CD4 CD25调节性T细胞在HIVAIDS患者中的作用及其与HIV病毒载量的相关性研究.pdf

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1、中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年 1 2 月第 2 0 卷第4 期C h i n e s e J E x p C l i n V i r o l , D e c e m b e r 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 4 . 论 著 C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T 细胞在 H I V / A I D S 患者 中的作用及其与 H I V病毒载量的相关性研究 刘水腾杨桂林姚红艳李美忠徐六妹李丽雄王火生周伯平 摘要 目的研究 H I V感染者/ A I D S 患者外周血 C D 4 C D 2 5 十 调节性 T细胞( C D 4 C D 2 5 r

2、 e g u l a t o ry T c e l l , T r e g ) 频率、 功能及其临床意义。 方法 选择3 1 例H I V 感染者/ A I D S 患者和3 0 例健康 对照者， 采用流式细胞仪检测各组外周血T r e g 的表型和频率。采取M A C S 磁珠分选C D 4 C D 2 5 十 T 细 胞， 利用 H 胸腺09陡掺人法检测C D 4 C D 2 5 T 细胞在特异性H I V 抗原刺激下对C D 4 C D 2 5 一 T 细胞 的增殖影响。结果H I V / A I D S 患者组与正常对照组相比较， 外周血C D 4 十 C D 2 5 十 T 细胞频率

3、在统计学 上差异无统计学意义。与正常对照组比较， H I V感染者外周血C D 4 C D 2 5 T 细胞频率升高， 差异有统 计学意义( 尸 0 . 0 1 ) ; 与正常对照组比较， A I D S 患者者外周血 C D 4 C D 2 5 十 T细胞频率降低， 差异有统 计学意义( P 0 . 0 0 0 1 ) . H I V R N A病毒载量与患者外周血 C D 4 C D 2 5 T细胞数量呈正相关性( P 0 . 0 1 ) . C D 4 十 C D 2 5 十 T 细胞具有抑制 H I V特异性的C D 4 C D 2 5 - T 细胞的增殖作用。结论H I V感染 者/

4、 A I D S 患者的细胞免疫功能紊乱， C D 4 十 C D 2 5 十 T 细胞能抑制 H I V感染者/ A I D S 患者的H I V特异性细 胞免疫反应， 促进 H I V病毒复制， 与形成持续 H I V感染有关。 【 主题词】 H I V ; T 淋巴细胞; 流式细胞术; R N A R o l e o f C D 4 今 C D 2 5 十re g u l a t o r y T c e l l i n H I V i n f e c ti o n / A I D S a n d t h e c o r re l a t i o n b e t w e e n C D 4

5、 十 C D 2 5 十 r e g u l a t o r y T c e l l a n d H I V v i r a l l o a d L I U S h u i- t e n g ， Y A N G G u i- l i n ， Y A O H o n g - y a n ， L I M e ir z h o n g ， X U L i u , n te i ， L I L i- x i o n g ， W A N G H u o- s h e n g ， Z H O U B o- p i n g . S h e n z h e n D o n g h u H o sp i t a

6、 l ， S h e n z h e n 5 1 8 0 2 0 , C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r : L I U S h u i - te n g ， E - m a i l : l i u s t 6 2 y a h o o . c o m. c n A b s t r a c t O b j e c ti v e T o s tu d y o f th e f r e q u e n c y , p h e n o t y p e , f u n c t io n a n d c l i n ic a l s i g n

7、if ic a n c e o f C D 4 C D 2 5 十 r e g u l a to r y T c e ll ( T r e g ) i n p e r ip h e r a l b lo o d f ro m p a t ie n t s w it h H I V in f e c ti o n / A I D S . M e t h o d s T h i r ty - o n e p a t i e n t s w i t h h u m a n i m m u n o d e f i c i e n c y v i ru s ( H I V ) i n f e c t i

8、 o n / a c q u i r e d i m m u n o d e f i c i e n c y s y n d ro m e ( A I D S ) a n d 3 0 n o r m a l s u b j e c t s( N S ) w e r e e n ro l l e d i n t h i s s t u d y . T h e f r e q u e n c y a n d p h e n o t y p e o f C D 4 十 C D 2 5 T c e l l s i n p e r i p h e r a l b l o o d o f t h e p

9、a t i e n t s a n d n o r m a l s u b j e c t s w e r e d e t e c t e d b y fl o w c y t o m e t ry. C D 4 C D 2 5 T c e l l s w e re i s o l a t e d b y m a g n e t i c a c t i v a t e d c e l l s o r t e r ( M A C S ) a s s a y , a n d t h e e ff e c t o f C D 4 十 C D 2 5 T c e l l s o n C D 4 C D

10、 2 5 - T c e ll p ro l if e r a ti o n a f t e r H I V a n t i g e n s t i m u l a t i o n b y 仁 H th y m i d i n e i n c o r p o r a ti o n w a s in v e s t ig a te d . R e s u l t s T h e p r o p o r t i o n o f C D 4 C D 2 5 T c e l l s i n p e r i p h e r a l b l o o d f r o m p a t i e n t s w

11、i t h H I V i n f e c t i o n / A I D S h a d n o s i g n i f i c a n t d i ff e r e n c e c o m p a r e d w i t h N S . T h e p r o p o r t i o n o f C D 4 C D 2 5 T c e l l s i n p e r i p h e r a l b l o o d f ro m p a t i e n t s w i t h H I V i n f e c t io n w e re s ig n if ic a n tl y i n c

12、re a s e d c o m p a r e d w i th N S ( P 0 . 0 1 ) . B u t th e T re g in p e r i p h e r a l b lo o d f r o m p a ti e n t s w i t h A I D S w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n c o n t r a s t t o N S ( P 0 . 0 0 0 1 )T h e s e w a s a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e

13、t w e e n H B V D N A v i r a l l o a d a n d T r e g f r e q u e n c y . T r e g c o u l d s p e c i f i c a l l y i n h i b i t t h e p r o l if e r a t i o n o f C D 4 C D 2 5 T c e l l . C o n c l u s i o n s T h e c e l l - m e d i a t e d i m m u n e f u n c t i o n o f p a t i e n t s w i t h

14、 H I V i n f e c t i o n / A I D S w a s d i s o r d e r e d . C D 4 C D 2 5 十T c e l l s c o u l d s p e c i a l l y i n h i b i t c e l l - m e d i a t e d i m m u n e r e s p o n s e a n d a g g r a v a t e H I V r e p l i c a t i o n a n d c o n t r ib u t e t o p e r s i s t e n t H I V i n f e

15、 c t i o n . K e y w o r d s H I V ; T - L y m p h o c y t e s ; F lo w c y to m e t ry ; R N A 有关T r e g 细胞在慢性H I V感染/ A I D S 的中的作 用和意义， 目 前国内无相关文章报道。对我院2 0 0 4 年 1 0 月至2 0 0 5 年5 月在我院门诊和住院以及深圳 市戒毒所、 广东省中山市戒毒所住院的3 1 例H I V 感 染者/ A I D S 患者的C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T细胞表型、 频率和功能以及与 H I V R N A病毒载量的相关性进

16、 行了调查， 现报道如下。 作者单位: 5 1 8 0 2 0 深圳， 深圳市东湖医院 通讯作者: 刘水腾， E - m a i l : li u s t 6 2 y a h o o . c o m . c n 中华实验和临床病毒学杂志2 0 0 6 年1 2 月第2 0 卷第4 期 C h i n e s e J E x p C l i n V ir o l , D e c e m b e r 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 4 1 对象与方法 1 . 1 病例选择和一般资料3 1 例 H N感染者/ A I D S 患者中 H I V感染者 1 6 例， A I D

17、 S 患者 1 5 例， 男性2 7 例， 女性 1 5 例， 平均年龄3 2 . 5 岁， 范围1 9 - 6 0 岁， 中 位数3 1 岁。静脉注射毒品途径传播2 4 例， 性传播7 例( 同性恋 1 例) ， 输血传播 1 例。正常健康对照3 0 例， 男性 1 6 例， 女性 1 4例; 年龄2 8 . 8岁， 范围2 2 - 5 5 岁， 中位数 2 8 岁。H I V感染者/ A I D S 患者的人选 标准: 所有患者经艾滋病初筛实验检测抗 H I V阳 性， 并经 W e s t e rn B l o t 试验证实， H I V感染者/ 艾滋病 患者的诊断标准符合 1 9 9

18、3 美国 C D C制订的诊断标 准。排除标准: 合并乙肝或丙肝， 半年内或正在接受 H A A R T 治疗的患者， 合并自 身免疫性疾病。 1 . 2 流式细胞术检测 C D 4 C D 2 5 十T细胞的表型 和比例所有对象都抽取外周抗凝血 5 - 1 0 m 1 ， 密 度梯度离心法分离外周血单个核淋巴细胞， 每管 1 x 1 0 6 细胞， 每管加人2 P l 人的C D 4 , C D 2 5 单克隆 抗 体， 并加人同型对照抗体， 4 一 8 避光孵育 3 0 m i n , 用P B S 洗2 遍， 加4 0 0 川P B S 重悬细胞， 上机检测。 流式细胞仪为美国 B e

19、c k m a n C o u l t e r 公司产品， 单克 隆抗体为 B D公司试剂盒。 1 . 3 H I V R N A病毒载f的检测收集 H I V / A I D S 患者的血浆， 一 8 0 冻存， 待标本收集完成后一并检 测H I V R N A 定量， 所用仪器为罗氏L i g h t C y c l e r P C R 荧光定量括增仪， H I V R N A定量试剂盒为深圳匹基 公司产品， 按照标准操作手册检测。 1 . 4 C D 4 C D 2 5 调节性T细胞抑制试验在体 外， 通过增殖实验和 3 H 工 T d R掺人法检测 C D 4 C D 2 5 + 调节

20、性T细胞对 C D 4 C D 2 5 一 T细胞增殖能力 的影响和剂量依赖关系。选择 3 例 H I V感染者， 分 离外周血 P B M C ， 通过 M A C S 分选出 C D 4 C D 2 5 T 细胞和 C D 4 C D 2 5 - T细胞， 分别按三复孔仅加人 C D 4 C D 2 5 十T细胞， 另三复孔按 C D 4 C D 2 5 T细 胞/ C D 4 C D 2 5 一 T 细胞= 1 : 1 加人， 此外三复孔仅加 C D 4 十 C D 2 5 - T细胞， 即去除 C D 4 C D 2 5 十T细胞。 C D 4 C D 2 5 十 T 细胞和C D 4

21、 十 C D 2 5 一T 细胞的数量分 别为每孔1 x 1 了 。 在培养板中加人H I V - 1 G a g P 2 4 , H I V - 1 S F 2 p 5 5 G a g 作为抗原刺激物， 浓度3 f ig / m l , 分离的 C D 4 + C D 2 5 T细胞和 C D 4 十 C D 2 5 - T细胞在 9 6 孔板培养 1 2 0 h 。在细胞培养的最后 1 6 - 1 8 h 每 孔加人1 u c i 的 仁 3 H 胸腺嗜咤, 1 8 h 后收获细胞， 通过计数掺人细胞的 3 H 胸腺唠陡的放射量确定 细胞的增殖反应， 计算 C P M ( 每分钟计数) 值

22、。 1 . 5 统计学方法所有数据输人 E x c e l 2 0 0 ( ) 电子 表格进行统计分析， 先进行方差齐性检测( F检验) ， 再行 : 检验和相关回归分析。 2 结果 2 . 1 C D 4 十 C D 2 5 十 调节性T细胞在外周血淋巴细胞 中表型和频率H I V / A I D S患者组与正常对照组相 比较， 外周血C D 4 十 C D 2 5 十 调节性T 细胞差异无统计 李意义。 H I V 感染组与正常对照组相比较， 外周血 C D 4 + C D 2 5 十 调节性T 细胞显著升高， 差异有统计学 意义( t 二 2 . 9 4 , P 0 . 0 1 ) .

23、A I D S 患者组与正常对照 组相比较， 外周血 C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T 细胞显著降 低， 差异有统计学意义( P 0 . 0 0 0 1 ) . A I D S 患者组 与 H I V感染组比较， 外周血 C D 4 + C D 2 5 + 调节性T细 胞显著降低， 差异有统计学意义( t = 5 . 2 4 , P 0 . 0 0 0 1 ) 。 表 1 三组人群 C D 4 + C D 2 5 十 调节性 T细胞在 外周血淋巴细胞中所占的频率 T a b . 1 T h e f r e q u e n c y o f C D 4 十 C D 2 5 十r e

24、g u l a t o ry T c e l l o f p e r ip h e r a l l y m p h o c y t e o f t h r e e d i f f e r e n t g ro u p s 组别例数均数土 标准差( %) 范围( %) G ro u p s 一n x t s R a n g e 正常 对 照 ( h e a lt h y c o n tr o ls ) 3 0 2 . 8 7 t 0 . 9 0 1 . 7 一 5 . 2 H I V 感染者( H I V in fe c tio n s ) 1 8 4 一 0 2 t 2 . 9 5 1. 0

25、4 一 8 . 0 4 A I D S 患者( A I D S ) 1 3 1 . 1 9 t 0 . 9 o “ “ 0 . 1 一 3 . 2 H I V 感染者/ A I D S ( H I V / A I D S ) 3 1 3 . 0 3 t 2 . 1 2 0 . 1 一 8 . 0 4 注: 与 正 常 对 照 组比 较， P 0 . 0 1 ; 与H I V 感染 组比 较， “ P 0 . 0 0 0 1 . N o te : C o m p e r e d w it h h e a lt h y c o n tro ls , P0 . 0 1 ; c o m p a re

26、d w i th H I V i n f e c ti o n s , * P 0 . 0 0 0 1 . 2 . 2 C D 4 + C D 2 5 十 调节性 T细胞与 H I V R N A病毒 载f的关系取 C D 4 + C D 2 5 十 调节性 T细胞的频率 为横坐标， H I V R N A 病毒载量的1 0 g 1 0 的对数为纵坐 标， 进行相关回归分析， 直线回归方程和散点图见图 t o H I V感染者/ A I D S患者的外周血中 C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T细胞的频率与 H I V R N A病毒载量呈正相 关， 相关系数为0 . 6 6 ( 尸

27、 0 . 0 1 ) ， 表明C D 4 十 C D 2 5 . 调节性 T 细胞具有抑制细胞免疫反应， 与促进病毒 复制， 形成持续性 H I V病毒感染密切相关。 2 . 3 C D 4 + C D 2 5 + 调节性 T细胞抑制功能试验 C D 4 十 C D 2 5 + 调节性 T细胞具有抑制 H I V抗原特异 性 C D 4 辅助性 T细胞增殖反应。从图 1 中可以看 出， 如9 6 孔板的微孔仅加人C D 4 + C D 2 5 + T 细胞， 则 C D 4 十 C D 2 5 十T细胞几乎不增殖; 同时按 1 : 1 加人 中 华实验和I应 床病毒学杂志2 0 0 6 年1

28、2 月第2 0 卷第4 期 C h i n e s e J E x p C l i n V i r o l , D e c e m b e r 2 0 0 6 , V o l 2 0 , N o . 4 来进一步动态观察T r e g 的连续变化。本研究还发 现H I V R N A病毒载量与患者外周血 C D 4 + C D 2 5 + T 细胞数量呈正相关性， C D 4 + C D 2 5 T细胞具有特异 性抑制 C D 4 + C D 2 5 一 T细胞的增殖作用。表明C D 4 十 C D 2 5 十 T细胞能抑制 H I V感染者/ A I D S 患者的特异 性细胞免疫反应， 促

29、进 H I V病毒复制， 与形成持续 H I V感染有关。而A I D S 晚期 C D 4 + C D 2 5 + T细胞几 乎缺失， 导致T 细胞激活凋亡， 而T 细胞激活水平与 H I V 感染者/ A I D S 患者的疾病进展和预后密切正相 关。 T细胞的激活则与T re g 免疫抑制功能丧失和 F o x p 3 表 达 水 平显 著降 低有关 7 l 。 多 位 研究者发 现 T re g 容易被 H I V病毒破坏， 转染F o x p 3 的基因给 n a Y v e T 细胞、 C D 2 5 - C D 4 + T 细胞能诱导他们具有免 疫 调节功能的T re g 8 l

30、 。国外研究发现在H I V / A I D S 患者中， F o x p 3 基因的表达水平与C D 4 T 细胞的水平 呈正相关， 在H I V 感染者中F o x p 3 基因的表达水平 明显高于 A I D S患者， C D 4 T细胞几乎完全丢失的 A I D S 患者F o x p 3 的表达水平显著降低， 患者表现为 高免疫反应状态， 与 A I D S 疾病进展密切相关， 推 测 F O X P 3 水平能作为预测疾病严重程度的指标。 因此T re g 或F o x p 3 分子对于维持H I V 持续感染和避 免T细胞过度激活而凋亡均具有重要意义。有关 F o x p 3 分

31、子与H IV / A I D S 病情的相互关系为本课题下 一步研究重点， 它将进一步揭示T re g 的作用机理和 调控机制， 对阐明H I V A I D S 的免疫紊乱机制具有重 大意义。 月一。1+的闪自曰十寸00岁 H I V R N A c o p y n u m b e r s ( l o g 1 0 ) 圈1 C D 4 C D 2 5 + 调节性 T 细胞的频率与 H I V感染者 / A I D S 患者的H I V R N A病毒载量的关系 F i g . 1 T h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n f r e q u e n

32、c y o f C D 4 C D 2 5 T c e l l s a n d s e r u m H I V R N A c o p y n u m b e r C D 4 C D 2 5 T细胞和 C D 4 C D 2 5 一T细胞， 则 C D 4 十 C D 2 5 T 细胞对 C D 4 C D 2 5 一 T细胞的增殖具有显 著抑制作用; 如去除 C D 4 C D 2 5 T 细胞， 则 C D 4 C D 2 5 一T细胞增殖明显， 结果见图2 0 500000500000500 芝妙 参考 T r e g / C D 2 5 CD2 5 1 M a r c C, A l e

33、 x a n d e r R. a r i s i n g r e g u l a t o ry C D 4 6 9 6. C o n t rol T c e l l s . 文献 o f i m m u n e h o m e o s t a s i s b y C u r r O p i n I m m u n o l , 2 0 0 31 5: 6 9 0 - 图 2 F i g . 2 3 讨论 表明T r e g 能抑制H I V 抗原特异性的 C D 4 十 C D 2 5 一T c e l l 的增殖 T r e g i n h i b i t i o n o f p ro l

34、i f e r a t i o n o f H I V a n t i g e n s p e c i fi c C D 4 C D 2 5 一T c e l l 本研究发现 H I V感染者外周血 C D 4 十 C D 2 5 T 细胞频率与正常人比较显著升高， 但 A I D S 患者则显 著降低。提示 H I V感染者在向 A I D S的发展中 C D 4 C D 2 5 十T细胞数量逐渐降低， 引起 H I V感染者 / A I D S 患者的细胞免疫功能紊乱。与H I V感染者相 比 较， T re g 在A I D S 患者外周下降与艾滋病期C D 4 T 细胞进一步破坏或凋亡

35、增多有关， T re g 也可能相应 破坏或凋亡增多。是否因为病情进展引起T re g 的 是动态波动和什么时候T re g 数量开始降低需要将 2 B a e c h e r - A l l a n C , H a fl e r D A . S u p p r e s s o r T c e l l s i n h u m a n d i s e a s e s . J E x p M e d . 2 0 0 4 , 2 0 0 : 2 7 3 - 2 7 6 . 3 S u g i m o t o K , I k e d a F , S t a d a n l i c k J , e t

36、a l . S u p p r e s s i o n o f H C V - s p e c i f i c T c e l l s w i t h o u t d i ff e re n t i a l h i e r a r c h y d e m o n s t r a t e d e x v i v o i n p e r s i s t e n t H C V i n f e c t i o n . H e p a t o l o g y . 2 0 0 3 , 3 8 : 1 4 3 7 - 1 4 4 8 . 4 C a b re r a R , T u Z , X u Y e

37、 t a l . A n im m u n o m o d u la t o ry ro l e f o r C D 4 ( +) C D 2 5 ( +)re g u l a to ry T ly m p h o c y te s i n h e p a t i t i s C v i r u s i n f e c t io n . H e p a t o l o g y . 2 0 0 4 , 4 0 : 1 0 6 2 - 1 0 7 1 . 5 A n d e r s s o n J , B o a s s o A , N i l s s o n J , e t a l . C u

38、t t i n g E d g e : T h e P r e v a l e n c e o f R e g u l a t o ry T C e l l s i n L y m p h o i d T i s s u e I s C o r r e l a t e d w i t h V i r a l L o a d i n H I V - I n f e c t e d P a t i e n t s . J I m m u n o l . 2 0 0 5 , 1 7 4 : 3 1 4 3 - 3 1 4 7 . 6 O c h s H D , Z i e g l e r S F ,

39、 T o r g e r s o n T R . F O X P 3 a c t s a s a r h e o s t a t o f t h e i m m u n e re s p o n s e . I m m u n o l R e v . 2 0 0 5 , 2 0 3 : 1 5 6 - 1 6 4 . 7 O s w a l d - R i c h t e r K, G r i ll S M, S h a r i a t N, e t a l . H I V i n f e c t i o n o f n a t u r a l ly o c c u r r i n g a n

40、 d g e n e t i c a l l y re p ro g r a m m e d h u m a n re g u l a t o ry T - c e ll s . P L o S B i o l . 2 0 0 4 , 2 : 1 9 8 : 9 6 1 - 9 9 6 . 8 M o r g a n M E , v a n B i l s e n J H , B a k k e r A M , e t a l . E x p re s s io n o f F O X P 3 m R N A i s n o t c o n f i n e d t o C D 4 C D 2 5 T re g u l a t o ry c e ll s i n h u m a n s . H u m I m m u n o l . 2 0 0 5 , 6 6 : 1 3 - 2 0 . ( 收稿日 期二 2 0 0 5 - 0 8 - 1 7 )