G蛋白偶联受体激酶5在稳定表达α-SYNUCLEIN的SHSY5Y细胞中的基因表达调控功能.pdf

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1、2 0 1 0 年2 月 中国比较医学杂志F e b r u a r y ，2 0 1 0 第2 0 卷第2 期C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E V 0 1 2 0N o 2 G 蛋白偶联受体激酶5 在稳定表达仪S y n u c l e i n 的 S H S Y 5 Y 细胞中的基因表达调控功能 刘鹏，王晓映，高宁，朱华，代小伟，黄澜，徐艳峰，马春梅，秦 川 ( 中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京1 0 0 0 2 1 ) 【摘要】目的

2、 观测G 蛋白偶联受体激酶5 ( Gp r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o rk i n a s e ，G R K S ) 在稳定表达h 瑾一 s y n u c l e i n ( 人突触核蛋白) 的S H S Y 5 Y 细胞的胞核、胞浆中的表达情况并对其在帕金森病中的可能作用进行研究。 方法应用W e s t e r nb l o t t i n g 、组蛋白去乙酰化酶( h i s t o n ed e a c e t y l a s e ，H D A C ) 活性检测技术以及s h R N A 干扰技术等 对稳定表达h a - s y n u

3、 c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞中G R K 5 的表达及其亚细胞分布、胞核内G R K S 蛋白的功能进行研究。结 果发现G R K S 蛋白在过表达h a s y n u c l e i n 的细胞核以及细胞浆内均表达增加，胞核中的G R K S 蛋白通过影响组 蛋白去乙酰化酶的活性对b c l - 2 基因的转录和表达进行调控。结论 帕金森模型中G R K 5 通过对b c l - 2 基因的表达 进行调控发挥作用。 【关键词】G 蛋白偶联受体激酶5 ；帕金森病；d S y n u c l e i n 【中图分类号】R - 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7

4、 1 - 7 8 5 6 ( 2 0 1 0J 0 2 - 0 0 0 6 - 0 6 F u n c t i o no fG P r o t e i n C o u p l e dR e c e p t o rK i n a s e5 i nh e t - S y n u c l e i nO V e r e x p r e s s i n gS H S Y SYC e l l s L I UP e n g ，W A N GX i a o - y i n g 。G A ON i n g ，Z H UH u a ，D A IX i a o w e i ，H U A N GL a n ，X UY

5、 a n f e n g ，M AC h u n - m e i ，Q I NC h u a n ( K e yL a b o r a t o r yo fH u m a nD i s e a s e sC o m p a r a t i v eM e d i c i n e ，M i n i s t r yo fH e a l t h ；I n s t i t u t eo fL a b o r a t o r yA n i m a lS c i e n c e ， C h i n e s eA c a d e m yo fM e d i c a lS c i e n c e s ( C A

6、 M S ) C o m p a r a t i v eM e d i c i n eC e n t r e ， P e k i n gU n i o nM e d i c a lC o l l e g e ，B e i j i n g1 0 0 0 2 1 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t l0 b j e c t i v eT oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fG R K Si nh a s y n u c l e i no v e r e x p r e s s i n gS

7、H S Y 5 Yc e l l s a n dt oe l a r i f yi t sr o l ei nP a r k i n s o n sd i s e a s e M e t h o d sT h ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l so fG R K 5i nh 氆- s y n u c l e i n o v e r e x p r e s s i n gc e l l sw e T em e a s u r e db yW e s t e r nb l o t t i n g W e s t e r nb l o t t i

8、n g H D A Ca s s a ya n dR N A it e c h n i q u e sw e r eu s e dt o d e t e c tt h ef u n c t i o no fG R K Si nc y t o s o la n di nn u c l e i R e m i t s B o t ht h ee x p r e s s i o nl e v e l so fG R K So fc y t o p l a s t o i ca n d n u c l e a rd i s t r i b u t i o ns h o w e da ni n c r

9、e a s e ：n d u c e db yh a s y n u c l e i no v e r e x p r e s s i o ni nv i t r o N u c l e a ra c c u m u l a t i o no fG R K S i n h i b i t sb k - 2t r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o n C o n c l u s i o n s G p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r k i n a s e5i s u p r e g u l

10、a t e d i n P a r k i n s o n ed i s e a s e I tp h y sar o l ev i ar e g u l a t i n gt h eb c t - 2e x p r e s s i o ni nt h ep a t h o g e n e s i so fP a r k i n s o n sd i s e a s e 【K e yw o r d s 】a s y n u c l e i n ；G R K 5 ；P a r k i n s o n 8d i s e a s e G R K s ( Gp r o t e i n c o u p

11、l e dr e c e p t o rk i n a s e s ) 是G 蛋白偶联受体激酶，属于丝氨酸酪氨酸蛋白激酶 家族。目前发现G R K s 的主要功能是对G 蛋白偶联 受体( Gp r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r ，G P C R s ) 进行磷酸 【基金项目】8 6 3 项目：2 0 0 6 A A 0 2 A 1 1 5 和2 0 0 4 A A 2 1 5 2 6 2 。 【作者简介】刘鹏( 1 9 8 0 一) 女，博士研究生，研究方向：神经退行性疾病。 【通讯作者 秦川，女，教授。博士生导师。电话：6 7 7 7 9 9

12、1 5 ，E - m a i l ：q i n c h u a n p u m c e d u C O 。 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d ，F e b r u a r y2 0 1 0 ，V 0 1 2 0 N o 2 7 化，从而介导G P C R 的脱敏反应u 2o 。最近研究发 现G R K s 除了具有通过G P C R 发挥G 蛋白偶联受体 激酶的作用外，还可以通过磷酸化一些非受体底物 发挥作用。G R K 5 是G R K s 家族中的一员，具有所 有G R K 成员的共同特点，其中包括它既可以磷酸化

13、 G P C R s ，也可以磷酸化一些非受体底物，如 t u b u l i n ，s y n u c l e i n s Ho 和核蛋白体P 2 蛋白口1 等。 目前根据G R K 5 的分布和功能确定出了一些结构和 功能域：N - 末端磷脂酰环己六醇4 ，5 一二磷酸( P I P 2 ) 结合域，磷脂结合域( 氨基酸残基5 5 2 5 6 2 ) ，自体 抑制结构域( 氨基酸残基5 6 3 5 9 0 ) ，两个钙调蛋 白( C a M ) 结合域( N 末端氨基酸残基2 0 一3 9 和C 末 端氨基酸残基5 4 0 5 7 8 ) 以及一个D N A 结合细胞核 定位序列( D N

14、 A b i n d i n g n u c l e a rl o c a l i z a t i o n s e q u e n c e ，N L S ) ( 氨基酸残基3 8 8 3 9 5 ) 旧。o 。 A r a w a k a 等训通过对散发性帕金森病人脑组织 进行免疫组化染色发现，路易小体中存在有G R K 5 蛋白和O t s y n u c l e i n 蛋白，同时发现G R K 5 具有磷酸 化a s y n u c l e i n1 2 9 位点丝氨酸的功能，而a - s y n u c l e i n 的这种磷酸化修饰作用可能是其对多巴胺 神经元具有毒性作用的基础。这

15、一发现揭示了 G R K 5 在帕金森病可能具有致病作用。紧接着 B y c h k o v 等川发现G R K 5 的m R N A 水平和蛋白水平 在帕金森痴呆病人中表达均升高。由于G R K 5 参与 了G P C R s 介导的多种细胞信号通路的传导，因此 G R K 5 的表达变化可能会导致帕金森病中信号传导 通路紊乱，从而导致疾病的发生。 本课题组前期的研究发现帕金森病a s y n u c l e i n 转基因小鼠模型具有更高表达水平的G R K 5 【l 引，在 本文中我们对稳定表达h a - s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细 胞系进行G R

16、K 5 蛋白表达变化的研究，并对其亚细 胞水平的表达变化进行观察。G R K 5 的D N A 结合 细胞核定位序列的发现一o ，使人们对G R I O 在细胞 核内是否具有调控功能产生了研究兴趣。2 0 0 0 年， E c k h a r t 等人驯发现G R K 5 对一些基因的表达具有 调控作用。2 0 0 8 年M a r t i n i 等人4 。又发现了G R K 5 除了通过其经典的磷酸化G P C R 的功能外，还可以 作为H D A C 激酶实现对核内基因的调控作用，从而 参与心肌肥大疾病的发生。同年S o r r i e n t o 等纠发 现G R K 5 通过增加细胞

17、核内I g B c t ，进而抑制N F K B 的转录活性。基于以上报道，本文在确定帕金森病 模型中G R K 5 蛋白表达分布变化的基础上对其核内 相关功能进行了进一步的研究。 l 材料与方法 1 1 试剂和抗体 R i p a 蛋白裂解液( 碧云天公司) ，T f i z o l 试剂 ( I n v i t r o g e n ) ， R e v e r t A i d 佃F i r s tS t r a n dc D N A S y n t h e s i sK i t ( F e r m e n t a s 公司) ，R e a h i m e P C RM a s t e r M

18、 i x ( S Y B RG r e e n ) ( T o y o b o 公司) ，B C A 蛋白定量试 剂盒( P i e r c e 公司) ，硝酸纤维素膜( M i l l i p o r e 公司) ， 丙烯酰胺、N ，N ：亚甲基甲叉双丙烯酰胺和T E M E D 均购自北京鼎国生物公司，所有引物均由上海生工 生物公司合成。G R K 5 抗体( S a n t aC r u z 公司) ，仅 s y n u c l e i n 抗体( A b c a m 公司) ，B c l - 2 抗体( A b c a m 公 司) ，H R P 标记的G A P D H 抗体( 上海

19、康成生物公 司) ，羊抗兔、羊抗鼠I g G H R P 购自北京中杉金桥生 物公司。L i p o f e c t i n T M 2 0 0 0t r a n s f e c t i o nK i t ( I n v i t r o g e n 公司) ，N E - P E RN u c l e a ra n dC y t o p l a s m i c E x t r a c t i o nR e a g e n t s ( P i e r c e 公司) ，干扰G R K 5 的 s h R N A ( O p e nB i o s y s t e m s 公司) ，H D A CA

20、s s a y K i t ( c o l o r i m e t r i cd e t e c t i o n ) ( U p s t a t e 公司) o 1 2 稳定表达h a - s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞系的 建立 神经母细胞瘤细胞S H S Y 5 Y 购自中国医学科学 院细胞中心，稳定表达h a s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细 胞系由本课题组建立“。 1 3S h R N A 干扰 对转染用s h R N A 质粒进行提取，将所提取质粒 的测序结果与O p e nB i o s y s t e m s 公

21、司给出的s h R N A 核苷酸序列进行比较，序列正确的质粒进行细胞转 染，转染后7 2h 提取细胞总R N A 和总蛋白。用 r e a l t i m eP C R 和W e s t e r nb l o t t i n g 对目标基因进行检 测。根据得到的实验结果，我们从5 种s h R N A 中选 择了抑制G R K 5 表达效果较好的2 种s h R N A 进行 了后续相应的实验。序列为： s h R N A l G R K 5 ：5 C C G G A C G A G A T C A T A G A A A C A G A A T C T C G A G A T T C T

22、G T I T C T A T C A T C T C G T l - r I 1 1 3 ： s h R N A 2 G R K 5 ：5 C C G G C C A C C A C A T A A A C T C A A A C C A C T C G A G T G G l 兀G A G T r T A T G T G G T G G T I m 3 。 1 4 蛋白提取以及W e s t e r nB l o t t i n g 离心收集细胞，加入含P M S F 蛋白裂解液。冰上 充分裂解后4 。C1 40 0 0r m i n 离心2 0m i n 。提取上清 液于即为总蛋白。利用

23、N E P E Ron u c l e a ra n d 万方数据 8 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m pM e d F e b r u a r y2 0 1 0 。V 0 1 2 0 N o 2 c y t o p l a s m i ce x t r a c t i o nr e a g e n t s ( 胞浆胞核蛋白提取试 剂) 进行胞核和胞浆蛋白的提取，具体步骤参见说明。 B C A 试剂盒进行蛋白定量后，取等量样本蛋白，加入 S D S 上样缓冲液，混匀后沸水中变性，1 0 S D S P A G E 电泳分离，电转移至硝酸纤

24、维素膜，含5 脱 脂奶粉的T B S T 缓冲液封闭，抗体4 过夜杂交。次 日T B S T 洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育 l h ，T B S T 洗膜，E C L 显影定影显现信号。H R P 标记 的G A P D H 抗体作为总蛋白内参。q t u h u l i n 以及 P C N A 分别作为胞浆蛋白和胞核蛋白内参。 1 5R N A 提取以及R e a l - t i m eP C R T r i z o l 法常规提取R N A ，经D N A 酶处理后，逆 转录为e D N A ，采用实时定量聚合酶链反应( r e a l t i m eP C R ) 进行检测。

25、 G R K 5 引物序列为： 5 一G A C C A C A C A G A C G A C G A C T T C 3 和5 C G T T C A G C T C C T T A A A G C A T T C - 3 ： b c l 一2 引物序列为：5 - T T c 们丌G A G T T c G G T G G G G T C 3 和5 - T G C A T A r I T G T T T G G G G C A G G - 3 ； G A P D H 引物序列为： 5 C A T G G G T G T G A A C C A T G A G A G A 一3 和5 T G

26、 T G G T C A T C A G T C C T T C C A 0 3 。 1 6 H D A C 活性检测 按照说明进行标准品稀释，建立标准曲线( 0 1m m o l L ) 。在样品孔、阳性对照品孔和空白对照 孔加入2xH D A Ca s s a yb u f f e r ( 缓冲液) 。在阴性对 照孔中加入4I t m o l Lt r i c h o s t a t i nA ，同时在阳性对 照孔再加入H e l an u c l e a re x t r a c t ( 核提取物) 。各孔 均加入4 m m o l LH D A Ca s s a ys u b s t

27、r a t e ，充分混匀 3 7 。C 孵育6 0m i n ，加入a c t i v a t o rs o l u t i o n ( 活性物溶 液) ，充分混匀室温孵育2 0m i n ，酶标仪4 0 5n m 读数。 2 结果 2 1 稳定表达h o t - s y n u c l e i nS H S Y 5 Y 细胞系中 G R K 5 的m R N A 和蛋白水平均明显增高 用r e a l t i m eP C R 和W e s t e r nb l o t t i n g 分析h a s y n u e l e i n 稳定转染S H S Y 5 Y 细胞系和对照组细胞中 G

28、 R K 5 的m R N A 水平和蛋白水平的变化。图1 A 显 示稳定表达h a s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞系比对照 组S H S Y 5 Y 细胞具有更高水平的G R K 5m R N A 。图 I B 显示在稳定转染细胞系中G R K 5 蛋白明显多于 对照组S H S Y 5 Y 细胞，图示为三次独立实验并各重 复三次的代表图，G A P D H 作为内参。 2 2 稳定表达h a - s y n u c l e i nS H S Y 5 Y 细胞核和细 胞浆中G R K 5 的蛋白水平均明显增高 分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白，用W e s t

29、e r n b l o t t i n g 分析h a s y n u c l e i n 稳定转染S H S Y 5 Y 细胞系 中G R K 5 蛋白表达的亚细胞分布。图2 显示稳定转 染细胞系中G R K 5 蛋白在胞浆中和胞核的表达均明 显多于对照组S H S Y 5 Y 细胞，a - t u b u l i n 作为胞浆蛋 白内参，P C N A 作为胞核蛋白内参。图示为三次独 立实验并各重复三次的代表图。 2 3 h o t - s y n u c l e i n 稳定转染S H S Y S Y 细胞系中 H D A C 活性增强 为了研究G R K 5 蛋白在细胞核中的功能，我们

30、 ( A ) R e a l t i m eP C R 的统计结果，P ( o ，0 1 。( B ) W e B t e mb l o t t i n g 显示h a - s y n u c k i n 稳定转染S H S Y 5 Y 细胞G R K 5 蛋白表达高于对照组 $ H S Y $ Y 细缒。 圈lh a - s y n u c l e i n 稳定转染S H S Y 5 Y 细胞G R K 5 的m R N A 和蛋白的表达分析 ( A ) T h es t a t i s t i c a lr e s u l t so fr e a l t i m eP C R ( B )

31、W e s t e r nb l o ta n a l y s i so f t o t a lp r o t e i ne x t r a c t e d f r o mh a s y n u c l e i ns t a b l y t r a n s f e c t e dc e l l sa n dS H S Y 5 Yc e l l s ( c o n t r 0 1 ) F i g 1 A n a l y z i n gG R K 5m R N Aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o ni nh a s y n u e l e i ns t a b

32、 l yt r a n s f e e t e dS H S Y 5 Yc e i l s 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m p M e d ，F e b r u a r y2 0 1 0 ，V 0 1 2 0 N o 2 9 图2h a S y n u c l e i n 稳定转染S H S Y 5 Y 细胞核和胞浆 中G R K 5 蛋白的增高。 F i g 2 W e s t e r n b l o t t i n g o fn u c l e a ra n de y t o p l a s t i e p r o t e

33、i n s e x t r a c t e df r o m h a - s y n - t r a n s f e c t e d c e l l sa n d S H S Y 5 Yc e l l s ( c o n t r 0 1 ) 图3G R K 5 对H D A C 活性的调控 F i g - 3 A n a l y s i s o ft h eh i s t o n e d e a c e t y l a s ea c t i v i t y r e g u l a t e db yG R K 5 用H D A Ca s s a yk i t 对稳定表达h a s y n u c

34、 l e i n 的 S H S Y 5 Y 细胞系的H D A C 活性进行检测，之后用 s h R N A l - G R K 5 和s h R N A 2 G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞 观察G R K 5 蛋白表达抑制是否会对H D A C 的活性产 生影响。图3 A 显示与对照组S H S Y 5 Y 细胞相比， 稳定表达h a - s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞的H D A C 活 性明显增加，对照组S H S Y 5 Y 细胞的H D A C 活性设 定为1 0 0 ，h a s y n u c l e i n 稳定转染S H

35、 S Y 5 Y 细胞的 H D A C 活性为1 3 9 。图3 B 显示s h R N A l G R K 5 和 s h R N A 2 一G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞7 2h 后，H D A C 活 性明显低于阴性对照组S H S Y 5 Y 细胞。s h R N A l G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞中H D A C 活性降低约 8 0 ，s h R N A 2 - G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞中H D A C 活 性降低约5 0 。与对照组比较，P 0 0 5 ，“P 0 0 1 。 2 4 稳定表达h e - s y n

36、u c l e i n 的S H S Y S Y 细胞系中 b c l - 2 蛋白表达增加。G R K 5 对b c l - 2 基因的表达具 有调控作用 我们首先用r e a l t i m eP C R 和W e s t e r nb l o t t i n g 分 析稳定表达h o t s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞系和对照 组S H S Y 5 Y 细胞中b e l - 2 的m R N A 水平和蛋白水平 的变化。由图4 A 可见稳定表达h a s y n u c l e i n 的 S H S Y 5 Y 细胞系比对照组S H S Y 5 Y

37、细胞具有较低水 平的B c l - 2m R N A 。图4 B 显示稳定转染细胞系中 b c l - 2 蛋白的表达水平明显低于对照组S H S Y 5 Y 细 胞。接着用s h R N A l 一G R K 5 和s h R N A 2 G R K 5 转染 S H S Y 5 Y 细胞后分析b c l - 2m R N A 、蛋白的表达情况。 图4 C 显示，s h R N A l G R K 5 和s h R N A 2 G R K 5 转染 S H S Y 5 Y 细胞7 2h 后，可见G R K 5m R N A 的表达明 显低于阴性对照组S H S Y 5 Y 细胞。同时，可见

38、s h R N A l 一G R K 5 、s h R N A 2 一G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞与 阴性对照组S H S Y 5 Y 细胞相比，b c l - 2m R N A 的表达 明显增加。图4 D 显示，s h R N A l G R K 5 和s h R N A 2 G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞7 2h 后，G R K 5 蛋白的表 达明显低于阴性对照组S H S Y 5 Y 细胞。同时， s h R N A l 一G R K 5 、s h R N A 2 - G R K 5 转染S H S Y 5 Y 细胞与 阴性对照组S H S Y 5

39、Y 细胞相比，b c l 2 蛋白的表达明 显增加。说明G R K 5 的表达抑制可以促使b c l - 2 的 表达增加。G A P D H 作为内参，图示为三次独立实验 并各重复三次的代表图。P 0 ，0 5 ，P 0 0 1 与 对照相比。 3 讨论 本研究发现，在稳定表达h a s y n u c l e i n 的 S H S Y 5 Y 细胞系中G R K 5 的m R N A 水平和蛋白水平 均明显增加，通过进一步检测G R K 5 蛋白的亚细胞 分布时发现无论是在细胞的胞浆中还是在细胞的 胞核中G R K 5 蛋白表达均高于相应的对照组细胞， 这些结果提示我们G R K 5 蛋

40、白的表达增加在帕金森 病中可能具有一定的致病作用。 近期研究显示G R K 5 中包含的D N A 结合细胞 核定位序列的发现 ，G R K 5 作为H D A C 激酶实现 对核内基因的调控作用参与心肌肥大疾病的发 生“ 以及G R K 5 通过增加细胞核内I K B a ( 抑制性 g B c t ) 抑制N F K B ( 核因子K B ) 的转录活性引，上述 实验结果提示我们G R K 5 蛋白在细胞核内具有非常 重要的作用，因此我们通过H D A C 活性检测试验以 及R N A 干扰试验对G R K 5 在稳定表达h o t s y n u c l e i n 的S H S Y 5

41、 Y 细胞胞核中的相关功能进行了研究。 我们发现与对照组S H S Y S Y 细胞相比，稳定表达 h a s y n u e l e i n 的S H S Y S Y 细胞的H D A C 活性明显增 加，而且H D A C 的活性随着G R K 5 蛋白的表达减少 而显著降低。这些结果说明在S H S Y 5 Y 细胞中， G R K 5 对H D A C 活性同样具有调节作用。 万方数据 1 0 中国比较医学杂志2 0 1 0 年2 月第2 0 卷第2 期C h i nJC o m p M e d ，F e b r u a r y2 0 1 0 ，V 0 1 2 0 N o 2 稳定表达

42、h a s y n u c l e i n 的S H S Y 5 Y 细胞系b e i - 2 的m R N A 表达水平( A ) 和蛋白水平( B ) ，1 3 - a c t i n 作为内参，图示为三次独立实验并各重复三 次的代表图。s h R N A l G R K S 、s h R N A 2 G R K S 瞬时转染S H S Y 5 Y 细胞以及对照组S H S Y 5 Y 细胞中G R K 5 和b c l - 2m R N A 的表达情况( c ) 以及 蛋白的表达情况( D ) 。 圈4G R K S 对b c l - 2 基因的转录和表达具有调控作用 T h ed e

43、t e c t i o no fb c l - 2m R N A ( ) a n dp r o t e i nl e v e l s ( B ) i nh a s y n u c l e i n - e x p r e s s i n gc e l l sa n dS H S Y 5 Yc e l l s ( c o n t r 0 1 ) A n a l y s i so fT h em R N A l e v e l ( C ) a n dp r o t e i nl e v e l ( D ) o f G R K 5a n db c l - 2i nS H S Y 5 Yc e l l

44、st r a n s i e n t l yt r a n s f e e t e dw i t hs h R N A l G R K Sa n ds h R N A 2 一G R K S F i g 4 G R K Sr e g u l a t e sb e l - 2g e n et r a n s c r i p t i o na n de x p r e s s i o n h a - s y n u c l e i n 蛋白的表达增加，可能通过增加G R K 5 蛋白的表达，从而抑制了H D A C 的活性，调控基因 的转录和翻译。在稳定表达h a s y n u c l e i n

45、 的 S H S Y 5 Y 细胞中b c l - 2 的m R N A 和蛋白水平都是明 显降低的，而通过s h R N A 干扰降低G R K 5 蛋白表达 后，b c l - 2 的表达显著增加。这一结果证实了G R K 5 具有对b c l - 2 基因转录和表达调控的作用，而这一作 用可能是通过调控H D A C 活性实现的。B 1 c 0 2 基因 表达的调控是很复杂的，最近文献报道的G R K 5 可 以通过增加细胞核内I g B a 抑制N F K B 的转录活 性5 1 ，而1 9 9 9 年T a m a t a n i 等引证实N F K B 可以调 控b c l - 2

46、 基因的表达。因此，我们发现的G R K 5 的表 达增加抑制了b c l - 2 基因的转录和翻译，可能是由我 们证实的G R K 5 通过影响H D A C 活性进行的，也有 可能是通过G R K S 抑制N F K B 转录而实现。基因转 录和翻译的调控本身就是非常复杂的，受到多种蛋 白的调控，各种蛋白相互协调相互作用，共同调控， 所以我们相信G R K S 对b c l - 2 基因的调控也不仅限 于这两个方面，更多的参与此调控途径的蛋白还有 待于进一步研究。 综上所述，我们通过研究发现帕金森病模型中 G R K 5 具有b c l 一2 基因转录和翻译的调控功能，证实 了G R l

47、( 5 在帕金森病中具有一定的作用。这些发现 提示我们G R K 5 可能作为一个新的靶点在帕金森病 治疗中发挥一定的作用，同时我们的发现为进一步 研究G R K s 家族的基因调控功能提供了新的研究 方向。 参考文献： 1 】L e f k o w i t zR J Gp r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o r s 1 I I N e wr o l e sf o r r e c e p t o rk i n a s e s a n db e t a a r r e s t i n si n r e c e p t o rs i g n a l i

48、 n ga n d d e s e n s i t i z a t i o n J JB i o lC h e m ，1 9 9 8 ，2 7 3 ：1 8 6 7 7 1 8 6 8 0 C2 P i t c h e rJ A 。F r e e d m a nN J ，L e l k o w i t zR J Gp r o t e i n - c o u p l e d r e c e p t o rk i n a s e s J 】A n n uB e yB i o e h e m ，1 9 9 8 ，6 7 ：6 5 3 6 9 2 3 C a r m a nC V ，S o mT ，K

49、 i mC M e t e 1 B i n d i n g a n d p h o s p h o r y l a t i o no ft u b u l i nb yGp r o t e i n - c o u p l e dr e c e p t o rk i n a s e s J JB i o lC h e m ，1 9 9 8 ，2 7 3 ( 3 2 ) ：2 0 3 0 8 2 0 3 1 6 【4 】P m n i nA N ，M o r r i sA J ，S u r g n c h o vA 。e te 1 S y n u c h i n sm n o v e le a l t Bo fs u b s t r a t e sf o rGp r o t e i