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1、Blipam 对缺血性脑损伤的保护作用 刘 荃1， 2， 王玉坤3， 董六一1， 方 明1， 陈志武1 2006 -03 -09 接收 作者单位： 安徽医科大学1药理学教研室， 3 公共课程部， 合肥 230032 2 安徽医科大学附属合肥市第一人民医院妇产科， 合肥 230061 作者简介： 刘 荃， 女， 36 岁， 硕士研究生， 副主任医师； 陈志武， 男， 42 岁， 教授， 博士生导师， 责任作者， E-mail： wzcxiong mail. hf. ah. cn 摘要 目的 研究 Blipam 对脑缺血损伤的保护作用。方法 采用小鼠断头法、 耐缺氧法观察 Blipam 对缺血性脑
2、损伤 的影响； 建立大鼠局灶性 （MCAO） 脑缺血模型， 观察 Blipam 对大鼠行为学、 脑梗塞重量的影响， 并测定缺血侧脑组织中 丙二醛（MDA） 、 一氧化氮 （NO） 含量及乳酸脱氢酶 （LDH） 活性。结果 Blipam 能显著延长小鼠断头后喘息持续时间 和耐缺氧时间； Blipam 减轻 MCAO 大鼠脑组织梗塞重量， 抑 制 MCAO 大鼠异常神经症状的产生， 同时降低脑组织中 MDA 含量， 提高脑组织中 NO 水平， 升高脑组织中 LDH 的活 性。结论 Blipam 对缺血缺氧性脑损伤具有显著保护作用， 其机理可能与提高脑组织中 NO 含量、 抑制脂质过氧化有 关。 主
3、题词 脑缺血/ 药物疗法； 丙二醛/ 分析； 一氧化氮/ 分析； 乳酸脱氢酶类/ 分析 自由词 Blipam 中图分类号 R 743. 31； R 916. 4； R 345. 41 文献标识码 A 文章编号 1000 -1492 （2006） 04 -0433 -03 脑血管疾病严重危害人类的健康， 其发病机制 错综复杂， 大量研究表明在缺血性脑损伤过程中， 主 要与氧自由基生成增加、 细胞内钙超载等密切相 关 1。Blipam 是一种新型细胞内钙拮抗剂， 目前还 未见对其保护缺血性脑损伤的研究报道， 本实验拟 采用小鼠急性脑缺血模型和大鼠局灶性脑缺血模 型， 初步探讨 Blipam 对缺血
4、性脑损伤的保护作用。 1 材料与方法 1. 1 材料 Blipam： 购自 Sigma 公司， 黄色粉末， 用 前以 DMSO 溶解配制； 尼莫地平注射液 （Nim） ： 由德 国拜耳公司生产 （拜耳医药保健有限公司分装） ， 批 号： BXNW831， 每瓶 50 ml， 含尼莫地平 10 mg； 氯化 硝基四氮唑兰 （NBT） ： 上海前进试剂厂出品， 批号： 980606； 乳酸脱氢酶 （LDH） 测定试剂盒： 南京建成 生物工程研究所出品， 批号： 20030514； 一氧化氮 （NO） 测定试剂盒： 南京建成生物工程研究所出品， 批号： 20030507； MDA 测定试剂盒： 南京
5、建成生物工 程研究所出品， 批号： 20030408； 756MC 紫外分光光 度计： 上海精密科学仪器有限公司产品； TGL-16H 高速离心机： 珠海黑马医学仪器有限公司产品； FA1004 天平： 上海精科天平厂。 1.2 动物 昆明种小鼠 （体重 18 22 g） 和 Wistar 大鼠 （体重 230 300 g） ， 安徽医科大学实验动物中 心提供 （普通级） ， 实验室饲养温度 （20 3） 。 1. 3 方法 1. 3. 1 小鼠断头致脑缺血模型 2 50 只小鼠随机 分成赋性剂对照组， Blipam 6、 3、 1. 5 mg/ kg 3 个剂量 组及阳性对照药 （Nim）
6、组， 共 5 组， 每组 10 只， !“ 各半。各组分别经小鼠尾静脉注射给予赋性剂 （等 量的 DMSO 溶液） 或相应药物 （10 l/ g） 10 min 后， 在小鼠二耳连线处快速断头， 记录各小鼠断头后张 口喘气动作的持续时间。 1.3. 2 小鼠氮气缺氧模型 50 只小鼠随机分为赋 性剂对照组， Blipam 6、 3、 1. 5 mg/ kg 3 个剂量组及 Nim 组， 共 5 组， 每组 10 只。各组分别经小鼠尾静 脉注射给予赋性剂或相应药物 （10 l/ g） 10 min 后 放进充有氮气的耐压磨口缸中， 每次 5 只， 每组各 1 只。继续冲入氮气 30 s 后， 记
7、录小鼠存活时间。 1. 3. 3 大鼠大脑中动脉结扎 （MCAO） 模型 3 取 Wistar 大鼠 （体重 230 300 g） 60 只， 随机分成假手 术组、 模型组、 Blipam 4. 8、 2. 4、 1. 2 mg/ kg 3 个剂量 组及 Nim 组， 共 6 组， 每组 10 只， !“各半。麻醉 后， 颈部正中切口， 分离并结扎右侧颈总动 脉 （CCA） ， 右侧位固定。在右耳和右眼外眦连线中点 切开皮肤， 于颧突头端 1 2 mm 处， 钻开一 3 mm2 的骨窗， 暴露大脑中动脉 （MCA） ， 灼断 MCA。假手 术组仅暴露右颈总动脉和大脑中动脉， 不结扎， 不灼 断
8、。受试药组于 MCA 灼断后 30 min 经大鼠尾静脉 注射给药 （2 ml/ kg） ， 12 h 再 iv 给药1 次。MCAO 大 鼠造模后 24 h 时观察动物出现的异常神经症状并 参照 Bedson 法进行评分 （A： 提尾， 如手术对侧前肢 出现腕屈、 肘屈曲、 肩内旋、 既有肘屈曲又有肩内旋 者， 分别记1、 2、 3、 4分； B： 置平面， 向手术对侧推阻 334安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 图 1 Bhpam 对 MCAO 致大鼠脑缺血损伤的影响 （n =10，$x s） A：
9、 梗塞脑组织重量百分比 （%） ； B： 异常的神经症状评分； 与假手术组比较： #P 0. 01； 与模型组比较：%P 0. 05，%P 0. 01 力下降者分别记 1、 2、 3 分； C： 双前肢置金属网上， 手术对侧肢张力下降者分别记 1、 2、 3 分； D： 转圈者 记 1 分） 。MCA 灼断后 48 h 时处死动物， 取出脑组 织， 小心剥去小脑、 嗅球等组织， 精确称取右侧大脑 半球后， 置 -20 冰箱内速冻 10 min 后取出， 然后 置于石英大鼠脑模中， 按石英脑模上刻度均匀切成 10 片， 将脑片置于 0. 2% NBT 中， 37温育 30 min， 未染成蓝色的
10、白色部分即为梗塞灶， 仔细挖取白色 梗塞组织并称其重量， 计算梗塞百分比 （梗塞百分 比 = 梗塞灶重量/ 右侧大脑半球重量 100%） 。另 取一批大鼠 （分组、 造模方法同上） ， 在 MCAO 48 h 后取脑皮质匀浆待用， 行 MDA 含量、 LDH 活性及 NO 含量的测定。 1. 4 数据处理 实验结果均以$x s 表示， 显著性 检验采用 ANOVA， Duncans test 进行分析处理。 2 结果 2. 1 Blipam 对小鼠断头后张口喘气时间的影响 结果见表 1。与赋性剂组相比， iv 6、 3、 1. 5 mg/ kg Blipam 可明显延长小鼠断头后张口喘气的时间
11、， 延 长百分率最大为 21. 64%， 疗效与 Nim 组相似。 表 1 Blipam 对小鼠断头后张口喘气时间的影响 （n =10，$x s） 组别 剂量 （mg/ kg） 张口喘气 时间 （s） 延长百分 率 （%） 赋性剂-18.95 1.44- Nim0.823.40 1.33%23.48 Blipam623.05 1.59%21.64 321.30 0.75%12.40 1.520.55 0.80%8.44 与赋性剂组比较： %P 0. 01 2. 2 Blipam 对小鼠缺氧耐受的影响 结果见表 2。 6、 3、 1. 5 mg/ kg Blipam 可明显延长小鼠在氮气中的 存
12、活时间， 大剂量组作用略优于 Nim 对照组。 表 2 Blipam 对小鼠耐缺氧实验的影响 （n =10，$x s） 组 别剂量 （mg/ kg）存活时间 （min）延长百分率 （%） 赋性剂-1. 97 1. 01- Nim0. 83. 94 1. 05%100 Blipam64. 07 1. 20%106. 6 33. 75 1. 21%90. 4 1. 53. 07 1. 10%55. 8 与赋性剂组比较： %P 0. 05，%P 0. 01 2. 3 Blipam 对 MCAO 大鼠脑缺血损伤的影响 2. 3. 1 Blipam 对 MCAO 大鼠脑梗塞组织重量和异 常神经症状的影响
13、 结果见图 1。MCA 可致使大鼠 脑梗塞发生， 与模型组比较， 4. 8、 2. 4、 1. 2 mg/ kg Blipam （iv） 均可降低脑梗塞组织重量百分比， 明显 抑制 MCAO 大鼠异常神经症状的产生， 并呈一定的 剂量依赖性； Nim 0. 6 mg/ kg 组作用与 Blipam 小剂 量组作用相当， 但不及 Blipam 大剂量组的效果。 2. 3. 2 Blipam 对 MCAO 大鼠脑组织中 LDH 活性、 NO 和 MDA 含量的影响 结果见表3。Blipam 4. 8、 表 3 Blipam 对 MCAO 大鼠脑组织中 LDH 活性、 NO 和 MDA 含量的影响
14、（n =10，$x s） 组 别 剂量 （mg/ kg） LDH 活性 （U/ g prot） NO 含量 （mol/ g prot） MDA 含量 （mol/ mg prot） 假手术-1186.0 217.72.45 0.582.36 0.70 模型-926.7 114.5&1.95 0.37&3.10 0.70& Nim0.61118.0 218.6%2.43 0.48%2.52 0.49% Blipam4.81148.0 190.3%2.35 0.32%1.85 0.64% 2.41125.0 206.6%2.81 0.89%2.24 0.89% 1.21087.1 192.9%2.2
15、1 0.822.36 0.57% 与假手术组比较： &P 0. 05，&P 0. 01； 与模型组比较：%P 0. 05， %P 0.01 434安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4） 2. 4、 1. 2 mg/ kg 可显著抑制 MCAO 大鼠缺血脑组织 中 LDH 活性的下降和 MDA 含量的升高。Blipam 4. 8、 2. 4 mg/ kg 还能显著抑制 MCAO 大鼠脑组织中 NO 含量的降低； Blipam 大剂量组与 Nim 组比较， 二 者对 LDH、 NO 的作用相当。各剂量 Blipa
16、m 均显著 抑制 MCAO 所致的 MDA 生成增加。 3 讨论 细胞内钙超载与自由基损害是缺血性脑损伤的 重要发病机制 4， 缺血后脑细胞通透性增高， 不仅 造成 LDH 外渗， 脑组织 LDH 活性下降， 而且 Ca2 +大 量内流， 形成胞内钙超载， 除直接损伤神经元外， 还 可通过激活一系列酶促反应， 促进自由基生成， 使膜 脂质发生过氧化损伤， MDA 含量增高。 本研究发现， 在小鼠脑缺血、 缺氧模型上， Bli- pam 可显著延长断头后小鼠张口喘气时间和耐缺氧 时间； 在大鼠 MCAO 模型上， Blipam 能显著减轻梗 塞的脑组织重量， 并呈一定的剂量依赖性， 同时能抑 制
17、 MCAO 大鼠异常神经症状的产生。另外， Blipam 能显著增加 MCAO 大鼠脑组织中 LDH 活性， 降低缺 血脑组织中 MDA 的含量， 提示 Blipam 对缺血后脂 质过氧化反应有抑制作用。NO 在一定范围内对脑 缺血可通过扩张脑血管， 增加脑血流量及抑制血小 板聚集和中性粒细胞黏附产生保护作用 5 -6， 本研 究发现，Blipam 能明显提高 MCAO 大鼠缺血脑组织 中 NO 水平， 提示 Blipam 的抗脑缺血作用可能与促 进 NO 生成有关。 参考文献 1 罗胜勇， 董六一， 陈志武， 等. 山茶花总黄酮对缺血性脑损伤的 保护作用 J . 中国临床药理学与治疗学， 2
18、004， 9 （10） ： 1157 - 9. 2 曾贵云， 徐 超. 小鼠脑缺血法 M / / 徐叔云， 卞如濂， 曾贵 云. 药理实验方法学. 2 版. 北京： 人民卫生出版社， 1991： 948. 3 曾贵云. 阻断大白鼠中脑动脉法 M / / 徐叔云， 卞如濂， 曾贵 云. 药理实验方法学. 2 版. 北京： 人民卫生出版社， 1991： 950. 4 Lesiuk H， Suther L G，Pelling J. Effect of 740067 on brain ische- mia in rats J . Stroke， 1991，（22） ： 896. 5 Samdani A
19、 F，Dawson T M， Dawson V L. Nitric oxide synthase in models of focal ischemia J . Stroke， 1997， 28 （6） ： 1283 -8. 6 高 杉， 董六一， 岑德意， 等. 黄蜀葵总黄酮对脑缺血损伤的保 护作用 J . 中国中医基础医学杂志， 2002， 8 （6） ： 19 -35. Protective effects of Blipam against cerebral ischemia-reperfusion injury Liu Quan， Wang Yukun， Dong Liuyi， et
20、 al （Dept of Pharmacology，Anhui Medical University， Hefei 230032） Abstract Objective To study the protective effects of Blipam against cerebral ischemia injury. Methods De- capitation method and close hypoxia method were used to observe the effect of Blipam against cerebral ischemia in- jury. The pe
21、rmanent occlusion of the proximal of the right middle cerebral artery （MCA）was used for making the focal cerebral ischemia models. The extent of neurological deficits was observed，and the infarct area was measured using NBT staining technique. The activity of LDH and the content of MDA and NO in the
22、 ischemic cerebral cortex were determined. Results Blipam prolonged the grasping time after decapitation and the survival time after anoxia in mice. Blipam significantly decreased the infarct weight and ameliorated neurologic deficits score of MCA occlu- sion rats. Blipam decreased MDA content and i
23、ncreased NO content and increased the activity of LDH of the ische- mic cerebral cortex. Conclusion Blipam has protective effects against cerebral ischemic injury， while it may be re- lated to increasing NO production and inhibiting free radicals of the ischemic cerebral cortex. MeSH cerebral ischemia/ drug threapy；malondialdehyde / analysis；nitric oxide/ analysis； lactate dehydrogena- ses/ analysis Free word Blipam 534安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006 Aug； 41 （4）