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1、45 卷6 期 2005 年 12 月 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica Vol.45 December No.6 2005 基金项目： 国家“973 项目”（2003CB114204） *通讯作者。Tel/Fax：86-10-62139620； E-mail：dewenqiu 作者简介： 龙松华 （1979 - ） ， 男， 湖南怀化人， 硕士研究生， 从事植物激活蛋白基因克隆方面的研究。E-mail：longsonghua79452 收稿日期： 2005-04-05， 修回日期： 2005-06-20 Gateway R 技术构建交链孢菌 JH505 c
2、DNA 文库 龙松华1， 2张宁1邱德文1*黎定军2黄炜1 （1中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所北京10081） （2湖南农业大学生物安全科技学院长沙410128） 摘要： Gateway R 技术构建 cDNA 文库， 利用噬菌体的位点特异性重组， 避免使用限制性内酶切割 cDNA， 能够解决 常规方法构建 cDNA 文库的技术缺陷。首次应用 Gateway R 技术构建交链孢菌 cDNA 文库， 经检测 cDNA 入门文库的 滴度达到 1 107cfu/mL， 文库总容量为 9 10 7cfu， 平均插入片段为 1510bp。通过 LR 重组把入门文库转换为表达文 库， 表达文库的
3、滴度为 1.58 106cfu/ mL， 文库总容量为 6.32 10 6cfu， 平均插入片段大小为 1680bp。表达文库的构 建为进一步克隆植物激活蛋白基因打下了基础。 关键词： Gateway R 技术，交链孢菌，激活蛋白，cDNA 入门文库，cDNA 表达文库 中图分类号： Q78文献标识码： A 文章编号： 0001-6209（2005）06-0963-03 Gateway R 技术是在噬菌体整合酶-切除酶系统基础上 创建 一 种 通 过 体 外 特 异 位 点 重 组 反 应 （即-att 重 组 系 统） 1，2， 并在该重组系统的基础上进行一系列修饰、 改造， 提 高了这一重
4、组系统的效率与特异性 3。应用 GatewayR 技术 构建 cDNA 文库具有下列优点： 在 cDNA 克隆中不必使用限 制性内切酶消化再与载体进行连接反应， cDNA 嵌合体克隆 出现的机率明显低于通过切割连接克隆方法构建的 cDNA 文 库； 重组克隆法的转化效率大约是切割连接克隆方法的 10 余倍， 阳性克隆率可达到 100%， 片段偏向性只有切割连接克 隆方法的 1/5， 克隆中插入的 cDNA 片段平均大小高于切割连 接克隆方法 4， 5； 构建的 cDNA 文库具有更大灵活性， 将 cDNA 片段重组到入门载体中， 构建出入门文库， 入门文库构建简 单、 克隆效率高、 能够较好地
5、保存和扩繁 cDNA 片段； 通过 LR 重组能够很容易将目的基因转化到其它的表达系统中， 包括 哺乳动物， 昆虫， 酵母和大肠杆菌来进行进一步的研究， 这些 转换过程中不需要进行亚克隆。 据 Invitrogen 公司网站 （） ， 至今有近百 篇文章报道应用了 Gateway R 技术。Ohara 等 4，5最早从事将 Gateway R 技 术 应 用 于 cDNA 文 库 构 建 上 的 研 究。 美 国 Invitrogen 公司于 2003 年开发的专门应用于高质量构建的 CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit 整合了 Gateway R
6、 技 术， 并进行了完善， 使构建 cDNA 文库简单、 系统、 高效。在国 内， 2004 年后已有使用 Gateway R 技术的相关报道 6， 7， 但利用 此技术构建真菌 cDNA 文库未见报道。 交链孢菌是一类重要的植物病原菌， 引起多种世界性的 植物病害。从交链孢菌 JH505 菌株中分离一类新型的蛋白， 这类蛋白启动植物防卫反应， 激活植物的免疫系统， 提高植 物自身免疫力， 通过调节植物生长代谢系统， 促进植物生长， 提高作物产量和产品品质。根据其作用机理将此蛋白命名 为植物激活蛋白 （Plant Activator Protein） 8 。本研究通过体外特 异位点重组克隆方法
7、构建交链孢菌 cDNA 文库， 以期通过免 疫筛选获取植物激活蛋白基因。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株： 交链孢菌 （Alternaria sp.） JH505 由本所药物工程 实验室保存， 大肠杆菌 （Escherichia coli） BL21 菌株购于北京天 为时代生物技术公司。 1.1.2主 要 试 剂： TRIzol Reagent， CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit，Micro-FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit，LR ClonaseTMEnzyme Mix 购 于 Invitrogen 公
8、 司。限 制 性 内 切 酶 BsrG购于 NEB 公司。质粒提取试剂盒购于北京天为时代 生物技术公司。 1.2总 RNA 提取和纯化 将交 链 菌 接 种 PDA 液 体 培 养 基， 28、 200r/min， 培 养 60h， 抽 滤， 取 0.5g 样 品 液 氮 研 磨， 立 即 加 入 5mL TRIzol Reagent， 混匀， 分装到 4 个 DEPC 处理的 1.5mL 离心管中， 以 下步骤按照 TRIzol Reagent 说明书进行。每管用 50L DEPC 处理的水溶解 RNA。通过紫外分光光度计和甲醛变性琼脂 糖凝 胶 电 泳 检 测 RNA 的 纯 度、 浓 度
9、 和 完 整 性。取 1mg 总 RNA 用 Micro-FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kit 参照试剂盒说明 书进行 mRNA 纯化， 检测 mRNA 质量。 1.3cDNA 合成和片段分级 取纯化的 mRNA 5g， 加入 SuperScript TM 等试剂反转录 合成一链， 加入 E . coli DNA Ligase 、 E . coli DNA Polymerase、 E . coli RNase H 等试剂， 合成第二链 cDNA， 连接 attB1接头。 cDNA 片段分级： 采用色谱柱法， 试剂盒提供的色谱柱每个含 有 1mL Sephacryl
10、S-500 HR 树脂， 按照说明书操作， 检测 cDNA 纯度与浓度。 1.4BP 连接、 转化和入门文库的构建 取分级后 cDNA 合适大小片段 150ng 左右用 BP ClonaseTM Enzyme Mix 与 pDONRTM222 载体进行 BP 连接反应。采用电 击转化法转入大肠杆菌 DH10B 感受态细胞。37、 200r/min 培养 1h， 加入冷冻培养基 （含 40% 甘油的 SOC 培养基） ， 液氮 速冻， - 70下保存， 即为构建的 cDNA 入门文库。 1.5入门文库滴度和质量检测 从文库中取 100L 菌液用 SOC 培养基稀释到 100 倍、 1000 倍和
11、 10000 倍。从中各取 100L 涂含 Kanamycin 的 LB 平 板 （直径 9cm） ， 每种稀释倍数涂板两个。培养 12 16h， 计算 其克隆数。根据公式： 文库的滴度 = 平板上克隆数 稀释倍 数/涂板体积， 计算出文库滴度， 从而得出文库的总容量。 随机挑取 24 个单克隆， 提取质粒， 限制性内切酶 BsrG 消化，电 泳 检 测；并 根 据 载 体 设 计 引 物，M13 上 游： 5- GTAAAACGACGGCCAG-3，M13下 游：5-CAGGAAACAGCT ATGAC-3扩增插入片段。检测入门文库阳性克性率及平均 插入片段大小。 1.6表达文库的构建及文库
12、质量评价 将入 门 文 库 5 106 1 10 7cfu 接 种 到 50mL 含 有 Kanamycin 的 LB 培养基中， 培养至 OD550为 1.0， 提取质粒， 取 300ng， 在 LR ClonaseTM Enzyme Mix 作 用 下 与 Gateway 载 体 pDEST-17 进行 LR 重组， 重组载体转化大肠杆菌 BL21 菌株， 构建表达文库。文库质量评价方法除抗生素用 Ampicillin 代 替 Kanamycin 外其它同初始文库。 2结果 2.1总 RNA 提取和 RNA 纯化 总 RNA 样品经分光光度计检测， 0D260/280为 1.946， 浓度
13、 为 13.18g/L， 总共得到 200L。经甲醛变性凝胶电泳检测， 28S rRNA 亮度与宽度大致为 18S rRNA 两倍， 5S rRNA 的亮度 较弱， 说明总 RNA 样品完整且纯度较高。1mg 总 RNA 样品 经 mRNA 纯化后， 分光光度计检测， OD260/280为 2.19， 浓度为 0.93g/L， 共得到 10 L。 2.2cDNA 合成及片段分级 合成 cDNA 第一链、 二链后进行片段分级， 收集 22 管片 段分级样品， 经含荧光染料 Goldview 琼脂糖平板检测各管 cDNA 样品浓度， 从第 3 管到第 22 管样品浓度均大于 5ng/ L， 从 1
14、4 管起， 片段较小， 可能含有 attB 接头， 为得到合适大小 cDNA 片段， 并尽可能包含更多的片段， 合并第 3 管到第 13 管的样品， 乙醇沉淀 cDNA， 用 4.5L TE 缓冲液重悬 cDNA 沉 淀， 分光光度计检测， OD260/280为 1.86， 共得到 350ng 样品。 2.3入门文库构建及质量平价 经检测， 入门文库的滴度为 1 107cfu/ mL， 文库总容量 为 9 107cfu。随机提取 24 个克隆质粒， 经 BsrG消化和 PCR 扩增后电泳检测结果 （图 1-A、 B） 表明， 检测阳性克隆率 为 100%， 平 均 插 入 片 段 大 小 为
15、1510bp。按 照 CloneMinerTM cDNA Library Construction Kit 要求， 一个高质量的 cDNA 文库， 其滴度应大于 1 106cfu/ mL， 文库总容量大于 5 10 6cfu， 阳 性克隆率大于 95%， 平均插入 cDNA 片段大于或等于 1500bp。 因此， 构建的入门文库是一个高质量的 cDNA 文库。 图 1 入门文库质量检测 Fig.1Qualifying the entry library A：Restriction analysis of recombinant plasmids digested with BsrG； B：PC
16、R products. M. Marker；CK.pDONRTM222；1 12. Recombinant plasmids. 图 2 表达文库克隆的质粒限制性内切酶 BsrG消化电泳图谱 Fig.2Restriction analysis of recombinant plasmids from Expression library M. Marker；CK.pDONRTM222 digested with BsrG；1 12. Recombinant plasmids digested with BsrG. 2.4表达文库构建及质量评价 经检测， 表达文库的滴度为 1.58 106cfu/
17、 mL， 文库总容 量为 6.32 106cfu。随机提取 24 个克隆质粒， 经 BsrG消化 后电泳结果表明 （图 2） ， 检测阳性克隆率为 100%， 平均插入 片段大小为 1680bp。结果表明， 构建的表达文库也是一个质 469微生物学报Acta Microbiologica Sinica2005，Vol.45 No.6 量较高的 cDNA 文库。 3讨论 一个高质量 cDNA 文库的关键就是要保证文库的完整性 与覆盖度。经过初步检测分析， 本实验所构建的交链孢菌 cDNA 入门文库与表达文库均是高质量的 cDNA 文库：（1） 文 库的克隆效率高， 入门文库总容量达到 9 107
18、cfu， 表达文库 达到 6 106 cfu；（2） 阳性克隆率高， 入门文库与表达文库的阳 性克隆率均为 100%；（3） 插入 cDNA 片段绝大多数在 1kb 以 上， 入 门 文 库 平 均 插 入 片 段 大 小 为 1510bp， 表 达 文 库 为 1680bp。另外， 文库构建操作方法简单化、 系统化， 通过一周 时间构建入门文库后， 就可以不必经过繁琐亚克隆操作直接 进入其它系统， 构建的文库可用于进一步研究。 以交链孢菌 JH505 为材料， 应用 Gateway R 技术构建的高 质量 cDNA 文库， 为物激活蛋白的基因克隆与表达奠定基础， 有助于促进蛋白农药生物合成和
19、提高蛋白农药的生物活性 研究的开展。另一方面， 也为交链孢菌相关分子学及遗传背 景研究提供了研究材料。 参考文献 1 Walhout A J，Sordella R，Lu X，et al . Protein interaction mapping in C.elegans using proteins involved in vulval development. Science，2000，287： 116 - 122. 2 Hartley J L，Temple G F，Brasch M A，et al . DNA cloning using in vitro site-specific rec
20、ombination. Genome Res，2000，10： 1788 - 1795. 3 Bushman W，Thompson J，Vargas L，et al . Control of directionality in Lambda site specific recombination. Science，1985，230：906 - 911. 4 Ohara O，Temple G. Directional cDNA library construction assisted by the in vitro recombination reaction.Nucleic Acids Re
21、search， 2001，29：1 - 8. 5 Ohara O，Nagase T，Mitsui G， et al . Characterization of size- fractionated cDNA libraries generated by the in vitro recombination- assisted method. DNA Reseach，2002，9：47 - 57. 6 梅文倩， 宋文强， 潘怡， 等 .利用 Getaway 克隆技术大规模克 隆拟南芥转录因子 .分子植物育种， 2004， 2 （3） ： 358 - 364. 7 陈其军， 安瑞， 周海梦， 等
22、.使用与 Getaway 技术兼容的 T 载 体获得入门克隆 . 生物化学与生物物理进展， 2004， 31 （10） ： 951 - 954. 8 邱德文 . 微生物蛋白农药研究进展 . 生物防 治，2004，20 （2） ：91 - 94. Construction of a cDNA library of Alternaria sp. strain JH505 using Gateway technology LONG Song-hua1， 2ZHANG Ning1QIU De-wen1*LI Ding-jun2HUANG Wei1 （1Institute of Environment
23、and Sustainable Development in Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） （2College of Bio-Safety Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China） Abstract：A cDNA library was constructed based on the Gateway R system that is a method to const
24、ruct a high-quality cDNA library without the use of restriction enzyme for cloning. This is the first report that the Gateway R system is used to construct a cDNA library for Alternaria sp. . The entry cDNA library was constructed in this report has a high titer of 1 107cfu/mL and contain a total cl
25、ones of 9 107cfu，with an average inserts size of about 1510bp. In order to screen for a gene encoding the plant activator protein from library using an antiserum，the entry cDNA library was transferred into Gateway R destination vector to create an expression library. The expression library show a hi
26、gh titer of 1.58 106cfu/mL and contains a total clones of 6.32 106cfu，with an average inserts size of 1680bp. Key words：Gateway R method， Alternaria sp.，Plant activator protein，cDNA entry library， cDNA expression library Foundation item：Key Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development （2003CB114204） * Corresponding author. Tel：86-10-62139620；E-mail：dewenqiu Received date： 04-05-2005 5692005，Vol.45 No.6龙松华等： Gateway R 技术构建交链孢菌 JH505 cDNA 文库