CD34+细胞在急性心肌梗死周边区表达的研究.pdf

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1、1 4医药论坛杂志2 0 0 6 年 1 2月2 7卷2 3期 C D 3 4 + 细胞在急性心肌梗死周边区 表达的研究 郭素萍， 高传玉 ， 石海莉 郑州市中心医院心内科郑州市 4 5 0 0 0 7 摘要目 的 探讨动员骨髓干细 胞后C D 3 4 细胞在急性心肌梗死微环境周边区中的表达。 方法 制备 大鼠心肌梗死模型， 通过心肌病理组织学及免疫组织化学检测， 评价动员的骨髓干细胞对心肌梗死后2 4 h , 7 d 及 1 4 d 的治疗作用， 并对其机制进行探讨。结果 2 4 h 及7 d 动员 组检测C D 3 4 + 阳性心肌细胞( 个 / H P ) 与对照组相 比， 分别为( 2

2、 . 9 0 士 0 . 8 7比1 . 1 0士 0 . 8 8 ; 8 . 3 0 1 1 . 8 3比1 . 4 0 土 0 . 5 1 , P0 . 0 5 ) ， 且动员组C D 3 4 十 细胞数7 d与 2 4 h 比 较( 个 / H P ) ( 8 . 3 0 士 1 . 8 3 比2 . 9 0 上 0 . 8 7 , 尸 0 . 0 5 ) 明显增加; 7 d 时， 动员 组与对照组缺血周边区 均有B r - d U免疫阳性细胞， 与对照组比( 个 / H P ) , B r d U标记阳性细胞数明显增多( 7 . 9 0土 1 . 3 7比1 . 3 0 士 0 . 6

3、 7 , P 0 . 0 5 ) ; 1 4 d 时， 对照组可见大量心肌疲痕组织; 而动员组疲痕组织面积明显小于对照组， 部分血管壁上可见小核 深染的细胞附着， 并沿血管壁移行， 1 4 d 时C D 3 4 + 细胞均变为阴性反应。结论动员的骨髓干细胞对大鼠缺血 心肌有治疗作用， 其机制可能是在心肌微环境中， 动员的骨髓干细胞( 包括C D 3 4 + 细胞) 有向心肌细胞、 血管内 皮细胞分化的潜能。 关键词动员 骨 髓 干 细 胞; 心 肌 梗 死; 心 肌 再 生 中图分类号: R - 3 3 2文献标识码: A文章编号: 1 6 7 2 - 3 4 2 2 ( 2 0 0 6 )

4、2 3 - 0 0 1 4 - 0 3 C D 3 4 十C e l l s E x p r e s s i o n Mo b i li z a t i o n o n Ra t Ac u t e o f B o n e Ma r r o w S t e m Ce l l s My o c a r d i a l I n f a r c t i o n Ma r g i n G U O S u p i n g ， G A O C h u a n y u ， S H I H a i l i D e p a r t m e n t o f C a r d o l o g y , Z h e n g

5、 z h o u C i t y C e n t e r H o s p i t a l ， Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 7 ， C h i n a A B S T R A C T O b j e c t i v e T o e v a l u a t e C D 3 4 十 c e l l s e x p r e s s i o n o f b o n e m a r r o w s t e m c e l l s m o b i l i - z a t i o n o n i s c h e m i c m y o c a r d i u m r e g i o

6、 n i n r a t s . Me t h o d s A f t e r i n f a r c t i o n c r e a t i o n ， t h e r a t s w e r e r a n - d o m l y d i v i d e d i n t o m o b i l i z a t i o n g r o u p a n d c o n t r o l o n e . T h e s e r a t s w e r e e x e c u t e d r e s p e c t i v e l y a t 2 4 h , 7 d a n d 1 4 d . H

7、e a r t s w e r e e x t r a c t e d t o p r o c e s s i m m u n h i s t o c h e m i c a l e x a m i n a t i o n s a n d p a t h o l o g y e x a m i n a - t i o n s . R e s u l t s A t 2 4 h a n d 7 d ， t o c o m p a r e w i t h c o n t r o l g r o u p ， t h e n u m b e r o f C D 3 4 + p o s i t i v

8、e c e l l s i n m o b i l i z a t i o n g r o u p w a s r e s p e c t i v e l y d i f f e r e n t ( 2 . 9 0 土 0 . 8 7 v s l . 1 0 土 0 . 8 8 ， 8 . 3 0 士 1 . 8 3 v s l . 4 0 土 0 . 5 1 ， P0 . 0 5 ) . T h e n u m b e r o f C D 3 4 + p o s t i v e c e l l s ( 8 . 3 0士 1 . 8 3 v s 2 . 9 0 1 0 . 8 7 ， P0 .

9、 0 5 ) ( c e l l s / H P ) i n m o b i l i z a t i o n g r o u p w a s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n 7 d a n d 2 4 h . T h e n u m b e r B r d U p o s i t i v e c e l l s ( 1 . 3 0 士 0 . 6 7 v s 7 . 9 0 1 1 . 3 7 ， P 0 . 0 5 ) ( c e l l s / H P ) w a s m u c h l e s s a t 2

10、 4 h t h a n m o b i l i - z a t i o n g r o u p a t 7 d . A t 1 4 d t h e a n t i g e n o f C D 3 4 + b e c a m e n e g a t i v e e x p r e s s b e t w e e n m o b i l i z a t i o n g r o u p a n d c o n t r o l g r o u p . C o n c l u s i o n M o b i l i z a t i o n b o n e m a r r o w s t e m c e

11、 l l s c o u l d t r e a t i s c h e m i c m y o c a r d i - u m b y d i f f e r e n t i a t i n g i n t o v i a b l e c a r d i o m y o c y t e s o r v a s c u l a r e n d o t h e l i a l a t i s c h e m i c m y o c a r d i u m z o n e s . K E Y WO R D S M o b i l i z a t i o n b o n e m a r r o w

12、s t e m c e l l s ; M y o c a r d i a l i n f a r c t i o n ; R e g e n e r a t i o n o f m y o c a r d i u m 急性心肌梗死( A M I ) 后骨髓干细胞能自 行迁 t 河南省人民医院心内科郑州市4 5 0 0 0 3 移到心肌坏死部位， 在心肌微环境中横向分化为 心肌细胞、 血管内 皮细胞和平滑肌细胞， 再生新的 心肌组织， 修复梗死的心肌， 改善心功能。但一般 J o u rna l o f Me d i c a l F o r u m V o l . 2 7 N o . 2 3

13、D e c e m b e r 2 0 0 6 情况下进人到外周血循环中并迁移到心肌梗死区 域的骨髓干细胞数量极少， 对坏死心肌组织的修 复作用极为有限。因此， 如采用骨髓干细胞动员 剂将骨髓干细胞驱赶至外周血， 极大地增加外周 血干细胞数量， 则有可能促进心肌组织的修复。 粒细 胞集落刺激因 子( G r a n u lo c y te c o lo n y s ti m u la - t i n g f a c t o r , G 一 C S F ) 是骨髓干细胞的强力动员剂， 可使外周血中干细胞较正常增高数十倍甚至数百 倍， 因此， 用G - C S F 动员自 体骨髓干细胞后， 这些

14、干细胞可能迁移至心肌梗死区并进一步分化， 增 加梗死区内有功能的心肌细胞数量及形成新生血 管， 从结构和功能上修复梗死心肌组织。 1 材料与方法 1 . 1 实验材料雄性W i s t a r 大鼠6 0 只， 体重2 5 0 - 3 0 0 g ， 购自 郑州大学医学院动物中心( 医动字第 1 0 1 1 6 号) 。粒细胞集落刺激因子( G一 C S F ， 商品 名赛格力) ， 购自 上海三维生物技术有限公司。兔 抗大鼠C D 3 4 + I g G ( H一 1 4 0 ) ; s e 一 9 0 9 5 型单克隆 抗体和即用型S A B C 试剂盒购于S a n t a C r u

15、z 公司。 5 一 澳脱氧尿嚓陡( B r d U ) ， 抗鼠尿嗜陡脱氧核昔单 克隆抗体， 购于武汉博士德生物科技有限公司。 H M I S 一 2 0 0 0 高清晰度彩色医学图文分析系统( 日 本) 。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 大鼠心肌梗死模型的建立雄性 Wi s t a r 大鼠6 0只， 1 0 %水合氯醛麻醉后接呼吸机。于第 四肋间处开胸后打开心包， 暴露心脏， 在肺动脉与 左心耳之间结扎冠状动脉左前降支根部， 肌内注 射庆大霉素3 d 以预防感染。 1 . 2 . 2 动物分组 2 4 h 实验: 随机分为对照组 ( n = 1 0 ， 给予生理盐水0 . 5

16、m l ) ， 动员组( n二 1 0 , 1 0 0 R 岁k 岁d ) ， 心肌梗死模型成功l h 后皮下给G 一 C S F 1 次， 2 4 h 后处死动物， 观测结果。2Z7 d 实 验: 随机分为对照组 ( n = 1 0 ， 给予生理盐水 0 . 5 m 1 ) ， 动员组仁 ( n = 1 0 , 1 0 0 t ,岁( k g d ) 。心 肌梗死模型成功 l h后在动员组皮下给药， 连续 5 d ， 所有实验动物均在前一天腹腔内注射B r d U l o o m 留( k g d ) ， 连用7 d 后处死动物， 观测结果。 1 4 d 实 验: 随机分为对照组( n= 1

17、 0 ， 给予生理 盐水0 . 5 m l ) ， 动员组( n = 1 0 , 1 0 0 L 岁( k g “ d ) . 心肌梗死模型成功l h 后在动员组皮下给药， 连续 5 d , 1 4 d 后处 死动物， 观 测 结 果。 1 . 3 C D 3 4 十 细胞和B r d U标记阳性细胞计数 在大鼠心肌梗死模型后2 4 h , 7 d 和1 4 d 后分别先后 各处死大鼠1 0 只， 沿心脏长轴切成两半制成病理 切片， 在4 0 0 倍光学显微镜下， 随机取6 个高倍视 野， 取其平均值， 分别计算每个高倍视野C D 3 4 + 阳 性细胞数和B r d U标记细胞数。 1 .

18、4 对照标本染色用0 . 0 1 m o l / L P B S 液替代 一抗孵育已知的阳性样本， 过程同上， 结果呈阴 性。 1 . 5 结果的判断C D 3 4 + 阳性着色均表现为胞 浆染成棕色或棕黄色， B r d U标记阳性细胞着色为 胞核染成棕色或棕褐色。 1 . 6 统计学处理实验数据用 t 检验， 采用 S P S S 1 0 . 0 软件进行统计学处理， 数据以均数土 标 准差 标 土 、 ) 表示， 显著性水准为双侧a = 0 . 0 5 2 . 1 结果 2 4 h 动员组大鼠心肌梗死边缘区免疫组化 检测均呈C D 3 4 十 阳性; 而对照组心肌梗死边缘区 有少数C D

19、 3 4阳 性单个核细胞浸润生长， C D 3 4 十 细 胞计数动员组与对照组相比 有显著性差异( 2 . 9 0 士 0 . 8 7 v s 1 . 1 0 士 0 . 8 8 , P0 . 0 5 ) ( 个/ H P ) ， 见表 1 。 2 . 2 7 d 对照组心肌梗死灶有少量C D 3 4 + 细胞; 动员组可见较多C D 3 4 阳 性心肌细胞， 动员组与对 照组C D 3 4 十 细胞计数有差异( 8 . 3 0 土 1 . 8 3 v s 1 . 4 0 士 0 . 5 1 , P0 . 0 5 ) ( 个/ H P ) ; 且动员组 C D 3 4 + 细 胞 数7 d

20、与2 4 h 比 较( 8 . 3 0 士 1 . 8 3 v s 2 . 9 0 士 0 . 8 7 , P0 . 0 5 ) ( 个 / H P ) 也明显增多; 动员组与对照组 缺血周边区均有B r d U免疫阳性细胞， 与对照组相 比( 7 . 9 0士1 . 3 7 v s 1 . 3 0士0 . 6 7 , P 0 . 0 5 ) ( 个/ H P ) 明显增多， 见表t o 表 1 心肌梗死后 C D 3 4 + 及 B r d u 标记阳性 细胞计数/ ( 无士 ， 心梗后 2 4 h心梗后7 d 组别 C D3 4+C D 3 4+ 对照组 动员组 1 0 1 0 1 . 1

21、 0土0 . 8 8 2 . 9 0 1 0 . 8 7 . 1 . 4 0土0 . 5 1 8 . 3 0土1 . 8 3 * # 1 . 3 0 10 . 6 7 7 . 9 011 . 3 7* 注: 与对照组比较， 动员组2 4 h , 7 d C D 3 4 + 细胞数和7 d B r d U标记阳性 细胞计数， p 0 . 0 5 ， 动员组C D 3 4 + 细胞数7 d 与2 4 h 比 较毕 0 . 0 5 0 2 . 3 1 4 d 对照组可见较大量心肌瘫痕组织， 主 要分布于左室心内膜下层心肌， 呈散在片状分布， 缺血心肌细胞发生玻璃样变性， 融合成片， 心肌组 织排列有

22、序的基本结构被破坏而成瘫痕化; 而动 员组癖痕组织面积明显小于对照组， 并且可见核 大、 胞浆丰富、 深染的心肌细胞， 其缺血心肌的基 I 6 医药论坛杂志2 0 0 6 年 1 2月第2 7 卷第2 3 期 本结构得到保护， 组织结构排列基本处于有序状 态。部分血管壁上可见小核深染的细胞附着， 并 沿血管壁移行。两者均未见 C D 3 4 + 阳性心肌细 胞。 3 讨论 成熟的心肌细胞再生能力很有限， 心肌梗死 后心肌细胞数量减少、 疤痕形成、 左心室重构， 最 终导致顽固性心力衰竭。骨髓干细胞( B o n e M a r - r o w S t e m C e l l , B M S C

23、 ) 具有自 我更新和分化潜能的 细 胞群 体 一 ， 大 量实 验 结 果 证实 4 一 7 骨 髓干 细 胞 在特定环境中 能被诱导分化为心肌细胞和血管内 皮细胞， 从而修复损伤坏死心肌， 形成新生血管， 改善心功能。 S h i n t a n i 等 s 发现， 急 性心肌梗死患者外周血 C D 3 4 + 阳性的骨髓单核细胞和骨髓成血管细胞升 高， 其峰值出现在心肌梗死后第7 d 。本实验也有 类似发现， 提示急性心肌梗死后存在外周血干细 胞增加， 即急性心肌梗死本身存在骨髓动员作用。 缺血时骨髓干细胞自我动员， 可能是机体对缺血 后组织血管再生的一个自 我修复功能， 其机制可 能是

24、缺血后局部分泌某些细胞因子( 粒细胞集落 刺激因子、 内皮细胞生长因子等) 所造成。然而这 种自 我修复的作用较弱。因此， 本实验采用骨髓 干细胞动员剂 G一 C S F 将骨髓干细胞“ 驱赶” 到外 周血， 增加外周血干细胞数量， 促进心肌组织的修 复。 本研究用r h G一 C S F 动员急性心肌梗死大鼠 的自 体骨髓干细胞， 发现在心梗区7 d 的C D 3 4 + 细 胞明显高于2 4 h ( P0 . 0 5 ) ; 在2 4 h , 7 d 动员组大 鼠心肌坏死灶中有单个核细胞浸润， 免疫组化检 测发现有大量的C D 3 4 + , B r d U 阳性细胞， 考虑为骨 髓来源的

25、干细胞( 包括造血干细胞、 内皮干细胞 等) ; 与此同时， 还发现有与浸润的单个核细胞的 胞核相似， 但较大而圆， 位于细胞中央， 胞浆少而 深染的细胞生长， 其免疫组化检测也有C D 3 4 + , B r d U 阳性细胞， 推测可能是浸润的骨髓干细胞正 向心肌细胞分化的早期细胞， 故形态较幼稚。因 此， 本研究证明了心肌梗死发生后， 在骨髓动员剂 作用下， 骨髓午细 胞能向心肌坏死区域内 迁移、 存 活， 并向心肌细胞分化。由于C D 3 4 抗原在造血干 细胞膜上的表达随细胞分化程度增高而减弱， 因 此可能1 4 d 后， 由于细胞进一步发育成熟， 其表面 具有造血干细胞特征的 C

26、D 3 4抗原呈阴性反应。 B r d U能够替代胸腺嚓陡进人合成期的D N A ， 可用 来标记处于分裂期的细胞。本实验在梗死的边缘 区域观察到了B r d U和 C D 3 4 十 阳性细胞。说明表 达C D 3 4 + 细胞有一部分为分裂期细胞。 有 研 究9 证实， G 一 C S F 具 有同 时 动 员骨 髓造 血干细胞、 间质干细胞及内皮干细胞的能力。因 此， 骨髓动员后， 骨髓的多种干细胞均可能参与心 肌再生， 在损伤心肌中， 心肌细胞、 血管内皮细胞 和平滑肌细胞均有再生， 可全面修复损伤心肌， 而 且已 有 研究 4 表明， 骨髓干细胞分化来的心肌细 胞能与周围宿主心肌细胞

27、形成有效的电一 机械祸 联， 从而实现心肌在结构和功能上的整合。这可 能是本研究中动员组心功能改善的一个原因。该 方法操作方便， 创伤小， 易推广， 但对整体心功能 的改善程度及其机制仍需进一步探讨。 参考文献 1 B l a u H M， B r a z e l t o n T R , We i m a n n J M . T h e e v o l v i n g c o n - c e p t o f a s t e m c e l l : e n t i t y o r f u n c t i o n J ?C e l l , 2 0 0 1 ， 1 0 5 ( 7 ) : 8 2 9

28、 - 8 4 1 2 K r a u s e D S , T h e i s e N D , C o l l e c t o r M I , e t a l . M u l t i 一。 r g a n , m u l t i 一 l i n e a g e e n g r a f t m e n t b y a s i n g l e b o n e m a r r o w一 d e - r i v e d s t e m c e l l 仁 J . C e l l , 2 0 0 1 ， 1 0 5 ( 3 ) : 3 6 9 - 3 7 7 3 G o o d e l l M A . J

29、 a c k s o n K A , M a j k a S M， e t a l . S t e ll c e l l p l a s - t i c i t y i n m u s c l e a n d b o n e m a r r o w J . A n n N y A c a d S c i , 2 0 0 1 , 9 3 8 : 2 0 8 一1 8 4 O r l i c D , K a j s t u r a J , C h i m e n t i S , e t a l . B o n e m a r r o w c e l l s r e g e n e r a t e

30、i n f r a c t e d m y o c a r d i u m J . N a t u r e , 2 0 0 1 ， 4 1 0 ( 6 8 2 9 ) : 7 0 1 - 7 0 5 5 O r l i c D , K a j s t u r a J , C h i m e n t i S , e t a l . M o b i l i z e d b o n e m a r - r o w c e l l s r e p a i r t h e i n f r a c t e d h e a r t , i m p r o v i n g f u n c t i o n a

31、n d s u r v i v a l J . P r o c N a t l A c a d S c i U s a , 2 0 0 1 ， 9 8 ( 1 8 ) : 1 3 4 4 - 1 3 4 9 6 K o c h e r A A , S c h u s t e r M D . S z a b o l c s M J , e t a l . N e o v a s c u l a r - i z a t i o n o f i s c h e m i c m y o c a r d i u m b y h u m a n b o n e 一 m a r r o w- d e r i

32、 v e d a n g i o b l a s t s p r e v e n t s c a r d i o m y o c y t e a p o p t o s i s r e - d u c e s r e m o d e l i n g a n d i m p r o v e s c a r d i a c f u n c t i o n J . N a t M e d , 2 0 0 1 , 7 ( 4 ) : 4 3 0 -4 3 6 7 T o m i t a S , M i c k l e D A , We a s e l R D , e t a l . I m p r o

33、 v e d h e a r t f u n c t i o n w i t h m y o g e n e s i s a n d a n g i o g e n e s i s a f t e r a u t o l o g o u s p o r c i n e b o n e m a r r o w s t r o m a l c e l l t r a n s p l a n t a t i o n J 。 J T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g , 2 0 0 2 ， 1 2 3 ( 6 ) : 1 1 3 2 - 1 1 3 5 8 S

34、 h i n t a n i S , M u r o h a r a T , I k e d a H , e t a l . M o b i l i z a t i o n o f e n - d o t h e l i a l p r e g e n i t o r c e l l s i n p a t i e n t s w i t h a c u t e m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n J . C i r c u l a t i o n , 2 0 0 1 , 1 0 3 ( 2 3 ) : 2 7 7 6 - 2 7 7 9 9 M a k i n o S , F u k u d a K , M i y o s k i S , e t a l . C a r d i o m y o c y t e s c a n b e g e n e r a t e d f r o m m a r r o w s t r o m a l c e ll s i n v i t r o J . J C l i n I n v e s t , 1 9 9 9 , 1 0 3 ( 5 ) ; 6 9 7 - 7 0 5 2 0 0 6 -0 9 - 1 0 收稿