min 延伸， PCR 产物 - 20 冰 箱保存。 （3） 结果观察： PCR 产物置 2%琼脂糖凝胶 电泳， Bio-Rad 凝胶图像成像仪观察结

19、果。 6. 5-aza-CdR 处理 MDA-MB-231 和 435 细胞， RT-PCR 检测 ERmRNA 表达： 取传代 24 h 后的乳 腺癌细胞 MDA-MB-231 和 435， 分别加入含终浓度 为 1 10 -7 mol/ L、 5 10 -7 mol/ L 和 1 10 -6 mol/ L 5-aza-CdR 的培养基继续培养 7 d， 收集细胞， 提取 mRNA， 行 RT-PCR， 其 PCR 引物设计及反应条件如 下： Sense： 5-ACTCAACAGCGTGTCTCCG-3， Aitisense： 5-AGCCCTCACAGGACCAGACT-3， 预期产物为

20、317 bp， -actin 上下游引物混合物： 来自鼎国公司， 其预 期产物为 540 bp。 两步法 RT-PCR：（1） 逆转录反应体系及条件： 20 l 反应体系： 10 RNA buffer 2 l， 终浓度 1 ； 6451中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 RNA 终浓度 100 ng/ l； dNTP： 终浓度 250 mol/ L； 引物终浓度 0. 8 mmol/ L； AMV 逆转录酶 2. 5 U； MgCl2终浓度 2. 0 mmol/ L； Oligo d

21、T 终浓度 2. 5 pmol/ l，Rnase Free dH2O 8. 5 l；Rnase 抑制剂20 U。反应条件： 3010 min， 4425 min， 995 min， 55 min， 逆转录产物 -20冰箱保存。 （2） PCR 反 应体系及条件： 50 l 反应体系： 5 buffer： 终浓度 1 ； cDNA 1 g； dNTP： 终浓度400 mol/ L； 引物终浓 度0. 8 mmol/ L； Taq 酶2. 5 U； MgCl2终浓度2 mmol/ L； 其余加去离子水。反应条件： 94 2 min， 5530 s， 7235 s， 35 个循环， 72 7 min

22、 延伸， PCR 产物 -20冰箱保存。 （3） 结果观察： PCR 产物置 2% 琼 脂糖凝胶电泳， Bio-Rad 凝胶图像成像仪观察结果。 7. 5-aza-CdR 联合 TAM 对 ER 阴性乳腺癌细 胞抑制效应：（1） 药物处理及分组： 5-aza-CdR 用 DMSO 稀释配成 10 -6 mol/ L 母液， TAM 以 100% 乙 醇溶解后无菌过滤配制成 10 -3 mol/ L 母液，-20 保存备用。实验设对照组、 他莫昔芬组 （参照文献 推荐浓度为 1 10 -5 mol/ L 4） 、 5-aza-CdR 组 （浓度 分别为： 1 10 -7 mol/ L、 5 10

23、 -7 mol/ L 和 1 10 -6 mol/ L） ， 联合用药组 （TAM 1 10 -5 mol/ L， 5-aza- CdR1 10 -6 mol/ L） 。 （2） 四甲基偶氮唑蓝 （MTT） 比色分析法： 浓度为 1 105个/ ml 的细胞接种于 96 孔培养板内， 200 l/ 孔， 每组 8 孔。药物作用 72 h 后加 5 mg/ ml MTT （Fluka， 瑞士） 20 l / 孔， 继续培 养 4 h， 吸去上清液， 每孔加入 DMSO 200 l， 震荡 5 min， 在自动酶标仪 （波长 600 nm） 上进行比色， 自动 记录每孔吸光度值 （A） ， 以上实

24、验重复 3 次。计算 不同浓度药物单用或合用对 MDA-MB-231 及 MDA- MB-435S 两细胞株的生长抑制率。抑制率为 （对照 组 A 值 - 实验组 A 值） / 对照组 A 值 100%。 （3） 流式细胞术 （FCM） ： 收集药物作用 72 h 的细胞制成 单细胞悬液， 用碘化丙啶 （PI） 染色， 上机， 用 Becton- Dickinson 公司 FACS Calibur 型流式细胞仪测定细 胞周期和凋亡率 （激发波长 488 nm） 。计数 30 000 个细胞， 用随机所附软件对测量值进行分析。 8. 统计学方法： 实验数据以 -x s 表示， 用 t 检 验进行

25、统计学分析。 结果 一、 MSP 分析 1. 人类乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和 MDA- MB-435 ER 基因核心启动子区甲基化情况： ER 阴性乳腺癌细胞株 MDA-MB-231、 MDA-MB-435 用 甲基化引物扩增出预期大小产物， 非甲基化引物未 见扩增产物， 而 ER 阳性乳腺癌细胞株 MCF-7 用 非甲基化引物扩增出预期大小产物， 而甲基化引物 未见扩增产物 （图 1） 。 M： 标记物； 1、 2、 3、 4、 5、 6 分别为 MCF-7 细胞非甲基化产 物 ER-U、 甲基化产物 ER-M、 MDA-MB-231 细胞非甲基 化产物 ER-U、 甲基化产物

26、ER-M、 MDA-MB-435 细胞非 甲基化产物 ER-U、 甲基化产物 ER-M 图 1 MSP 检测 MCF-7、 MDA-MB-231、 MDA-MB-435 细胞 ER 核心启动子甲基化 2. ER 阴性乳腺癌组织 ER 基因核心启动子 区 CpG 岛甲基化情况： MSP 检测结果显示： 20 例乳 腺癌组织标本中， 期4 例中有1 例 ER 基因核心 启动子区存在甲基化 （25%） ， 期 9 例中有 6 例存 在甲基化 （66. 7%） ， 期 6 例中有 5 例存在甲基化 （83. 3%） ， 期 1 例检测证实存在甲基化 （100%） 。 由此可以看出， ER 阴性乳腺癌中

27、 ER 基因核心启 动子区甲基化水平与肿瘤分期成正相关， 肿瘤分期 愈晚， 甲基化比例愈高 （图 2） 。 M： 标记物： 1、 3、 5、 7 分别为、 、 、 期乳腺癌细胞非甲 基化产物 ER-U、 2、 4、 6、 8 分别为、 、 、 期乳腺癌组 织甲基化产物 ER-M 图 2 MSP 检测不同分期乳腺癌组织 ER 核心启动子甲基 化 7451中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 二、 5-aza-CdR 处理 MDA-MB-231 和 MDA-MB- 435 细胞后 ERmR

28、NA 表达情况 ER 阴性乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和 MDA- MB-435 在 5-aza-CdR 处理前， ERmRNA 表达均阴 性， 5-aza-CdR 处理后， 两种细胞 ERmRNA 均阳性 表达 （图 3） 。 M： 标记物； 1、 2、 3、 4 分别为对照组、 1 10 -7mol/ L、 5 10-7 mol/ L 和 1 10 -6mol/ L 5-aza-CDR 处理 MDA-MB-231 细胞 后， ER mRNA 表达情况； 5、 6、 7、 8 分别为对照组、 1 10 -7 mol/ L、 5 10 -7 mol/ L 和 1 10 -6 mol/

29、L 5-aza-CDR 处理 MDA-MB-435 细胞后， ER mRNA 表达情况 图 3 RT-PCR 检测 MDA-MB-231 和 435 细胞 ER mRNA 表达 三、 分别或联合运用 5-aza-CdR、 TAM 对细胞生 长的抑制作用 与对照组相比， 5-aza-CdR 组能显著抑制细胞生 长， 且随着药物浓度增加， 抑制率亦逐渐增加； TAM 对细胞生长无明显影响， 而与对照组和 5-aza-CdR 单剂作用组比较， 联合用药组更能显著抑制细胞生 长 （表 2） 。 表 2 5-aza-CdR、 TAM 单用或联合对两株人乳腺癌 细胞体外生长的抑制率 （%， -x s） 药

30、物分组 （mol/ L） MDA-MB-231 细胞 MDA-MB-435 细胞 对照组00 TAM 1 10 -5 0.49 0.06-0.62 0.03 5-aza-CdR 1 10 -7 1.10 0.11-0.37 0.02 5 10 -7 2.57 0.20*0.92 0.08* 1 10 -6 19.52 1.40*20.00 1.73* 联合组 TAM 1 10 -5 +5-aza- CdR1 10 -6 47.66 3.57 *# 47.45 3.68 *# 注： 与对照组比较， *P 0. 05； 与 5-aza-CdR （1 10-6 mol/ L） 组 比较， #P 0.

31、 05 四、分别或联合运用 5-aza-CdR、 TAM 对细胞周 期和凋亡的影响 与对照组相比， 5-aza-CdR 组 G0/ G1期细胞增 多， S 期和 G2、 M 期细胞减少， 流式细胞仪检测凋亡 率分别为 8. 7%和 11. 2%。与对照组和单剂作用组 比较， 联合用药组 G0/ G1期细胞明显增多， S 期和 G2、 M 期细胞明显减少， 流式细胞仪检测出现标志 细胞凋亡的亚 G1 期 “ 凋亡峰” ， 凋亡率分别为 48. 8%和 53. 1%。结果见表 3。 表 3 5-aza-CdR、 TAM 单用或联合对两株乳腺癌 细胞周期和凋亡的影响 （%， -x s） 细胞株药物分

32、组 细胞周期时相分布 G0/ G1SG2、 M 凋亡率 （%） MDA-MB-231 细胞对照组 52. 0 2. 8 38. 1 3. 6 10. 3 1. 2 0. 12 5-aza-CdR 组 64. 7 4. 8 36. 9 3. 4 11. 0 1. 1 8. 71 TAM 组 53. 7 2. 7 37. 1 3. 8 9. 9 1. 4 0. 27 联合用药组 78. 3 5. 5 *# 16. 7 1. 8 *# 5. 0 0. 8 *# 48. 81 *# MDA-MB-435 细胞对照组 50. 2 2. 5 37. 6 3. 3 12. 9 1. 6 0. 16 5-az

33、a-CdR 组 67. 2 3. 1 19. 8 2. 1 4. 8 0. 6 11. 20 TAM 组 52. 1 3. 5 38. 2 3. 4 11. 5 1. 4 0. 22 联合用药组 79. 0 5. 3 *# 15. 7 2. 2 *# 5. 3 1. 0 *# 53. 10 *# 注： 与对照组比较，*P 0. 01；与 5-aza-CdR （1 10 -6 mol/ L） 组比较， #P 0. 05 讨论 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 其中约 1/3 为 ER 阴性。研究表明， ER 阴性乳腺癌比 ER 阳性乳腺癌具有更强的侵袭和转移能力， 预后 更差 2。且该类肿瘤对

34、以 TAM 为代表的内分泌治 疗不敏感， 目前主要采用手术、 放化疗为主的综合治 疗模式， 但仍有较高的复发和转移率， 因此探寻新的 治疗策略有重要意义。既往研究已证实， 通过某种 途径诱导 ER 表达， 可使该类肿瘤对内分泌治疗敏 感， 联合他莫昔芬等抗雌激素药物可有效治疗该类 肿瘤 3。常用方法为基因转染， 将 ER 基因转入 ER 阴性乳腺癌细胞， 恢复该基因表达， 证实转染 后肿瘤细胞即能恢复对他莫昔芬的敏感性， 联合他 莫昔芬可有效治疗该类肿瘤 3。但因基因转染效 率低、 无高效靶向载体、 操作较复杂等原因临床应用 受限。 8451中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第

35、23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23 近期研究表明， ER 阴性乳腺癌中 ER 基因缺 失、 突变等遗传学改变发生率低， 推测与其启动子区 CpG 岛甲基化有关 4， 探索 ER 基因表达沉默机 制， 对于 ER 阴性乳腺癌治疗有重要意义。在本实 验中我们利用 MSP 检测两株 ER 阴性人类乳腺癌 细胞株 MDA-MB-231、 MDA-MB-435 和20 例 ER 阴 性乳腺癌组织中 ER 基因核心启动子区 CpG 岛甲 基化情况， 进一步证实 ER 阴性乳腺癌组织和细胞 中核心启动子区存在 CpG 岛高甲基化， 且与肿瘤分 期呈

36、正相关， 即肿瘤分期愈晚， ER 基因核心启动 子甲基化比例愈高， 说明 ER 基因核心启动子区高 甲基化可能在乳腺癌发生发展过程中发挥重要作 用， 是乳腺癌发生发展过程中的一个重要表遗传学 事件， 可作为评估乳腺癌患者预后的一个重要指 标 5。 既然 ER 基因表达沉默与其核心启动子区 CpG 岛甲基化有关， 失活的 ER 基因能否通过去甲 基化抑制剂的作用重新表达， 进而恢复其对 TAM 的 敏感性？现最常用的 DNA 甲基化抑制剂为胞苷类 似物5 氮杂脱氧胞苷， 通过与 DNA 甲基化酶共价 结合降低酶的生物活性来发挥去甲基化作用， 目前 主要用于白血病、 骨髓增生异常综合征等恶性血液

37、病以及肺癌的治疗， 并取得了较好的疗效 6。 本实验选用两株 ER 阴性人类乳腺癌细胞株 MDA-MB-231 和 435 为研究对象， 观察了 5-aza-CdR 对这两株细胞 ER 基因诱导表达作用以及 5-aza- CdR 联合 TAM 对细胞生长、 细胞周期和细胞凋亡的 影响。本研究发现： 适当浓度的 5-aza-CdR 即能诱 导 ER 阴性乳腺癌细胞 ERmRNA 表达， 同时可抑 制细胞生长， 诱导细胞凋亡， 其凋亡率分别为： 11. 23%和 13. 46%， 5-aza-CdR 对细胞的体外抑制 作用， 可能在很大程度上依赖于其去甲基化诱导某 些因表遗传学改变而表达沉默的抑癌

38、基因再表达有 关 7。我们实验进一步观察 5-aza-CdR 能否恢复 ER 阴性乳腺癌细胞对 TAM 敏感性， 协同 TAM 抑 制细胞生长， 诱导细胞凋亡。MTT 结果表明：5-aza- CdR 和 TAM 联合用药组能显著抑制 MDA-MB-231 和 MDA-MB-435 乳腺癌细胞增殖， 与对照组比较有 显著性差异 （P 0. 05） ， 说明这两种药物联合能增 强对这两种细胞的生长抑制作用。用流式细胞仪检 测细胞周期分布结果也发现， 联合用药组较对照组 出现 G0/ G1期周期阻滞， S 期和 M 期细胞有所下 降。细胞凋亡检测时发现 5-aza-CdR 单剂作用组和 联合用药组出

39、现特征性的亚二倍峰 （凋亡峰） ， 两组 细胞凋亡率分别为53. 1%和48. 8%， 对照组和 TAM 作用组未检测到凋亡。说明 5-aza-CdR 能作为去甲 基化药物诱导 ER 基因表达， 恢复 ER 阴性乳腺 癌细胞对 TAM 的敏感性， 联合 TAM 有效治疗该类 肿瘤， 这就为 ER 阴性乳腺癌开辟新的内分泌治疗 途径提供了实验依据。 参考文献 1Stoner M， Saville B， Wormke M，et al. Hypoxia induces proteasome- dependent degradation of estrogen receptor alpha in ZR

40、-75 breast cancer cells. Mol Endocrinol， 2002， 16： 2231-2242. 2Powles TJ. Anti-oestrogenic prevention of breast cancer-the make or break point. Nat Rev Cancer， 2002， 2： 787-794. 3Shao Z， Jiang M， Yu L， et al. Estrogen receptor-negative breast cancer cells transfected with estrogen receptor exhibit d

41、ecreased tumour progression and sensitivity to growth inhibition by estrogen. Chin Med Sci J， 1997， 12： 11-14. 4Widschwendter M， Siegmund KD， Muller HM， et al. Association of breast cancer DNA methylation profiles with hormone receptor status and response to tamoxifen. Cancer Res， 2004， 64： 3807-381

42、3. 5Ross JS，Linette GP，Stec J， et al. Breast cancer biomarkers and molecular medicine：part II. Expert Rev Mol Diagn， 2004， 4： 169- 188. 6Miyamoto K，UshijimaT. DNAmethylationandcancer-DNA methylation as a target of cancer chemotherapy.Gan To Kagaku Ryoho， 2003， 30： 2021-2029. 7Yang Q， Shan L， Yoshimura G， et al. 5-aza-2-deoxycytidine induces retinoic acid receptor beta 2 demethylation，cell cycle arrest and growth inhibition in breast carcinoma cells. Anticancer Res， 2002， 22： 2753-2756. （收稿日期： 2004-12-27） （本文编辑： 韩静） 9451中华外科杂志 2005 年 12 月第 43 卷第 23 期 Chin J Surg，December 2005， Vol. 43， No. 23