ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究.pdf

《ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、E S 细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究 张允平1 2 ，王英杰1 ，张世昌1 ，刘涛1 1 第三军医大学西南医院全军感染痛研究所。重庆4 0 3 8 ；2 上海市第六人民医院 6 2 9 论著干细胞 【摘要】目的探索用生物材料三维培养胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e u ，E s 细胞) 并向肝细胞分化的可行性。方法胰酶消化 悬滴法形成5d 的鼠拟胚胎，将l 1 0 6 m L 鼠E s 细胞与细胞外基质M a t r i g e l “l ：l 混合接种于聚乳酸( p o l y L 1 a c t i ca c i d ，P L L A ) 和 聚

2、乙醇酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ，P G A ) 共聚合三维支架内，用D M S O 、地塞米松、H G F 、F G F 4 、胰岛素等诱导E s 细胞向肝细胞分化，动态观 察E s 细胞的培育和生长情况，并用R T P C R 、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白( A L B ) 和甲胎蛋白( A F P ) 的表达。结果 立体显微镜见E s 细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长，并保持细胞活力。随培养时间延长不断增殖。R T - P C R 检出分化细胞表达A L Bm R N A 和A F Pm R N A 。同样免疫荧光染色也证

3、实表达A L B 和A F P 。结论E s 细胞可在生物材料聚合三维 可降解支架及M a t r i g e l “上生长，并在诱导剂的作用下向肝细胞分化。 【关键词】胚胎干细胞；肝细胞；细胞分化；生物材料 中图分类号：Q 8 1 3 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 6 5 7 0 9 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一0 6 2 9 一0 3 收稿日期：2 0 0 8 旬2 - 1 6 T h r e e d i m e n s i o n a lc u l t u r ea n dd i f f b r e n t i a t i o no fe m b r y o n i cs

4、t e mc e U si n t oh e p a t o c y t e s Z H A N GY u n p i n g k 2 ，W A N CY i n g j i e ，Z H A N GS h i c h a n 9 1 ，L I UT a 0 1 1 I n s t i t u t eo fI n f e c t i o u sD i s e a s e ，S o u t h w e s tH o s p i t a l ，T h i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i V e 玛i t y ，C h o n g q i n g4 0 0

5、0 3 8 ；2 S h a n g h a iS i x t hP e o p l e sH o s p i t a l ，C h i n a 【A b s t r a c t 】O b j e c t i V eT oi n v e s t i g a t et h ep o s s i b i l i t yo ft h et h r e e - d i m e n s i o n a lc u l t u r ea n dd i f 玷r e n t i a t i o no fe m b r ) ，o n i c s t e mc e U s ( E S c ) i n t oh e

6、 p a t o c y t e so nb i o m a t e r i a l s M e t h o d sM o u s eE S cw e r er e s u s p e n d e da tac o n c e n t r a t i o no fl l0 6c e l l sp e r1m Lo fc u l t u r em e d i u ma n dm i x e dw i t hM a t r i g e l T Ma tl ：1 T h em i x t u r ew e r e8 e e d e di n t op o l y L 1 a c t i ca c i

7、 d a n dp 0 1 y g l y c o l i ca c i dc o p o l y m e r i z e ds c a 丑0 1 d sa n dc u l t u r e di nd i 饪每r e n t i a t i o nm e d j u mc o n t a i n i n gD M S 0 ，d e x a m e t h a s o n e ， h e p a t i cg r o w t hf a c t o r ( H G F ) ，f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( F G F ) 4a n di n

8、 s u l i n ，e ta 1 E S cg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no nt h e t h r e e - d i m e n s i o n a lb i o d e g r a d a b l ep 0 1 y m e rs c a f f o l dw e r eo b s e n ，e db ys t e r e o m i c m s c o p e T h e e x p r e s s i o n so fh e p a t o c y t e m a r k e r s ，a l b u m i n ( A L B

9、 ) a n dd - f e t o p m t e i n ( A F P ) w e r ee x a m i n e du s i n gR T - P C Ra n di m m u n o n u o r e s c e n c e R e s n l t s S t e r e o m i c r o s c o p ys h o w e dt h a tm o u s eE S co rE Sc e l l - d e r i v e dc e l l sw e r ea t t a c h e dt ot h ec o p o l y m e rs c a f f o l d

10、 sa n dg r e w a c t i V e l yi nat h r e e d i m e n s i o n a l C e l l si n c r e a s e di nq u a n t i t ya n dd e n s i t ya st i m eg o e so n T h eA L Ba n dA F Pm R N A sw e 阳 d e t e 咖i n e di nd i f k r e n t i a t i n gE S ca td a y7a n d1 4b yR T - P C R C o n t r o lg m u pw i t h o u t

11、i n d u c t o rd i dn o te x p r e s sA L B ，b u t m R N A e x p r e s s i o no fA F Pw a ss e e na td a y1 4 I m m u n o c y t o c h e m i s t r ys t a i n i n gr e v e a l e dt h a tt h ed i f & r e n t i a t i n gE S cw e r e p o s i t i v ef b rA L Ba n dA F P C o n c l u s i o n E Sc e U scanb

12、ec u l t u r e da n dd i f 亿r e n t i a t e di n t oh e p a t o c y t e sw i t hM a t r i g e l T Ma n d i n d u c t o r so nt h r e e d i m e n s i o n a lb i o d e g r a d a b l ep o l y m e rs c a f b l d 【K e yw o r d s 】E m b r y o n i cs t e mc e l l s ；H e p a t o c y t e s ；c e l ld i 蜀f e r

13、 e n t i a t i o n ；B i o m a t e r i a l s 自1 9 9 8 年T h o m s o n 等从内细胞团分离到人胚胎 干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，E S 细胞) 以来，干细胞成 为生命科学最热门的研究课题。随着有关研究的不断 深入，E S 细胞所具有的能够向不同组织细胞分化的特 性，使之也成为组织工程领域的研究热点，以E s 细胞 为种子、生物材料为载体的骨、软骨、血管、神经等组织 的研究已取得不同程度的进展引。然而，有关E S 细 胞在三维生物材料上的生长与向肝细胞分化的研究为 数尚少，鉴于肝组织工程

14、研究有可能为肝功能衰竭的 治疗提供新的有效措施，本文对E s 细胞在聚合三维 基金项目：国家自然科学基金资助项目( 3 0 6 7 0 5 2 6 ) 通讯作者：王英杰，E m a i l ：y i n g j i e w n g y a h o o c o 。 可降解支架上培养和肝细胞分化进行了初步研究。 l 材料与方法 1 1 材料聚合三维支架材料为非编织型可降解聚 乳酸( p o l y L l a c t i ca c i d ，P L L A ) 和聚乙醇酸( p o l y g l y c o l i ca c i d ，P G A ) 共聚物( 美国S y n t h e c o

15、 n 公司) ，P L L A 和P G A 的聚合比例各5 0 。使用时将支架剪成约5 m m 4 5m m 1m m 的小片，置7 5 的乙醇溶液中浸 泡1h ，P B S 清洗3 次备用。 1 2 E S 细胞培养及胚胎体的形成鼠E S 细胞C C E 株购自加拿大S t e m c e l lT e c h n o l o g i e s 公司，未分化的 E s 细胞维持于含O 1m m o L L 非必需氨基酸、2m m o l LL 谷酰胺、O 1m m o l L 二羟基丙硫醇、1 5 胎牛血 万方数据 6 3 0 清、l0 0 0U m LU F ( r e c o m b i

16、 n a n tm o u s el e u k e m i ai n h i b - i t o r yf a c t o r ，C h e m i c o nI n t e m a t i o n a l 公司) 的I M D M ( I s c o v e sm o d i f i e dD u l b e c c om e d i u m ) 培养液和被覆明 胶的培养瓶内。采用“悬滴法”使E S 细胞在不含L I F 的上述I M D M 培养液中形成胚胎体，5d 后胰酶消化胚 胎体细胞备用。 1 3 E S 细胞的三维支架培养和肝细胞分化调整细 胞数为l 1 0 6 m L ，冰浴下

17、按l ：1 比例与M a t r i g e l l 。 ( B DB i o s c i e n c e s 公司) 混合，并快速接种于三维支架 内H ，3 7 下凝固3 0m i n 后移至1 2 孔培养板，诱导分 化组用主要含l D M S O 、l 1 0 m o l L 地塞米松、2 0 n g m LH G F ( r e c o m b i n a n tm o u s eh e p a t i cg r o w t hf a c t o r ， R & DS y s t e m s 公司) 、1 0n g m LF G F 4 ( f i b r o b l a s tg m

18、w t l l f a c t o r ，S i g m a A l 幽c h ) 、5m g L 胰岛素、5m g L 转铁蛋 白、5 斗g L 硒、1 5 胎牛血清的I M D M 培养液在3 7 、 5 c O ：条件下加以培养和诱导分化，培养液每3d 更 换1 次，2 周后终止细胞培养和分化。对照组I M D M 培养液中不含上述诱导剂。 1 4 形态观察定期用立体显微镜观察E S 细胞在 三维支架上生长与增殖情况。同时取培养细胞的乏维 支架，3 7 P B S 清洗2 次，浸入含O 1m m o l Lc a l c e i n A M ( D 0 j i n d oM o l e

19、c u l a rT e c h n o l o g i e s 公司) 的I M D M 培养液，3 7 孵育2 0m i n ，P B S 清洗3 次，用立体荧光 显微镜( s z x l 2 型，O l y m p u s ) 进行活细胞染色观察。 1 5细胞总R N A 提取与R T - P C R 检测 按R N e a s y M i n ik i t ( Q i a g e n 公司) 操作说明提取分化细胞的总 R N A ，用Q i a g e nO n e S t e pR T - P C Rk i t 进行R T P C R 。弓I 物及扩增条件为：白蛋白( A L B )

20、 ( 5 - G C T A C G G C A - C A G T G C 7 I T G - 3 ，5 一C A G G A T T G C A G A C A G A T A G T 一3 ； 5 5 ；3 5 循环；2 6 0b p ) ；A F P ( 5 一T C G T A 7 兀C C A A C A G G A G G 3 ，5 一A G G C T I I T G C r r C A C C A G 3 ；5 5 ； 3 5 循环；1 8 2b p ) ；B - a c t i n ( 5 一T T c c I T c T T G G G T A T G - G A A T

21、 - 3 ，5 一G A G C A A T G A T C I T G A T C I T C - 3 ；5 5 ； 3 5 循环；2 0 0b p ) 。 1 6免疫荧光染色 终止培养和分化时，三维支架及 E S 细胞包埋O C T 液中，一8 0 固定，冰冻切片( 1 5 斗m ) 。切片用2 5 B S A ( 牛血清白蛋白) 室温下封闭 非特异性抗原4 5m i n ；分别加入羊抗鼠白蛋白抗体 ( 1 ：1 0 0 ) ( B e t h y l 公司) ，鼠抗人鼠A F P 单克隆抗体 ( 1 ：2 0 0 ) ( R & Ds y s t e m s ) ，室温孵育6 0m i

22、n ；滴加连接 F I T C 的相应二抗( 1 ：2 0 0 ，1 ：4 0 0 ) ( D a k o 公司) ，室温孵 育6 0m i n ；荧光显微镜下观察。每一实验步骤均用含 l B S A 的P B S 清洗3 次，阴性对照以P B S 代替一抗。 2 结果 2 1 三维支架上E s 细胞的培养和生长采用立体 显微镜对共聚三维支架上培养的E S 细胞进行动态观 察。结果显示：接种的E s 细胞较均匀地分散于三维 支架材料中，部分细胞聚集成团；培养至第5 天，支架 的纤维之间出现大量的E S 聚集体，并与纤维支架紧 密附着；此后，支架上的E s 细胞数量进一步增加，E S 细胞或沿纤

23、维支架生长，或呈网织状黏连于相邻的纤 维之问，不同层面片样生长的E s 细胞和分化细胞展 现出立体景象。c a l c e i n A M 活细胞荧光染色显示，培 养于三维支架上E s 细胞及分化细胞保持良好的活 力，其绿色荧光图像与E s 细胞在三维支架上的分布、 生长和增殖过程相一致( 见图1 ) 。 2 2分化细胞A L B 、A F P 的免疫荧光染色 以目前 公认的A L B 、A F P 为肝细胞标志物，采用免疫荧光染 色方法分别检测分化细胞A L B 和A F P 的表达，结果显 示三维培养和诱导分化1 4d 的细胞均表达A L B 、A F P ， 对照组染色未见表达A L B

24、 、A F P 表达( 见图2 ) 。 2 3分化细胞A L B 、A F Pm R N A 的表达 同上以 A L B 、A F P 为肝细胞标志物，采用R T P C R 分别检测分 化细胞A L Bm R N A 和A F Pm R N A 的表达，结果显示在 用三维支架培养和诱导E S 细胞分化的第5 天就有 A F Pm R N A ，第8 天出现A L Bm R N A ，并持续到三维培 养和诱导分化结束。对照组未见A L Bm R N A 表达，但 检测出一定量的A F Pm R N A ( 见图3 ) 。 3 讨论 干细胞的出现与研究的不断深人和发展，为组织 工程的研究提供了新

25、的方向，这既是组织工程研究的 机遇，也是对组织工程研究的挑战。因为，以干细胞为 种子细胞，理论上讲是使组织工程研究获得了“全能 细胞”，从而打破组织工程研究和进一步应用的瓶 颈”1 。但由于目前这种全能细胞尚不能有效地特异 性、功能性分化，因此，用干细胞构建特定的组织器官 为时尚早。而构建像肝脏一样的由复合细胞组成的组 织器官，更需要按需对干细胞进行多途径、多细胞分化 技术的出现和成熟，同时也需要对与之相匹配的高性 能生物材料的不断探索和研究。但毫无疑问，干细胞 与生物材料相结合的研究将有助于这一新领域的发展 和最终目标的实现。 已证实，各种干细胞在体外诱导条件下可以分化 成肝细胞或类肝细胞(

26、 又称肝细胞样细胞) ，如E S 细 胞、骨髓问充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充 质干细胞等1 。这些实验研究大多是在二维模式下 进行的，从组织工程研究的角度讲，干细胞在三维状态 下向肝细胞的分化对研究组织工程肝组织更有意 义。本实验在利用P L L A P G A 共聚物和细胞外基质 对E S 细胞进行三维培养的同时，使用D M s O 、地塞米 万方数据 要墅瘟堂塑壁瘟堂盘查兰塑墨生! 旦筮! ! 鲞筮! 塑堡垒垫! 壁竺垒竺翌! ! 型旦! 型塑! ! 叁竖型! ：! ! ! ：! ! ：塑! ：墨 。6 3 l 图lE S 细胞在三维支架上的培养和生长A ：P L L A P G

27、 A 共聚三维支架；B ：三维培养5d 的E s 细胞( 褐色) ；c ：j 维培养E S 细胞 的活细胞染色( 绿色荧光) ；图2分化细胞的免疫荧光染色A ：阴性对照；B ：培养1 4d 的分化细胞A L B 染色( 绿色荧光) ；C ：培养 1 4d 的分化细胞A F P 染色( 绿色荧光) F i gl C u l t u r eE Sc e I l so nt h r e e d i m e n s i o n a ls c a 疗o I d sA ：P L L A 、P G Ac o p o l y m e rs c a f b l d ；B ：G r o w t ho fE sc

28、e U s ( b I D w ) o nt h e3 D s c a f f o l do nd a y5 ；C ：V i a b l ec e l ls t a i n i n go fE Sc e l l so nt h e3 Ds c a 舶l d ( g r e e n ) ；F i g2I m m u c y t o c h e m l s t r ys t a i n i n go fd i 骶r e n t i a t e d c e n s A ：N e g a t i v ec o n t r o l ；B ：A L Bs t a i n i n g ( g r e e n

29、 ) o fd i 蠡f e r e n t i a t e dc e l l so nd a y1 4 ；C ：A F Ps t a i n i n g ( g r e e n ) o fd i f f e r e n t i 到t e dc e U so nd g y 1 4 ；S c a l eb a r ，5 0 肛m 图3分化细胞的m R N A 表达 F i g3m R N Ae x p r e 鼹i o so fd i f f e r e n t i a t e dc e l b 松、H G F 、F G F 4 、胰岛素等诱导剂对E s 细胞进行了肝 细胞分化，由肝细胞特征性细

30、胞标志物A L B 、A F P 的基 因和蛋白表达结果不难看出，E S 细胞在i 维培养过程 中同时实现了肝细胞的分化。在未用诱导剂的对照组 细胞，R T P c R 也检出一定量的A F Pm R N A ，分析可能 与使用由细胞因子作用下制备的M a t r i g e l l 瑚有关。此 外，不排除E S 细胞少量自发性肝细胞分化的可能。 本研究证实了E S 细胞不仅可在聚合j 维可降解 支架材料上培养，而且能在生长过程中向肝细胞分化。 支架材料上E s 细胞更有效培养、更高效的特异性肝细 胞分化及功能性分化有待进一步进行。 参考文献 1 F e 脯i r aL s ，G e m c

31、h tS ，F u u e rJ 。e ta 1 B i c t i v ch y d r o g e l 幽u 5f o r c o n t m l l a b l ev a s c u I 盯d i 丘k 陀n t i a t i o no fh u m a ne m b 珂蛐i c 雠e mc e U B J 】 B i o m a t e r i a l 8 。2 0 0 7 ，2 8 ( 1 7 ) ：2 7 0 6 - 2 7 1 7 2 K 0 f i d i BT ，d eB m i nJ L ，H o ”c ，e ta 1 M y o c a r d i 曩l 瑚t 哪曲nw

32、 i t he 叶 b r y 明i cs t e mc e ub i o a n i f i c i a lt i s s u et 啪叩l a I l t “佃 J 】JH e 础L u 吣 T m n 叩l a n t 。2 0 0 5 ，2 4 ( 6 ) ：7 3 7 7 “ 3 L i mu M ，s i d h uK s ，T u c hB E D e r i v a t i o fm o t o rn e u I o n sf 油t h 啪 c l o n a lh u m a ne m b r y o n i cB t e mc e nl i n e s J 】c u 丌N

33、棚附v a R ， 2 0 0 6 ，3 ( 4 ) ：2 8 l _ 2 8 8 4 L e v e n b e r gs ，B u r d i c kJ A ，K r h e n b u e h lT ，e la 1 N 伽m t m p h i n - i n d u c e dd i 抒b m n t i a t i o no fh u m a ne m b r y o n i cs t e mc e U s 蚰t l l 陀e - d i m e n 8 i o n a lp o l y m e r i c8 c a 怕l d 8 J 】T i B 蛐eE n g ，2 0 0 5

34、，ll ( 3 - 4 ) ：5 0 6 5 1 2 5 A t a l aA T i s s u ee “g i n e e r i n g ，s t e mc e u sa n dc l o n i n g ：c u r r e n tc p 协 l m dc h a n g i n g t I n d 8 J 】E x p e nO p i nB i o lT h e r 。2 5 ，5 ( 7 ) ：8 7 9 - 8 9 2 【6 c a iJ ，z h 舯Y ，L i uY ，e ta 1 D i r e c t e dd i b 弛n t i 砒i o no fh u m 蚰e

35、m b r y o n i c8 t e mc e u si n t o 如n c t i o n a lh e p a t i cc e l l s J H 印a t o I o 盱，2 0 0 r 7 ，4 5 ( 5 ) ：1 2 2 9 1 2 3 9 7 O “gs Y ，D a iH ，L e o n gK w I n d u c i n gh e p a I i cd i 艉坤n m 岫o no fh u 哪 m e 肿n c h y m a l8 t e mc e l l Bi np e l l e tc u l t u 研 J 】B i o m a t e r i 田I I s ，2 0 嘶，2 7 ( 2 2 ) ：4 0 8 7 4 0 9 7 万方数据