A放散型血型分子遗传结构的研究.pdf

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1、 论著 A 放散型血型分子遗传结构的研究 喻琼吴国光梁延连邓志辉苏宇清王大明 【摘要】 目的研究 A 放散型血型的分子生物学特性。方法对 5 例血清学定为 Ael 或 AelB 的个 体， 采用 4 对特异性引物进行 PCR 扩增后， 对其 ABO 基因的第 6、 7 外显子进行序列测定。且对其中 1 例表 型为 AelB 样本的 ABO 基因转录结构进行序列分析。结果1 例表型为 Ael 的样本含已报道的 Ael01 基因， 1 例表型为 Ael 的样本含 Ael05 基因， 2 例表型为 AelB 和 1 例表型为 Ael 的样本未测出任何 A 等位基因， 而 是含有 261G 缺乏的 O

2、01 或 O02 基因。结论A 放散型血型分子结构呈多样性， 含 261G 缺失的 O 等位基因 的样本有弱 A 抗原表达的机理有待说明。 【关键词】 ABO 血型； Ael 亚型； DNA 序列 Study on molecular genetic structure of Ael blood subgroup*YU Qiong，WU Guo-guang，LIANG Yan-lian， DENG Zhi-hui，SU Yu-qing，WANG Da-ming . （Shenzhen Blood Centre，Shenzhen Institute of Transfusion Medicine

3、， Shenzhen， Guangdong，518035 P . R . China . Email： yuqiong 7867yahoo . com） 【Abstract】ObjectiveTo study the ABO allele molecular characteristics of Ael blood subgroup. Methods Five individuals of diagnosed as Ael blood subgroup were subjected to PCR amplify ABO alleles using four pairs of se- quenc

4、e-specific primers. Exon 6 and exon 7 at ABO locus of all samples were sequenced. An individual with AelB phe- notype was chosen for further analysis of transcript structure of ABO gene. ResultsSequence analysis indicated one Ael phenotype sample with reported Ael01 allele，one Ael phenotype sample w

5、ith an Ael05 allele，and two AelB and one Ael individuals did not contain referred A allele，but contain O01 or O02 allele with 261G deletion. ConclusionMolecular bases for the Ael have highly polymorphism. The mechanism responsible for the express weak A antigen of O allele with 261G deletion awaits

6、to be elucidated. 【Key words】 ABO blood group； Ael subgroup； DNA sequence *Supported by the Research Fund of Guangdong Health Department（Proj. No.2001641）and the Research Fund of Shenzhen Bu- reau of Science & Technology（Proj. No.200304217） ABO 血型是临床上最为重要的血型系统， 它包括 有多种 A 或 B 的弱表现型。A 放散型 （Ael） 是一种较 为

7、罕见的 ABO 亚型， 其血清学特征是红细胞与单克 隆、 多克隆抗 A、 抗 A， B 血清试剂不发生反应， 使用检 验红细胞表面血型抗原最为敏感的方法 吸收放散 试验能够检测出其红细胞可以产生与 A1 细胞反应的 抗 A 放散液； 血清中含相应的抗 B 抗体， 偶尔血清中 含有抗 A 抗体， 唾液中只含 H 物质， 不含 A 物质。我 们把符合上述血清学特征的样本定为 Ael 亚型。 Ael 亚型的分子遗传结构研究， 在中国大陆、 中国 台湾、 国外等人群中均有报道 1-5。文献中已陆续报道 的 Ael 血型基因， 收录在血型抗原基因突变资料库中 （http： / / www.bioc.ae

8、com.yu.edu/ bgmut/ abo.htm） 。 我们在过去的 2 年中共收集 5 例 Ael 亚型标本， 除 1例标本外均出现异常的Ael分子生物学特性， 与 基金项目： 广东省医学科研基金课题 （2001641） ； 深圳市科技局资助 项目 （200304217） 作者单位：518035 深圳市血液中心深圳市输血医学研究所 以往研究者的结果不同， 现报告如下。 1对象与方法 1.1对象4 例为我中心健康汉族男性献血者， 1 例 为外单位送检的先天性房间隔缺损心脏病女性患者， 共计 5 例， 因正反定型不符的标本送检至我研究所。 1.2血型血清学检测血型正反定型， 吸收放散试 验，

9、 唾液物质测定均按文献方法操作 6。其中试剂单 克隆抗 A、 抗 B 血清 （BIOSCOT，Serological Ltd， UK） ， 人 源抗 A、 抗 AB 血清为本室自制， 抗 A1 血清 （Dominion， Canada） ， 抗 H 植物凝集素 （长春博德） ， 反定型红细胞 为自制。 1. 3PCR-序 列 特 异 性 引 物（ PCR-sequence specific primer，PCR-SSP） 基因分型， 采用 4 对序列特异性引 物， 见表 1， 其中 23s/2as 是检测 A 基因， 41s/46as 是检 测 A102 基因， 21s/33as 是针对核苷酸

10、 261 位的 G 缺 失， 检测 O1 基因， 27s/33as 是检测 B 基因。反应总体 积为 10L， 包括 100 ng 基因组 DNA， 10 PCR 缓冲液， 371中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 表 1 PCR-SSP 基因分型引物序列 Table 1Primer sequences of ABO genotyping by PCR-SSP method Name of primers （引物的名称） Primer sequences （5 3） （引物序列， 5

11、3） Products size （扩增产物片段， bp） 23sggaaggatgtcctcgtggtg 2astgaggatgtggatgttgaat75 41sacgtggctttcctgaagctg 46asgcggggcaccgcggcca107 21sggaaggatgtcctcgtggta 33ascttgatggcaaacacagttacc131 27scattgtctgggagggcacg93 Inner control sensen primer （内对照， s） tgccttcccaaccattcccctta Inner control antisensen primer

12、 （内对照， as） ccactcacggatttctgttgtgtttc434 每种 dNTP200mol/ L， 每条特异性引物 5 pmol， 内对照 引物每条 1.5 pmol， Taq 酶 0.3 U， 扩增采用热启动技 术即 94预温 2 min； 然后 94 10 s， 65 60 s， 进行 10 个循环， 94 20 s， 61 50 s， 72 30 s 进行 20 个循环； 72延伸 5 min。PCR 产物检测经 2.5%琼脂糖凝胶中 电泳 25 min， 紫外灯下检测、 记录结果。 1.4ABO 基因序列分析 1.4.1ABO 基因第 6、 第 7 外显子直接测序参照

13、 Olsson 等 7设计的 2 对引物， mo-46： 5-CGGAATTCAC- TCGCCACTGCCTGGGTCTC-3，mo-57： 5-CGGGATCCAT- GTGGGTGGCACCCTGCCA-3， 用于扩增第 6 外显子 252 bp 的片段。mo-71： 5-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3， mol-101： 5-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGC-AG-3， 用于扩增第 7 外显子 843 bp 的片段。PCR 反应体系包 括： 每种 dNTP 400mol/ L， Mg2 +2.5mol/ L， 10 PCR 缓冲液 5L， Taq 酶

14、3 U， 模板 DNA 500 ng， 引物 0. 1 mol/ L， 终反应体系 50L， 循环参数为： 95热启动 10 min， 94 60 s，63 90 s，72 60 s， 10 个循环， 94 60 s，61 90 s，72 60 s； 25 个循环， 72 10 min。扩 增产物经 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit （大连宝 生物公司） 纯化， 使用循环测序试剂盒 （The Big Dye Terminator Cycle sequencing Kit， 美国 ABI 公司） 直接测 序， 测序引物与本研究扩增 ABO 基因第 6、 7

15、 外显子的 引物序列相一致， 正、 反方向通测， 在 ABI 3100 DNA 测 序仪上检测、 SeqPOP6BDv 1 软件分析结果。 1.4.2使用单倍型特异性引物进行单倍型测序检 测含 261G 缺失的单倍型链的 297 位碱基序列为 G 还 是 A， 以此分析其等位基因的特异性， 使用表 1 中的 21s 引物对第 6 外显子的扩增产物进行测序分析。 1.5对其中 1 例表型为 Ael B 的 ABO 基因转录结构 分析使 用 TRIZOL R（Invitrogen） 试 剂 抽 提 血 液 总 RNA。按照文献 4， 8 设计方法， 使用引物 Aw92531 （TTGCGGACGC

16、TGGCCGGAAAACCAAA， 跨第 1 和 2 外 显子， 位于 ABOcDNA 的 13 至 38 位核苷酸） 和 Aw92532 （GACGGGGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAAC， 位 于 终 止 子密码子后的 99 位核苷酸） 经一步法逆转录-PCR （re- verse transcription PCR， RT-PCR） 试剂盒 （Qiagen） 合成 cDNA 的第 1 链与第 2 链。PCR 扩增产物经纯化使用 位于第 2 外显子中的引物 Aw92529 （CAAAATGCCACG- CACTTCGACCTATGTCC） 和位于第 7 外显子中第 1021 位

17、 的 引 物Aw92530（ GTTCTTGGGCACCGCAGTGAA- CCTCAGCT） 进行巢式 PCR 扩增。巢式 PCR 产物经胶 回收， 使用下列 4 条引物 Aw92529、 Aw92530、 Aw92533 （ TGTCCACGTCCACGCACACCAGGTAATCCA） 、Aw92534 （CGCTCGCAGAAGTCACTGATC） 在 ABI 3100DNA 测 序 仪上分别进行序列测定， 测得序列相互重叠， 得到第 2 7 外显子 cDNA 序列。 2结果 2.1血清学结果5 例血型及唾液血型物质检测结 果见表 2。根据血清学结果， 判定标本 1、 标本 2 为 A

18、elB， 标本 3、 4、 5 均为 Ael 型。血型结果见表 2。 2.2PCR-SSP 检测结果标本 1、 标本 2 定为 BO1 型， 标本 3 定为 O1O1 型， 标本 4、 5 定为 A102O1 型。 2.3ABO 基因序列分析以 A101 为参照序列， 直接 测序结果表明标本 1 含 IV6 + 5G， 有 1 条链 261 位缺失 表 2 被检标本血型血清学结果 Table 2The results of five samples detected by serological tests Samples （样本） Anti-A （抗 A） Anti-B （抗 B） Anti

19、-AB （抗 A + B） Anti-H （抗 H） Anti-A1 （抗 A1） Ac （Ac） Bc （Bc） Oc （Oc） Absorption- elution tests （吸收放散） Saliva substances （唾液物质） Serologic result （血型结果） 1-4 +4 +3 +-W + （IAT）B， HAelB 2-4 +4 +4 +-2 + （IAT）B， HAelB 3-4 +-4 +-+ （IAT）HAel 4-4 +-4 +-+ （N）HAel 5-4 +-W +4 +-+ （N）HAel IAT is shown as react in an

20、tihuman globulin media，and N is shown as react in saline media （IAT 表示在抗球蛋白介质中， N 表示在盐水介质中） ； W + is characterized by weak hemagglutination of RBCS respectively. + ，2 + ， 3 + ，4 + are shown degree of hemagglutination （W + 表示与红细胞反映呈弱凝集， 无凝集， 混合外观现象 . + ，2 + ，3 + ，4 + 表示凝集程度） 471中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第

21、23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 图 1 标本 2 使用 21as 引物进行序列测定的图谱 Fig.1Sequencing result of Sample 2 by sequcned using primer 21as G、 297G、 526C/ G、 646A/ T、 657T/ C、 681A/ G、 703A/ G、 771C/T、 796C/ A、 803G/ C、 829A/ G、 930A/ G、 1096A/ G； 标本 2 含 IV6 + 5G， 有 1 条链 261 位缺失 G、 297A/ G、 526

22、C/G、 657T/ C、 703A/ G、 796C/ A、 803G/ C、 930A/ G、 1096A/ G； 标本 3 含 IV6 + 5G， 两条链 261 位均缺失 G、 297A/ G、 681A/ G、 771C/ T、 829A/ G； 标本 4 含 IV6 + 5G， 有 1 条链 261G 缺失， 有 1 条链 804 位有 1 个 G 插入； 标本 5 含 467C T、 767T C2 个突变， 定为 Ael05 基 因， 另文有其家系的详细报道 9。 单倍型特异性引物进行序列测定结果， 标本 1 含 297G， 标本 2 含 297A， 标 本 3 含 297A/

23、 G， 标 本 4 含 297A， 标本 5 含 297A。标本 2 使用 21as 引物进行测序 的结果见图 1。综合上述结果可知， 标本 1 的基因型 为 B101/ O02， 标本 2 的基因型为 B101/ O01， 标本 3 的 基因型为 O01/ O02， 标本 4 的基因型为 Ael01/ O01， 标 本 5 的基因型为 Ael05/ O01。 2.4标本 1 的 ABO 基因的 cDNA 序列分析巢式 PCR 扩增后发现有一长一短的转录结构， 长片段 （1007 bp） 经序列分析是除去引物序列长度后 N 端缺少 64 个 碱基， C 端缺少 53 个碱基的 B101 基因，

24、 短片段 （872 bp） 是在前一条的基础上缺失了整个外显子 6 的其余 位点特异性为 B101 基因的序列， 没有发现 A 或 O 基 因的转录结构。 3讨论 国内外已报道的 Ael 基因分为 5 种类型， 与 A101 一致序列相比， Ael01 是在 798 至 804 位之间插入一个 G， 导致 Ael 基因 nt804 发生移码突变， 延长了 A 基因 阅读框架 1。Ael02 基因是多了 2 个错义突变 （467C T， 646T A） 与 1 个无义突变 （681G A） ， 导致 156 位 氨基酸由脯氨酸转变为亮氨酸， 216 位氨基酸由苯丙 氨酸转变为异亮氨酸 2。有意思

25、的是 Ael03 基因发生 的突变与 Ael01 突变的位置相同， 而与之相反的是缺 失了一个 G， 同样导致 Ael 的弱表现型 5。Ael04 是中 国台湾报道， 在 5 例 Ael 和 1 例 AelB 型的台湾个体中， 发现其 ABO 基因的第 6 内含子的第 5 个核苷酸由鸟 苷酸变为腺苷酸 （IV6 + 5G A） ， 形成缺乏完整的 A 转 录结构 4。浙江对一家系 2 例 Ael 型的分子生物学进 行分析 3， 是文献所报道的 Ax01 等位基因。 我们在中国汉族人中鉴定出 5 例 Ael 表型中， 只 有 1 例 Ael 表型的 ABO 血型基因结构是已被报道的 Ael01

26、型， 其余 4 例都出现了异常的 ABO 基因分子结 构， 呈现出高度的多态性。其中 1 例样本含有新的基 因， 已被命名为 Ael05。 由于 91%的 ABO 基因编码序列在第 6、 7 外显子 上， 我们的研究方法中， 对所有标本的 ABO 基因第 6、 7 外显子、 第 6 内含子的序列进行了分析。考虑到我们 的直接测序中只是检测第 6、 7 外显子， 于是我们应用 RT-PCR 方法对样本 ABO 基因的 cDNA 进行了研究， 它 包含了除第 1 外显子外的所有表达序列， 而且是由于 使用了处于第 1 外显子和第 2 外显子之间的引物成功 扩增， 这可以说明这段包括第 1 外显子碱

27、基的序列是 保守的， 没有异常。由于标本问题， 只检测了 1 例。在 这例样本中， 没有检测到 O 基因转录结构， 这与文献 10 报道的， 在 AO 或 BO 杂合基因型个体中， 其 O 基 因mRNA转录体的稳定性减弱甚至不表达相符； 在实验 结果中检测到了两条不同长度的序列， 可知短片段序 列缺失了整个第 6 外显子， 从文献 11 我们知道， 这种 转录结构改变了终止密码子位置， 导致不能产生有活 力的转移酶。 最近， Hosseini-Maaf 等 12与 Seltsam 等13分别报道 缺乏 261G 缺失的 O 基因 （主要是 O03 等位基因） 引起 了在细胞表面弱 A 表现型

28、， 通过细胞转染 O03mRNA， 表达出相应抗原， 发现均表现出 Ael 血清学的特性， 和 （或） 抑制抗 A 抗体的产生， 对此新发现， 作者的解释 是在有丝分裂期不同的 O 等位基因遗传物质交换导 致了一些细胞中转移酶活性的恢复。这在 ABO 基因 分子结构的研究中， 是一个突破， 第一次阐明了 O 基 571中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 因能够表达出 A 抗原。 在我们的研究中， 3 例 （其中 2 例 AelB， 1 例 Ael） 应 出现 A 基因， 但是没有 A

29、基因出现， 而是缺失核苷酸 261 位 G 的 O01 或 O02 基因， 这在以前的文献中都未 见报道。从理论上分析， 与 O03 等位基因不同的是， O01 或 O02 等位基因由于 261 位 G 缺失， 形成了一条 截短的无催化能力的肽链， 而前者是在 A101 一致序列 基础上有 4 个突变 （220C T， 297A G， 526C G， 802 G A） 而导致一条无催化功能的完整的肽链。中国汉 族人群的 A 放散型血型分子遗传结构具有多样性独 特性， 含有 nt261G 缺失的 O 基因的样本有弱 A 抗原表 达的机理有待积累标本进行深入的研究。 参考文献 1Olsson ML

30、，Hosseini-Maaf B，Chester MA. An Ael allelespecific nu- cleotide insertion at the blood group ABO locus and its detection using a se- quence-specific polypmerase chain reaction.Biochem Biophys Res Com- mun， 1995， 216:642-647. 2Ogasawara K， Yabe R， Uchikawa M， et al . Molecular genetic analysis of var

31、iant phenotypes of the ABO blood group system. Blood， 1996， 88:2732- 2337. 3Xu XG， He J， Hong SZ， et al . Molecular genetic analysis of Ael subgroup of the ABO blood group system. Chin J Blood Transfusion， 2003， 16 : 74- 77. 许先国， 何吉， 洪小珍， 等 .Ael 亚型的分子生物学研究 . 中国输 血杂志， 2002， 16:74-77. 4Sun CF，Yu LC，Ch

32、en IP，et al . Molecular genetic analysis for the Ael and A3 alleles. Transfusion， 2003， 43:1138-1144. 5Seltsam A，Hallensleben M，Kollmann A，et al . Systematic analysis of the ABO gene diversity within exon 6 and exon 7 by PCR screening reveals new ABO alleles. Transfusion， 2003， 43:428-439. 6Xiao XP.

33、 Transfusion Technology Manual. Beijing：People s Medical Pub- lishing House， 1995.494-505. 萧星莆 . 输血技术手册 . 北京： 人民卫 生出版社， 1995.494-505. 7Olsson ML，Chester MA. Polymorphisms at the ABO locus in subgroup A individuals. Transfusion，1996，36:309. 8Lin PH，Li L，Lin-Tsai SJ，et al . A unique 502C T mutation in

34、 exon 7 of ABO gene associated with the Bel phenotype in Taiwan. Transfusion， 2003， 43:1254-1259. 9Wu GG，Yu Q，Su YQ， et al . Novel ABO blood group allele with a 767 T C substitution in three generations of a Chinese family. Transfusion， 2005， 45:645-646. 10Keefe DS，Dobrovic A. Decreased stability of

35、 the O allele mRNA transcript of the ABO gene. Blood， 1996， 87:3061-3062. 11Yu LC，Twu YC，Chou ML，et al . Molecular genetic analysis for the B3 allele. Blood， 2002， 100:1490-1492. 12Hosseini-Maaf B， Irshaid NM， Hellberg A， et al .New and unusual O alleles at the ABO locus are implicated in unexpected

36、 blood group phenotypes. Transfusion， 2005， 45:70-81. 13Seltsam A， Gupta CD， Wagner FF， et al . Nondeletional ABO*O alleles express weak blood group A phenotypes. Transfusion， 2005， 45:359-365. （收稿日期： 2005-06-23） （本文编辑张丽玲） 病例报告 Wiskott-Aldrich 综合征一家系四例 徐迎军鹿子燕刘长云王立杰辛毅孙春燕 先证者 （2）男， 1 岁， 因反复消化道和皮肤自发出血

37、1 年余， 伴发热 7 天于 2004 年 4 月 5 日入院。患儿为第 2 胎， 足 月顺产。于生后 1 月余始反复鼻衄， 大便带血， 为鲜血。在当 地医院行血常规检查血小板为 7 109/ L。既往史： 生后 4 5 天时反复发作湿疹。查体： T37.3。精神不振， 面色苍白， 全 身散在暗红色出血点， 手背及足背见瘀斑。口唇微绀。眼部球 结膜充血， 双肺呼吸音粗。睾丸未降至阴囊。WBC 7.66 109/ L， Hb 83 g/ L， RBC 5. 41 1012/ L， MCV 58. 6 fl， MCHC 262 g/ L， MCH 15.3 pg。骨髓活检示： 增生性贫血； 巨核细

38、胞形成血小板 不良骨髓象。血常规： WBC 17.2 109/ L， RBC 5.52 1012/ L，Hb 88 g/ L， MCV 56.7 fl， MCHC 281 g/ L， MCH 15.9 pg，PLT 29 109/ L，MPV 6.2 fl： 血清 IgM 276 mg/ L （正常值 500 2600 mg/ L） ， IgG 16.2 g/ L （正常值 7 16.5 g/ L） 。诊断为湿疹血小板减少性免疫 缺陷综合征 （Wiskott-Aldrich syndrome， WAS） 。 家系调查：3生后 1 年反复肺部感染， 湿疹发作久治不 愈。1 岁半因消化道出血死亡。

39、4、 5在两岁左右因反复湿疹发 作， 肺部感染， 肠炎并消化道出血死亡。1、2、1 3未发现 异常，18 岁， 表型正常。家族系谱见图 1。 讨论湿疹血小板减少性免疫缺陷综合征是一种少见的 作者单位： 261041 山东省潍坊医学院附属医院儿科 （徐迎军、 刘长 云、 王立杰、 辛毅、 孙春燕） ； 山东省淄博市第一医院 （鹿子燕） 图 1 患者家系图 WASP 错义突变致 X-连锁隐性遗传性血小板减少性疾病， 男性 多发， 临床极为少见。主要表现：（1） 出血倾向；（2） 异位性湿 疹；（3） 反 复 感 染；（4） 血 小 板 明 显 减 少。前 3 项 为 Wiskott- Aldric

40、h 三联征， 临床表现中仅占 27%； 实验室检查： 血清 IgM 下 降， IgG 仅浓度降低或正常， 免疫学特点为 T 细胞缺陷。本家系 4 例患者均为男性，4 个病例临床表现均有出血和反复感染， 其 中消化道出血是4、 5的死亡病因。该家族中2、2可能为携 带者， 致4、 5和2、 5发病， 可以判断该家系符合 X-连锁隐性遗 传。本病目前尚无特效的治疗， 临床常用有效抗微生物制剂抗 感染， 脾切除， 干细胞移植等治疗。有报道骨髓或脐血干细胞 移植是目前根治 WAS 最有效的方法。 （收稿日期： 2005-05-18） （本文编辑张丽玲） 671中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2