60885铁路一次性餐盒降解性能试验 生物降解性能试验方法 标准 TB T 2611.3-1999.pdf

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1、TB 中华人 民共和 国rt 失 道行业标准 TB广2 61 1 . 3 - 1 9 9 9 铁路一次性餐盒降解性能试验 生物降解性能试验方法 1 9 9 9 - 0 2 - 1 3 发布1 9 9 9 - 0 9 - 0 1 实施 中华人 民共和国铁道部发布 】 1 生 汀2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 目次 2J4获UQC 一一 1范围 2 引用标准 3定义 4 霉菌侵蚀试验 5 纤维素酶浸蚀试验 附 录A ( 标准的附录) 培养基的制备方法 附录 B ( 标准的附录) 混合霉菌抱子悬液的制备方法 附录C ( 提示的附录) 二氧化碳生成量测定 附录D( 提示的附录) 试验结果报

2、告单 TB / r 2 6 1 1. 3 - 1 9 9 9 前言 本标准是在参照采用 A S F M G 2 1 -9 0 “ 人工合成高分子聚合物材料的抗霉性测定” 的基 础上， 经充分验证、 系统完善后制订的。在微生物侵蚀试验中， 补充采用了I S O 8 4 6 -1 9 7 8 D e t e r m i n a t i o n o f B e h a v i o u s u n d e r t h e A c t io n o f F u n g i a n d B a c t e r ia ， 中的“ 失重试验” 内容。 本标准的附录 A、 附录 B是标准的附录， 附录C、 附录

3、 D是提示的附录。 本标准由铁道部劳动卫生研究所提出并归口。 本标准由铁道部劳动卫生研究所负责起草。 本标准主要起草人: 孔宪会、 王东黎。 本标准由铁道部劳动卫生研究所负责解释。 中 华 人 民 共 和 国 铁 道 行 业 标 准 T B汀 2 6 1 1 . 3 -1 9 9 9 铁路一次性餐盒降解性能试验 生物降解性能试验方法 范 围 本标准规定了铁路一次性餐盒生物降解性能评价的基本技术要求、 基本原理、 方法分类及 技术条件 。 本标准适用于纸制餐盒( 碗、 盘、 碟等) 及光一生物降解聚丙烯餐盒( 以下简称新型聚丙烯 餐盒) 的生物降解性能评价。 2 引用标准 下列标准包含的条文，

4、通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。在标准出版时， 所示 版本均为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可 能性。 G B 2 4 2 3 . 1 6 - 9 0 电 工 电 子 产 品 基本 环 境 试 验规 程 试验J : 长 霉 试 验 方 法 3 定义 本标准采用下列定义。 3 . 1 生物降解( b i o d e g r a d a t io n ) 在自然环境中， 天然高分子聚合物在微生物和昆虫的生物酶作用下， 引起生物氧化反应， 出现霉变、 腐烂 、 泥化现象， 最终形成二氧化碳和水。 3 . 2 光一生物降解( p h o t o a n

5、 d b i o - d e g r a d a t i o n ) 光一生物降解塑料， 在户外日 光、 温度、 氧、 潮湿等因素的作用下， 加速了高分子聚合物 自 身光氧化反应过程， 引起从外观到内在质量变化( 物理性能降低、 分子量下降、 化学结构变化 等) ， 所含促生物氧化成分及新生亲水活性基团或其他含氧基团， 继续被微生物酶作用而进一 步降解的过程。 3 . 3 光降 解诱导期( p h o t o d e g r a d a b l e i n d u c t io n p e r io d ) 光降解或光一生物降解塑料经日光照射( 或氖弧光、 紫外光加速) ， 感观脆性增加， 外

6、观出 现 1 -2 c m裂口或裂纹的时期。 中华人民共和国铁道部1 9 9 9 - 0 2 - 1 3 批准1 9 9 9 - 0 9 - 0 1 实施 1 T B/ 1 2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 4 耳菌侵蚀试验 4. 1 原理 模拟清洁环境下样品被微生物分解的情况。将待检样品和对照样品作为唯一的碳源提供 给微生物生长利用。 4 . 2 适用范围 适用于各种铁路一次性餐盒。 4 . 3 试验设备 应包括以下器材设备: a ) 玻璃器皿: 锥形瓶， 平皿( 直径9 c m ) , 量筒， 无菌 试管， 无菌刻度吸 管( 1 . 0 m L , 5 . 0 m L , 1 0

7、 . 0 mL ) b ) 精密p H试纸; c ) 恒温恒湿培养箱( 2 8 - 3 0， 相对湿度不低于 8 5 %) ; d ) 美术喷枪( 喷嘴孔径应不大于0 . 5 mm) ; e ) 电动低压喷泵( 流量: 3 L / m i n ， 空气压力: 0 . 4 k g / c m) ; f ) 体视显微镜; 9 ) 血 球计数板; h ) 酒精灯; i ) 冰箱; J ) 微波炉; k ) 生物安全柜。 4 . 4 试剂和材料 4 . 4 . 1 凡未说明规格的试剂， 均为分析纯( A R ) ， 所用水均为去离子水。 4 . 4 . 2 将样品剪成2 0 m m x 4 0 m m

8、的试验样片， 经灭菌处理后备用。 4 . 4 . 3 新型聚丙烯样品在制备试验样片前应先确认无霉变， 再用水清洗干净后制样。 4 . 5 培养基 按附录 A要求制备以下培养基: a ) 查氏培养基; b ) 马铃薯蔗搪培养基; c ) 基础无碳源培养液; d ) 基础无碳源琼脂培养基。 4 . 6 试验菌种 4 . 6 . 1 试验菌种如下: a ) 黑曲霉( A S 3 . 3 9 2 8 ) ; b ) 土曲霉( A S 3 . 3 9 3 5 ) ; c ) 球毛壳( A S 3 . 4 2 5 4 ) ; d ) 绿色木霉( AS 3 . 4 0 0 5 ) ; e ) 出芽短梗霉(

9、A S 3 . 3 9 8 4 ) ; f ) 绳状青霉( A S 3 . 3 8 7 5 ) . 4 . 6 . 2 将以上菌种保存在查氏培养基上， 4存放， 6 个月转种一次。使用时， 分别接种于马 2 T B/ f 2 6 1 1. 3 -1 9 9 9 铃薯蔗糖培养基斜面上， 2 8 C - - 3 0培养 7 -1 4天， 制备混合抱子悬液。 4. 7试验分组 4 . 7 . 1 将试验样片分成三组， 第一组为零对照组， 在试验室自然放置。第二组为无菌对照组， 试验样片不接种菌液， 第三组为侵蚀试验组。将第二、 三组同样条件培养。 4 . 7 . 2 每组试验样片应包括生物降解阳性对

10、照样片( 可用滤纸片) 、 阴性对照样片( 可用聚丙 烯塑料样片) 和待检样片。第三组侵蚀试验组的阳性对照样片表面应有大量真菌生长， 否则本 试验要 重作。 4. 8试验样片预处理 将制成的各组试验样片浸人 7 5 %乙醇中3 0 mi n , 室温下 自然干燥过夜后， 移人干燥器中 半小时， 称重直至恒重， 记录初始质量。 4 . 9 霉菌混合抱子悬液的制备 按附录B要求制备霉菌混合抱子悬液。 4. 1 0试验步骤 4 . 1 0 . 1 倒板: 将基础无碳源琼脂培养基加热融化后倒进平皿， 每平皿培养基深度 8二 一1 0 m m . 4 . 1 0 . 2 接种: 在生物安全柜内将侵蚀试验

11、组的各样片分别置于无菌平皿内， 再用美术喷枪分 别将 0 . 2 mL霉菌抱子悬液喷于各样片表面， 同时作无菌对照和零对照。 4 . 1 0 . 3 加试验样片: 将染菌的各样片静置 1 分钟后以无菌程序将其置于预先制备好的平皿 培养基表面， 每皿 2 片做三皿。要避免样片之间、 样片与平皿之间接触。 4 . 1 0 . 4 培养: 将接种好的平皿及无菌对照平皿用胶带封好， 置霉菌培养箱中， 3 0 1C， 相对湿度 大于 9 0 %， 培养2 8 天， 培养箱每周换气一次。零对照平皿在试验室自然放置。定期观察上述 平皿中各样片表面霉菌生长情况， 取三皿平均霉菌覆盖面积的百分比按表 1 要求作

12、分级记录。 4 . 1 0 . 5 结果观察: 以肉眼观察为主， 观察不清时应辅以体视显微镜观察。长霉分级记录应符 合表 1 要求。 表 1 微生物生长分级方法 级 别一试 样 上 微 生 物 覆 盖 面 的 百 分 比 生 长 程 度 肉眼未见生长， 放大5 0倍镜检阴性 1 0 % 3 0% 6 0 % - 6 0% 无 微量 轻 度 中 度 重 度 numIV 4 . 1 0 . 6 失重检验: 将试验后样片置于微波炉中， 中高火( 6 5 0 W) 灭菌5 m i n ， 用水冲 洗干净， 在 室温 自然干燥过夜， 移人干燥器中， 称重直至恒重， 按以下公式计算失重率。 A m一 (

13、A m +A mo ) 1 X 1 0 0 M= 刀7 e ( 1 ) 式中M失重率， %; m1 刀 之 接种菌液样片培养前后的质量差， 9 ; 无菌对照样片培养前后的质量差， 9 ; TB /r 2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 A m p 零对照 样片 试验前后的 质量差， g ; m e 试验 样片的 初始质量， g o 4 . 1 1 技术要点 4 . 1 1 . 1 新型聚丙烯餐盒样品， 如经光降解达碎化、 粉化的样片小于2 0 m m X 4 0 m m， 则不适 宜作此试验。 4 . n. 2 无菌对照应在不接种菌的情况下， 置培养箱中与 试验组一起培 养。 4 .

14、1 1 . 3 如样片上污染物较多， 可用脱脂棉沽水轻轻擦拭。 4 . 1 1 . 4 保存菌种如用查氏培养基， 配制中 每种盐要依次溶解， 坟H Y O Q 要单溶 4 . 1 1 . 5 美术喷枪喷嘴孔径应不大于0 . 5 mm， 要使喷出的袍子悬液呈细雾状， 不得出现小水 滴 。 4 . 1 1 . 6 接种喷菌操作必须在生物安全柜中进行， 要严格防止霉菌抱子弥散， 操作人员的安全 防护措施应符合“ B 2 4 2 3 . 1 6 -9 0 要求。 4 . 1 1 . 7 无碳源琼脂培养基所用琼脂应具有高纯度。 4 . n. 8 试验后样品微波灭菌时， 应采用间歇灭菌， 以避免培养基受热

15、溢出。 5 纤维素酶侵蚀试验 5 . 1 原理: 纤维素酶从纤维素中分解出还原 搪， 还原糖又同2 4 基一 3 , 5 一 二硝基苯用酸反应产生一种 黄一 橙混合物， 可用肉眼或分光光度计法测定其色深。 5 . 2 适用范围 适用于纸制餐盒的生物降解性能检验。 5 . 3试 验 器 材 试 验 所 需 器 材 如 下: a ) 2 5 m L 刻度试管; b ) 1 c m比色皿; c ) 7 2 1 分光光度计; d ) 食品粉碎机( 1 2 0 0 0 r / min ) ; e ) 1 0 0 m L , 1 0 0 0 m L 容量瓶。 5 . 4 试剂 5 . 4 . 1 指示剂

16、溶液: 用少许蒸馏水同1 . 0 g 2 - 经基一 3 , 5 一 二硝基苯甲酸拌和， 然后边摇动边滴 加2 m o l 几 的氢氧化钠溶液 2 0 mL ， 至2 - 经基 3 , 5 一 二硝基苯甲酸溶解。用 5 0 m工 _ 去离子水稀 释， 再加3 0 g 四 个结晶水的 酒石酸 钠， 溶解后再用去离子水定容至1 0 0 m L 。 在4 下密封保 存。 5 . 4 . 2 乙 酸盐缓冲液( p H 4 . 6 ) : 取2 m o l / L的乙酸5 0 m L 与5 0 m L 2 m o l / L的乙 酸钠溶液混 合， 并用蒸馏水定容至1 0 0 0 m L a 5 . 4

17、. 3 常规配制 2 mo l / L的氢氧化钠溶液。 5 . 4 . 4 纤维素酶溶液: 将成品纤维素酶用醋酸盐缓冲液溶解， 使酶活力为 3 0 U/ mL 5 . 5 试样预处理及分组 5 . 5 . 1 称取5 g 样品加2 0 0 m L 醋酸缓冲液， 用食品粉碎 机粉碎打浆， 取浆液进行试验。 5 . 5 . 2 取三只2 5 mL刻度试管， 按表 2 要求编号。 4 TB/ r 2 6 1 1. 3 - 1 9 9 9 表 2 试验分组及步骤一 用量 试管号 123 样品( 9 ) 缓冲液( .L ) 酶 溶液 ( m L )一 0. 5 1 . 5 一 ; .: 0. 5 1 .

18、 5 2. 0 注: 1 , 2 , 3号管分别为“ 试样空白管、 试剂空白管及试验主值管” 。 5 . 6 试验步骤 5 . 6 . 1 按表2 要求， 各称取0 . 5 g 纸浆放入1 号、 3 号管内 。再将1 , 2 , 3 号 管置于4 0 恒温 水 浴中， 各加人 1 . 5 mL已预热的醋酸缓冲液后， 再向2 号及3号管各加人2 . 0 mL的酶溶液， 混 合， 保温3 0 m in a 5 . 6 . 2 按表3 要求向1 , 2 , 3 号管各 加人1 . 0 m L 氢氧化钠溶液和2 . O m L的 指示剂溶液， 使反 应终止， 再向 1 号管加人2 . 0 mL的酶溶液

19、。 表 3 试验分习 1 及步骤二 用量 试管号 123 氢氧化钠溶液( mL ) 指示M 1 溶液( tnL ) 酶溶液( 3 0 U/ m l ) 1 . 0 2. 0 2. 0 1 . 0 2. 0: : 5 . 6 . 3 将上述 1 , 2 , 3号管置于沸水浴中5 min ， 流水冷却后用蒸馏水定容至 2 0 mL 。目测色 深是否为黄橙色。 5 . 6 . 4 目测不易与空白对照分辨时， 将试液用滤纸过滤后用分光光度计作常规比色， 于 4 9 0 二 处以空白值为参比测定吸光度， 判断色深。 TB/ T 2 6 1 1 . 3 -1 9 9 9 附录A ( 标准的附录) 培 养

20、基 的 制 备 方 法 查 氏培 养基 A l. 2 成分 Na N咙 KCI Mg S O 4 . 7 H2 0 乓 HP ( 无 F e S O4 蔗糖 琼脂粉 去离子水 制法 1 . 5 g 0 . 2 5 g 0 . 2 5 g 0 . 5 g 0. 0 0 5 g 1 5 g 8一1 0 g 5 0 0 m L la)b)c)d)e)f)动h) AlM 每种盐依次 和琼脂粉加热溶解于1 0 0 0 m L 三角瓶内( 姚H P 0 4 单溶后再加人溶液中) ， 调 p H至6 . 0 ， 分装试管， 1 2 1 灭菌2 0 m i n ， 制成斜面备用。 A 2 马铃挤蔗糖培养甚 取

21、新鲜马 铃薯去皮洗净切片， 称取2 0 0 g 放人盛有1 0 0 0 m L水的大烧杯中， 煮沸3 0 m i n 后用纱布滤去渣滓， 将滤液移人 5 0 0 mL锥形瓶中， 加人 2 %蔗糖, 2 9 6 琼脂， 分装试管， 1 2 1 灭 菌2 0 m i n ， 制成斜面备用。 A 3 基础无碳源培养液 A 3 . 1 成分 a ) K 2 HP 0 4 0 . 7 g b ) K H 2 P O 4 0 . 7 g c ) Mg S O 4 . 7 H 2 0 0 . 7 g d ) N 践N 0 3 1 . 0 g e ) N a C l 0 . 0 0 5 g f ) F e S

22、 O 4 . 7 比O 0 . 0 0 2 g g ) Z n S O 4 - 7 H 2 0 0 . 0 0 2 g h ) Mn S O 4 . H 2 0 0 . 0 0 1 g 1 ) 去离子水1 0 0 0 mL A3 . 2 制法 6 TB/I 2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 将上述成分依次溶解于装有1 0 0 0 m L 蒸馏水的三角瓶中， 调p H至6 . 0 ， 将培养液在 1 2 1 高压灭菌 2 0 min . A 4 基础无 碳源 琼脂培养基 在基础无碳源培养液中按 2 %加人琼脂粉， 加热溶解， 1 2 1 高压灭菌2 0 m i n 。试验前倒 1 0深

23、的平板备用 TB/ r 2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 附录B ( 标准的附录) 混合霉菌抱子悬液的制备方法 B 1 用无菌吸管吸取 1 0 m L含湿润剂( 0 . 0 5 %吐温 8 0 ) 的无菌水 1 0 mL ， 轻轻加至培养 7 -1 4 的成熟菌管中。 B 2 用接种环轻轻刮出 抱子， 移人 装有3 0 m L 无菌水的三角瓶中 ( 内 含玻璃珠) ， 剧烈振荡， 使 抱子团分散。 B 3 用双层纱布过滤除去菌丝碎片， 将滤液移至离心管中， 以3 0 0 0 r / m i n 离心1 0 mi n ， 去掉上 清液， 用 5 0 mL灭菌去离子水使沉淀再悬浮， 再离

24、心， 如此清洗饱子三次。 B 4 用5 0 m L 基础无碳源培养液稀释最终沉淀物。用 血球计数板计数上述悬液， 使抱子数为 1 0 7 个/ m L 。 如低于上述值， 向 抱子 液中 再移人抱子， 反之应将抱子液稀释。 B 5 每种菌均单独制备抱子悬液， 将五种制好的单一抱子悬液按等体积混合， 即为混合抱子 悬液， 并应在当天使用! B 6 全部操作过程均应由受过专门训练的微生物检验人员在生物安全柜中进行。 T B/ r 2 6 1 1. 3 - 1 9 9 9 附录C ( 提示的附录) 二氧化碳生成t测定 CI 原理 生物降解过程中产生的二氧化碳被氢氧化钡溶液吸收， 形成碳酸钡沉淀， 过

25、剩的氢氧化钡 溶液可用盐酸 标准溶液滴定， 根据所消耗标准溶液的体积， 计算出 二氧 化碳的 生成量。 C 2 适用范围 适用于经光降解试验达碎化、 粉化的光一生物降解聚丙烯餐盒残渣。 C 3 试验器材 本法所需试验器材如下: a ) 1 0 0 m L , 5 0 0 m L锥形瓶; b ) 橡胶塞， 导气管; C ) 5 0 m L 酸式滴定管; d ) 气泵( 1 L / m i n ) ; e ) 振荡培养箱。 C 4 试剂 本法所需试剂如下: a ) 梭甲基纤维素钠; b ) C ( H C I ) =0 . 0 5 mo l 几 盐酸溶液; C ) 0 . 0 1 2 5 m o

26、l / L的氢氧化钡溶液: 标定后用滤纸过滤后密封保存。 C 5 培养液 按附录A要求配制基础无碳源培养液。 C 6 试验菌种 试验菌种同4 . 6 . 1 ， 并按附录 B要求制备成高活力霉菌抱子混合液。 C 7 试样制备及预处理 将标准非降解对照样剪碎， 将经过光降解碎化或粉化的试样研碎后备用。 C 8 试验分组 C 8 . 1 试验共分四组， 第一组生物降解阳性组， 第二组阴性对照组， 第三组基础无碳源培养液 9 T B 广T 2 6 1 1 . 3 - 1 9 9 9 空白对照组， 第四组被检试验组。每组设三个平行样。 C 8 . 2 以竣甲基纤维素钠为生物降解阳性对照， 以聚丙烯塑料

27、为阴性对照。 C 9 试验步骤 C 9 . 1 取 1 2 个 5 0 0 mL锥形瓶分成四组， 在每个锥形瓶中各加人 5 0 0 n i l , 无碳源培养液。在 第一组各加人2 g 梭甲 基纤维素钠， 第二组各加入5 g 聚丙烯细碎块， 第四组各加人5 g 粉碎 被检样品 。 C 9 . 2 各锥形瓶分别接种新制成的高活力霉菌抱子混合液0 . 1 mL o C 9 . 3 在每个锥形瓶口上用导气管依次连接三个装有0 . 0 1 2 5 m o l 几 氢氧化钡溶液 1 0 0 m L 的二氧化碳吸收瓶。 C 9 . 4 将上述锥形瓶于3 0 振荡培养。 C 9 . 5 按下述步骤分析二氧化

28、碳释放量: C 9 . 5 . 1 在培养后的第2 , 4 , 7 天时， 用气泵以每分钟 5 0 m L - 1 0 0 m L的流速向锥形瓶中吹入无 二氧化碳的空气， 使每个锥形瓶中产生的二氧化碳与氢氧化钡吸收液反应， 并生成碳酸钡沉淀。 C 9 . 5 . 2 再以酚酞作指示剂， 用0 . 0 5 mo l / L盐酸分别对与试验样品瓶、 阳性及阴性对照瓶连 通的氢氧化钡吸收液瓶内剩余氢氧化钡进行滴定， 并分别记录消耗盐酸的毫升数， 并换算成摩 尔数。其反应式如下: a ) B a ( O H ) 2 + C O 2 = B a C O 3 今+ 玩O b ) B a ( O H ) 2

29、 + 2 H C l = B a C 13 + 2 践O C1 0计算 (2)(3)(4) 按下式计算各瓶的二氧化碳释放量。 Q 二 B一H/ 2 0. 0 1 2 5 1 0 0 0 x 1 0 0 Q 卫 5 1 ( 1 ( 1 0 x V 式中Q 二氧化碳释放量， m01; B 起始氢氧化钡的量， m 0 1 ; H滴定剩余氢氧化钡所消耗盐酸的摩尔数， m o l ; V 滴定剩余氢氧化钡所消耗盐酸的毫升数. mL o C n结果判定 对四组的计算结果进行统计分析， 如试验组与对照组的结果具有显著差异， 则被检材料具 有生物降解性。 C 1 2 技术要点 C 1 2 . 1 配制试剂用水

30、必须是新煮沸冷却的去离子水。 C 1 2 . 2 培养时间不能过长， 否则吸收液中的氢氧化钡全部被二氧化碳消耗掉使溶液呈酸性， 而无法用草酸溶液回滴氢氧化钡样品溶液。 1 0 T B/ r 2 6 1 1 . 3 -1 9 9 9 C 1 2 . 3 吸取氢氧化钡上清液时， 切勿将溶液搞棍， 否则影响滴定结果的准确性。 C 1 2 . 4 所有试剂不得与空气接触， 容器需经氮气置换空气后方可使用。 T B/ T 2 6 1 1. 3 - 1 9 9 9 附录D ( 提示的附录) 试验结果报告单 试验结果报告单 编号 : 样品名称: 样品数量、 编号或批号: _ 采或送样单位: 送检项 目: 收样日期:年_ 月_ 日 制样方法及编号:_ _ 生产厂家: 采或送样人: 试验开始 日 期:_ _ _年_ 月日 试验方法标 准: 试验结果: 报 告 者: 技术负责: 报告单位: 技术审核: 主管领导: 报告日期:年_月_日