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1、 临床遗传学研究 CYP19A1基因 R264C 在中国上海BRCA1/2基因突变 阴性的遗传倾向乳腺癌中的作用 宋传贵胡震袁文涛狄根红沈镇宙黄薇邵志敏 【摘要】 目的研究CYP19A1基因 R264C 的 （CT） 单核苷酸多态性基因型在上海地区BRCA1/ BR- CA2基因突变阴性的遗传倾向乳腺癌人群中的分布及其与乳腺癌发病风险的相关性。方法对 114 例无 BRCA1/2突变的家族性 / 早发性乳腺癌患者和 121 名正常对照者进行CYP19A1基因第 7 外显子的聚合酶 链反应扩增， 随后进行 DNA 直接测序鉴定其 R264C 的单核苷酸多态性基因型， 比较基因型分布和发病风险 的
2、关系； 危险度比值比 （odd ratio，OR） 及 95%可信区间 （confidence interval，CI） 应用非条件 Logistic 回归分析 计算。结果CYP19A1基因 R264C 多态的 CC、 CT、 TT 基因型在病例组中的分布频率分别为 84 （77.8%） ， 22 （20.4%） ， 2 （1.8%） ； 在对照组的分布频率分别为 87 （77.7%） ， 24 （21.4%） ， 1 （0.9%） ； 在研究的总人群中， CT 基因型的频率为 20.9%（46/220） ， TT 基因型的频率为 1.4%（3/220） 。以 CC 基因型为参照， CT 或
3、TT 基 因型没有显著性地提高乳腺癌的发病危险， 其中携带 CT 基因型风险为 （OR = 1.16，95% CI： 0.53 2.55） ， 携带 TT 基因型风险为 （OR = 1.44，95%CI： 0.12 17.15） ； 经过月经状态和身体质量指数分层， 也未能发现 其与乳腺癌发病的相关性。结论CYP19A1基因 R264C 的单核苷酸多态性在中国汉族人群中的分布有 别于其他种族， 有其自身的分布特点； R264C 可能与上海地区中国汉族人群乳腺癌发生的遗传易感性无关， 尚不足作为低外显率的乳腺癌易感基因位点， 不建议作为未来临床基因筛查的候选指标。 【关键词】 乳腺癌；CYP19
4、A1基因； 遗传多态 Effect of R264C polymorphism inCYP19A1gene onBRCA1/2-negative hereditary breast cancer from Shanghai population of China*SONG Chuan-gui1， 2，HU Zhen1， YUAN Wen-tao3， DI Gen-hong1， SHEN Zhen-zhou1， HUANG Wei3，SHAO Zhi-min1. 1 （Breast Cancer Institute，Cancer Hospital / Cancer Institute； Depa
5、rtment of Oncology， Shanghai Medical College，Fudan University，Shanghai，200032 P . R . China） ； 2 （Department of Oncology，Affiliat- ed Union Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou， Fujian，350001 P . R . China） ； 3 （Chinese National Human Genome Center at Shanghai，Shanghai，201203 P . R . China） Cor
6、responding author：SHAO Zhi-ming，Email： zhimingshaoyahoo . com 【Abstract】 ObjectiveAromatase，encoded byCYP19A1，play an important role in estrogens biosynthesis from androgens. The present study is to investigate effect of R264C single nucleotide polymorphism inCYP19A1gene on ge- netic susceptibility
7、for hereditary breast cancer withoutBRCA1/2mutant. MethodsOne hundred and fourteenBRCA1/ 2-negative hereditary breast cancer patients from independent families and 121 age-matched healthy control subjects were analyzed. Genotype analysis was performed through polymerase chain reaction（PCR）and then D
8、NA direct sequencing. The odd-ratios（OR）and 95% confidence intervals（CI）were calculated by unconditional Logistic regression model. ResultsThe frequency of R264C single nucleotide polymorphism CC，CT and TT genotype in case group and controls was 84 （77.8%） ， 22 （20. 4%） ， 2 （1. 8%）and 87 （77. 7%） ，
9、24 （21. 4%） ， 1 （0. 9%） ，respectively. CT genotype （OR = 1.16，95%CI： 0.53-2.55）and TT genotype（OR = 1.44，95% CI： 0.12-17.15）did not confer a significantly increased risk for breast cancer. No significant association was found between T allele and susceptibility for breast cancer under analysis accor
10、ding to menopausal status and body mass index. ConclusionR264C polymorphism inCYP19A1 gene is not a candidate locus for low penetrance breast cancer susceptibility in Shanghai group of Chinese population and not recommended in clinical genetic test. Homozygous T allele of R264C is not common in Shan
11、ghai group of Chinese population. 【Key words】 breast cancer；CYP19A1gene； genetic polymorphism *Supported by the National Natural Science Foundation of China （Proj. No.30371580） ，the National“Tenth Five-Year”Science and Technology Program Grant（2002AA711A08） ，the Key Project of Shanghai Science and T
12、echnology Committee（03JC14019） ，and the Graduate Innovative Fund of Fudan University（CQF000812） 基金项目： 国家自然科学基金 （30371580） ； 国家 “十五” 攻关项目 （2002AA711A08） ； 上海市科委重点项目 （03JC14019） ； 复旦大学研究生创新基金 （CQF000812） 作者单位： 200032 上海， 复旦大学附属肿瘤医院乳腺科， 复旦大学乳腺癌 / 肿瘤研究所， 复旦大学上海医学院肿瘤学系 （宋传贵、 胡震、 狄根红、沈 镇宙、 邵志敏） ； 福建医科大学附属
13、协和医院肿瘤科 （宋传贵） ； 国家人类基因组南方研究中心 （袁文涛、 黄薇） 通信作者： 邵志敏， Email： zhimingshao 181中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 遗传性乳腺癌中只有 10% 20%的家系携带有BRCA1或 BRCA2基因的胚系突变， 大多数的家系尚未发现有明确的高外 显率的基因突变存在 1。乳腺癌是激素依赖性肿瘤， 内源性雌 激素的长期暴露可以增加乳腺癌的发病危险 2， 因而雌激素合 成代谢通路上的基因中可能存在着与乳腺癌发病有关的低外 显率的易感
14、基因位点 3。CYP19A1（OMIM 107910） 基因位于染 色体 15q21.1， 编码的细胞色素 P450 芳香化酶是雌激素生物合 成的一个基本和必需的功能酶， 能催化体内雄激素转化为雌激 素， 促进合成内源性的雌激素； 同时可以促进肿瘤内的雌激素 生物合 成， 因 而 其 在 乳 腺 癌 的 发 病 和 进 展 中 的 作 用 不 容 忽 视 4。位于 CYP19A1基因第 7 外 显 子 上 的 多 态 位 点 R264C （C T） 导 致 非 保 守 的 氨 基 酸 转 换，可 降 低 雌 激 素 水 平 18.5% 5， 表明该多态性影响芳香化酶的催化能力， 可能改变 对乳
15、腺癌的易感性危险。我们以上海地区BRCA1/ BRCA2突 变阴性的遗传倾向乳腺癌为研究对象， 探讨该多态位点在中国 人群中的分布及是否可以作为乳腺癌的低外显性易感基因位 点的可能性。 1对象与方法 1.1对象病例来自复旦大学附属肿瘤医院乳腺科 2000 年 1 月至 2004 年 3 月无血缘关系的原发性乳腺癌患者共 114 例， 全 部经组织病理证实； 病例已先期进行BRCA1/ BRCA2基因突变 检测， 均无携带BRCA1/2基因的致病性突变。76 例患者均有 至少 1 个一级亲属患乳腺癌的家族史； 38 例为单纯早发性乳腺 癌患者， 发病年龄都小于 40 岁， 无明显家族史。入组患者
16、年龄 为 20 71 岁， 中位发病年龄为 44 岁； 对照组 121 名为健康女 性， 年龄 16 68 岁， 中位年龄为 42.38 岁， 按年龄与研究对象配 对入组。具体流行病学特征对比资料见表 1。获得患者知情同 意后， 抽取外周静脉血 5 mL 置于含 800L 酸性枸橼酸葡萄糖 抗凝液的试管中备用。 表 1 病例组和对照组的流行病学特征 项目 病例 （n = 114，%） 对照 （n = 121， %） P 值 年龄 （岁） * 44 （33， 53）42.38 （34.5， 50） 0.266 月经初潮年龄 （岁） * 14.3 （13， 15）14.1 （13， 15） 0.3
17、45 13 岁 35 （30.7） 46 （38.0） 0.238 首次足月产年龄*27.1 （25， 29）24.7 （23， 26） 30 岁 17 （16.5） 0 （0） - 月经状态 绝经前79 （69.3）89 （73.6）0.470 绝经后35 （30.7）32 （26.4） 50 岁 15 （42.9） 12 （37.5） 0.655 BMI*23.3 （21.05， 25.4）23.2 （21， 25）0.821 25 32 （28） 35 （28.9） 0.885 *均数 （25%， 75%） 其间比较采用 t 检验 1.2DNA 提取采用 FlexiGene DNA 提取
18、试剂盒 （美国 Qiagen 公司） 从外周血提取基因组 DNA 置于 - 20冰箱中保存备用。 1.3基因型检测扩增含CYP19A1基因 R264C 多态的 PCR 引物参考文献 5 ， 序列为： F 5-CGCTAGATGTCTAAACTGAG-3， R 5-CATATGTGGCATGGGAATTA-3； 25 L 反 应 体 系 包 括： 由 50 100 ng 基因组 DNA， 2.5L 10 缓冲液， 200mol/ L dNTPs， 2.0 mmol/ L MgCl2， 400 nmol/ L 上下游引物， 1 U HotStar Taq 聚合 酶 （美国 Qiagen 公司） ；
19、PCR 反应条件： 预变性 95 15 min， 95 30 s， 61 30 s， 72 30 s 共 35 循环， 然后 72 10 min， 最后于 4。PCR 反应在 GeneAmp R9700 PCR 热循环系统 （ABI Biosys- tems，USA） 进行， PCR 产物应用 Big Dye Terminator 试剂盒在 ABI 3730 测序仪（Applied Biosystems，Foster City，CA） 进行 DNA 直接 测序。 1.4统计学处理采用x 2 检验进行各基因型和等位基因频率 在病例组和对照组间的分布差异比较以及 Hardy-Weinberg 遗传
20、 平衡定律的吻合度检验； 两组间的流行病学资料均数间比较采 用 t 检验； 相对危险度采用比值比 （odd ratio，OR） 和 95%可信区 间 （confidence interval，CI） 并应用非条件 Logistic 回归分析计算。 所有统计采用双侧概率检验， 以 P 0.05） 。按 月 经 状 态 分 为 绝 经 前 或 绝 经 后， 以 身 体 质 量 指 数 （body mass index， BMI）= 23 （平 均 数） 为 界， 分 为 BMI23 和 BMI 23 两组进行分层统计分析， 结果发现， 在绝经后的妇女中 CT 基 因 型 提 高 了 患 乳 腺 癌
21、 风 险 （OR = 2. 08， 95% CI： 0. 53 8.15） ， 在 BMI 23 的个体中， 携带 CT 基因型同样提高患病风 险 （OR = 1.14， 95%CI： 0.38 3.46） ， 但差异无统计学意义 （P 0.05） ， 结果见表 2。 3讨论 CYP19A1基因是雌激素生物合成通路上的一个重要酶基 因， 目前对其 R264C 单核苷酸多态性的生物学效应还不是非常 确定。尽管日本学者 Watanabe 等 6没有发现 R264C 单核苷酸 多态性对芳香化酶的效能有明显的影响， 但仍有必要继续研究 证实该多态性的确切功能。 该多态性的人群分布存在着种族间差异。He
22、aley 等 7在 英国人群中发现该位点非常稀少， 不超过 8%。而有报道指出， 281中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 图 1 CYP19A1基因 R264C 的单核苷酸多态性基因型测序结果 表 2 CYP19A1基因 R264C 单核苷酸多态在病例组及对照组的 分布 基因型对照组 （n， %） 病例组 （n， %） OR*（95%CI）P 值 总体112108 CC87 （77.7）84 （77.8）1.00 CT24 （21.4）22 （20.4）1.16 （0.53-2.55
23、）0.876 TT1 （0.9）2 （1.8）1.44 （0.12-17.15）0.98 月经状态分层 绝经前8178 CC62 （76.5）64 （82.1）1.00 CT18 （22.2）12 （15.4）0.85 （0.32-2.28）0.288 TT1 （1.3）2 （2.5）1.30 （0.11-15.73）1.00 绝经后3130 CC25 （80.6）20 （66.7）1.00 CT6 （19.4）10 （33.3）2.08 （0.53-8.15）0.215 TT0 （0）0 （0）- BMI 分层 BMI235758 CC45 （78.9）48 （82.8）1.00 CT11
24、（19.3）8 （13.8）0.99 （0.31-3.18）0.45 TT1 （1.8）2 （3.5）1.64 （0.13-20.34）1.00 BMI 235550 CC42 （76.3）36 （72.0）1.00 CT13 （23.7）14 （28.0）1.14 （0.38-3.46）0.609 TT00- *OR 按年龄， 月经状态， 初潮年龄， 足月产年龄， BMI 校正 在日本人群中则达到 30% 以上 5， 6。我们的研究发现， 该位点 在中国上海人群中的分布频率达到 20.9% （46/220） ， 接近于日 本人群， 说明 R264C 在东西方人群间分布存在着明显差异； 而 且
25、本研究人群中纯合的 TT 基因型非常的少， 仅有 1. 4%（3/ 220） ， 明显少于日本人群中的 11.2% （24/215） 5， 表明中国人群 中 R264C 的分布又有其自身特点， 明显不同于其他种族。 对于 R264C 与乳腺癌发病危险的相关报道主要来自日本 人群和英国人群的研究 6-8， 结果都提示该多态与乳腺癌的发 病没有明显关联。本研究中， 我们以BRCA1和BRCA2基因胚 系突变阴性的上海地区家族性或早发性乳腺癌患者作为遗传 高危群体进行研究， 结果发现， 与对照组相比， 以 CC 基因型为 参照， CT/ TT 基因型没有显著性的提高乳腺癌的发病危险。考 虑到绝经后妇
26、女的雌激素主要来源于外周脂肪组织内芳香化 酶对雄激素的局部转化， 而相对肥胖的人其脂肪组织中含的激 素前体物质较多， 所以我们对月经状态以及 BMI 进行分层分 析， 考察CYP19A1基因 R264C 对这些亚组人群的可能影响。 经过月经状态分层后， 没有发现 CT 或 TT 在绝经前后对乳腺癌 发病危险的影响； 经过 BMI 分层后， 我们也没有发现其对相对 肥胖妇女有显著效应。这些结果与 Watanabe 等 6的结果相似， 提示 R264C 尚不足以作为低外显性的乳腺癌易感基因位点， 其 对乳腺癌发病危险性的作用可能非常有限； 本研究样本量尚不 是很大， 有可能存在选择偏差， R264
27、C 的作用尚需要更大样本 的临床遗传学研究进行确定。另外， 我们推测， 虽然 R264C 导 致基因非保守区域的氨基酸转换， 但对芳香化酶的生物合成功 能的影响可能相当小。由于缺乏研究人群血循环雌激素水平 的完整资料， 本研究中我们无法进一步分析以明确 R264C 多态 对血雌二醇水平的影响， 以后需要对其展开进一步研究。 综上所述， 我们通过非 BRCA 基因突变的遗传倾向乳腺癌 进行对CYP19A1基因 R264C 是否可以作为乳腺癌低外显率的 易感基因位点的研究， 发现该多态位点的分布在中国人群中有 其自身特点， 同时， 尚无充分证据表明 R264C 可以作为上海遗 传倾向乳腺癌人群的低
28、外显性易感基因位点， 不建议作为未来 临床基因筛查的候选指标。 参考文献 1Anglian Breast Cancer Study Group. Prevalence and penetrance ofBRCA1 andBRCA2mutations in a population-based series of breast cancer cases. Br J Cancer，2000， 83:1301-1308. 2Hulka BS. Epidemiologic analysis of breast and gynecologic cancers. Prog Clin Biol Res，19
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30、ol，1999 ， 69: 293-297. 5Suzuki K，Nakazato H，Matsui H，et al . Genetic polymorphisms of estrogen receptor alpha，CYP19，catechol-O-methyltransferase are associated with fa- milial prostate carcinoma risk in a Japanese population. Cancer， 2003， 98 : 1411-1416. 6Watanabe J，Harada N，Suemasu K，et al . Argin
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