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1、中国热带医学2 0 0 8 年第8 卷第7 期C H I N AT R O P f c A LM E D I c I N Ey o I 8N o 7J 1 1 J y 2 0 0 8 1 2 4 l H B V D N A 荧光定量P C R 检测的室内质控研究 吕虹m ，周亚莉1 ，张国军1 ，方芳1 ，王雅杰1 ，闰惠平2 ，康熙雄1 检验医学 摘要：目的研究H B V D N A 荧光定量P c R 检测室内质控管理体系。方法自制H B V D N A 阳性质控血清， 连续测量2 0 次，计算均值、标准差和变异系数，从第3 次开始利用即刻法进行质控，2 0 次以后利用质控图法进行质 控。
2、结果 自制阳性质控血清均一性和准确度均达到实验要求，用即刻法检测3 2 0 次质控结果均小于N 2 。数值， 在控制范围内，用质控图法检测H B V D N A 室内质控对数值的均值为5 5 4 ，标准差为O 2 2 ，C V 为3 9 ，稳定性好， 有临床应用价值，质控图利用E X c E L 表格标示出警告限和失控限，有利于动态监控质控结果。结论联合即刻法 和质控图法对于应用荧光定量P C R 的方法进行H B V D N A 检测的室内控制切实可行。 关键词：乙肝一D N A ；荧光定量；室内质控；即刻法；质控图 中图分类号：R 3 7 3 2 1 文献标识码：B文章编号：1 0 0 9
3、 9 7 2 7 ( 2 0 0 8 ) 7 1 2 4 1 一0 3 L a b o 髓t o r yq u a l i t y n t r o Io fd e t e c t i o o fl I B V D N Ab yF Q P C R L oH o n g ，Z H O UY a l i ，Z H A N GG u 0 一 j u n ，e ta 1 ( C e n t e r0 fL a b o r a t o r yd i a g n o s i s ，T i a n t 明H p i t a lA 母l i a t e dt oC 印i t a lM e d i c a lU
4、m v e r i 8 哆，B e i j i n g1 0 0 0 5 0 ，P R C l l i 腿) A b s t 翰c t ：O b j e c t i v e T op r e p a r e 锄i m e m a lq 1 1 a l i t yc o n t m ls 1 1 b 8 t 锄c eo fH B V D N A1 1 s e di nr e a lt i m eq u 锄t i t a d v e P C R ，彻dc 伽：l b i n ei 璐t a I l tm e t l l o dw i t I lc 叩t m lc h 眦t o 锚t a b l i
5、 s h 跚i n t e m a lq 【l “够c o n n 试s y s t 锄 M “h o d sH B V D N A p o s i t i v eq 1 1 a l i t yc o 椭斌8 e n l mw 鼬p r e p 酬锄dd e o e c t e d2 0m 衄r e p e 醯y M e 觚v 越u e ，8 t a I l 酬d e v i a t i o n ( S D ) 肌dc o e 岱 c i e mo fv a r i a b i l i t y ( C V ) w e r ec a l c 山t e d T h ei 删m 汕0 d 锄dc 伽
6、t r o lc h a r tm e t h o dw e r e 璐e df o rq 1 1 a l i t yc 删a f t e r3 ， 2 0n U 坞瑚p e c t i v e l y R 姻l d t s T h eh o m o g e r I i c i t yo fp o s i t i v ec o m r o ls e n l m 锄dt h ea c c m c ya f 脱t l l o dc o u l ds “曲t h e 静 q u e s t “t e 8 t n eq l l a u 坶c o n t r 0 1r e s u h 8o f i n
7、s t a n tm e t h o dW e r ek 旧也a nN 2 S 1 kl o go f m e 觚v a l u eo f H B V D N Ai I l t e 捌 町u a l i 竹c o n t m lw 黯5 5 4 ，吐屺s t 锄d a r dd e v i a t i o nw 船O 2 2 ，锄dt h ec o e f f i c i e m0 fv 蕊a b i u t yw 8 s3 9 C o 嗽l 璐i A n i n t e m a lq u a l i t yc o n t r o ：I8 y 8 t e ml l s e di I Ir e
8、a l 妇eq 啪石l a t i v eP C 础1 船b e 髓t a 】b l i 8 h e db yc 伽出i n “o n0 fi 璐t 蚰tm e t h o dw i t h c o n t r o lc h a n hi sf e 鹪i b l ef o ri n t e m a lq u a l i t yc t r o li nd e b e c t i H B V D N A K e y 啪r d s ：H B V D N A ；F 1 u o r e 毗n tq I l 舭t i 协t i ；I n t e m a lq 1 1 a l i t yc o n t r
9、o l ；I 璐t 舳tm e 也o d ；Q u a H t yc o I l t r o l ( Q C ) c 胁 随着临床基因扩增检验实验室管理暂行办法和临床 基因扩增检验实验室工作规范的贯彻实施，全国各地陆续规 范地开展荧光定量P C R 检测技术，与常规P c R 技术相比，实时 荧光定量P c R 具有特异性强，能有效解决P C R 产物污染问题、 自动化程度高等特点【I - 2 】。但由于荧光定量检测试剂盒效期 较短，连续检测2 0 次后做质控图时间较长，如果采用即刻法和 质控图法相结合对H B V D N A 室内质控进行控制，并利用 E x C E L 表格绘制动态质控图，
10、能对室内质控管理体系起到良 好的监控作用。 1 材料和方法 1 1 材料质控血清来自北京天坛医院肝病门诊肝炎患者血 清，经乙肝五项检测结果为H B s A g + 、H B e A g + 、抗H B c A b + 的 血清样本1 0 例，充分混匀；经乙肝五项、丙肝、H I V 检测全阴性 的血清样本1 0 例，充分混匀。以上两组血清样本均无黄疸、无 脂血、无溶血现象，将其进行5 6 3 0 m i n 灭活，并将以上两混 合样本以适当比例混合，使其检测预期浓度在1 0 5 一1 0 6 I U I I l l 之问。将质控品充分混匀，保证其均一性。取高压灭菌的O 5 I n l 离心管数只
11、，将上述质控品每管1 1 0 一分装至离心管中，瞬 时离心数秒，盖盖，用封口膜将其封口后直立放人一7 0 冰箱 冷冻保存。使用时取出后室温融解，震荡混匀，瞬时离心数秒 后使用；试剂使用上海复星公司H B V D N A 荧光定量P c R 检 测试剂盒；罗氏l i g h t c y c l e r 实时荧光定量P c R 仪，高速低温离 心机，恒温金属浴，微量移液器等。 1 2 方法取1 0 只阳性质控血清，在同一实验室，同一操作 人员使用同一台仪器、同批号试剂进行操作，对制备的质控品 的均一性进行检测。每次临床检测均设空白对照l 份、阴性对 照1 份、阳性质控品1 份、标准品4 份( 浓度
12、分别为7 5 1 07 I U m l 、7 5 1 0 0 I U m l 、7 5 1 0 5 I U m l 、7 5 1 0 4 I U m 1 ) ，连 续检测3 次后即可对第3 次检测结果进行质控；连续检测2 0 次后即可绘制质控图，对2 0 次以后的检测结果进行质控。 1 2 1 “即刻法”质控方法将连续的质控测定值按从小到 大的顺序排列，即x ”) ( 2 、) 【3 、X 4 X n ( X 。为最小值，) ( 1 l 为最 大值) 。计算均值( 习和标准差( s D ) ；按公式盯E 陧值= 、，；， 垒絮f 竺计算瓯触和脚触：豇下限值= 苎熹尘堑将 瓯眼值和s ，下鼠值与
13、s I 值表( 表1 ) 中的数值比较。 崇作者单位：1 首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，北京1 0 0 0 5 0 ；2 首都医科大学附属北京佑安医院感粢与免疫中心，北京 l o 。0 6 9 通讯作者：康熙雄。E 瑚n ：0 9 0 9 2 4 9 4 8 i 蛆c o m 万方数据 1 2 4 2 c H I N A 豫O P f c A LM E D I c I _ N EV o l 8N 0 7J u J y2 0 0 8 中国热带医学2 0 0 8 年第8 卷第7 期 I 2 2 质控结果的判断 脚上限值和研下限值均小于表1 中N 2 s 对应的值时，说明测定质控值的变化
14、在两个标准差之内，是可 以接受的。如s ，上限值和s ，下限值中之一处于N 2 s 和N 3 s 对应的值 之间时，说明该质控测定值的变化在两个标准差和三个标准差 之间，处于“警告”状态。当s ，上限值和s ，下限值之一大于N 3 s 对应 的值时，说明该质控测定值的变化已超过三个标准差，属“失 控”状态。 表1 。即刻法”质控田值表 N N 2 sN 3 s N N 2 s N 3 s 3 1 1 51 1 51 2 2 2 92 5 5 41 4 61 4 91 32 3 32 6 1 51 6 71 7 51 42 3 72 6 6 61 8 21 9 41 5 2 4 12 7 1 7
15、1 9 42 1 01 62 4 42 7 5 82 0 32 2 21 72 4 72 7 9 92 1 12 3 21 82 5 0 2 8 2 1 02 1 82 4 11 92 5 32 8 5 1 12 2 32 4 82 02 5 62 8 8 1 2 3 质控图法质控方法将2 0 次质控结果输入E x c E L 表 格，并利用电脑计算出均值x 2 s 及x 3 s ，并以x 2 s 为警 告线，x 3 S 为失控线，绘制质控图。将2 0 次质控样本的结果 取对数值，输入B 4 到B 2 3 ，将x 一2 S 、x + 2 S 、x 、x 一3 s 、x + 3 S 的数值输入c
16、 4 一G 4 和c 2 3 一G 2 3 ，用鼠标从B 4 拖到G 2 3 ，按工 具栏中的“图表向导”点击“折线图”，按“完成”可得到质控图 的基本轮廓，去除掉数值轴网络线。以x 3 s 为失控线，以x 2 S 为警告线。将鼠标移至x + 3 S 上两个失控点中的任意一 个点，右击后选择“添加趋势线”，选择“线性L ”，按“确定”键， 两端点连成直线，即成失控线。用相同的方法绘制出警告线和 均值线。 2 结果 2 1 准确性评价每批次实验同时做空白对照一份，阳性对 照和阴性对照各一份，H B V D N A 阳性质控品1 份，标准品4 份，分别为7 5 1 0 7 I U m l 、7 5
17、 1 0 6 I U I I l l 、7 5 1 0 5 I U n 1 1 、7 5 1 0 4 I U l I l l 。实验结果均显示，空白对照和阴性对照为阴性结 果，阳性对照为阳性结果，阳性质控品为阳性结果，标准品呈线 性关系，r 值= 一1 0 0 ，E r r o r = 0 0 2 3 2 。表明每次实验均在控制 之中，而且每次实验的准确性均有保证，试验结果可信。参见 图l 一2 。 C ”l eN u m I m 图l 邶V D N A 标准品7 5 1 0 7 1 0 4 n I m 】扩增曲线 4 O 4 2 4 44 64 ，85 m5 2 S 4 5 ，65 t 86
18、 6 26 6 石6 87 | 07 27 47 67 f 88 0 h g = n t f 埘o n 图2 拟合标准曲线，s l o p c = 一3 5 “，h t 眦e p t = 4 7 7 ，E l T o r = 0 0 2 3 2 ，r = 一1 0 0 2 2 质控品均一性评价一次性检测1 0 份阳性质控血清，病 毒载量对数值的均值为5 5 4 ，标准差为O 0 8 ，C V 为1 5 。质 控品均一性较好( 图3 ) 。 C v c kN u l n k 图31 0 份邸V D N A 质控品均一性检测扩增曲图 2 3 将第l 一2 0 次质控结果记录于即刻法质控表中( 表2
19、 ) ， 计算田上限值和盯f 限值，通过查表1 可得该2 0 次质控结果均小 于N ：。数值，在控制范围内。 2 4 经过培训的普通操作人员在仪器、试剂、设备及环境常规 的状态下进行连续2 0 次检测，得出常规条件下的变异( R C V ) 结果，病毒载量对数值的均值为5 5 4 ，标准差为O 2 2 ，c V 为 3 9 。 2 5 应用E X c E L 表格绘制出L e v e y J e n n i n 铲质控图，依据 2 0 次质控结果计算出x 和s D 确定质控限，依据其原则定x 2 s D 为警告限，x 3 s D 为失控限( 图4 ) ，并用黄色表示警告 限，红色表示失控限。将
20、每批次实验所做质控结果取对数值后 直接输入相应E X c E L 单元格中，图表将自动显示本次实验质 控结果在质控图中的位置，检测每次实验质控结果情况及质控 趋势。 3 讨论 在全面质量管理体系中，实验室内质量控制是一个重要的 环节H 1 。“即刻法”质控实际上是数据统计处理方法中应用 G n l b b s 剔除异常值的方法在免疫质控中的应用4 1 ，该法只需 要连续测定3 次，即可对3 次结果中异常值进行检验，比较简 单，因此在临床检验方面应用较广，尤其是在免疫检验室内质 控，如H B s A g 检测，抗一H I V 检测，抗一H C V 检测，抗梅毒抗体 检测“ 6 3 等，同时在血细
21、胞检测方面也有相关报道7 1 。我们把 “即刻法”室内质控应用于临床基因检测实验室中，优点更为 koflIZ三oh=) 一抖鼍芒Y一事姜兰E 万方数据 中国热带医学2 0 0 8 年第8 卷第7 期c H I N AT R O P I c A LM E D I c I N Ev d 8N n7J u l y2 0 0 8 1 2 4 3 突出。 表22 0 次荧光定量衄t 方法检测唧V D N A 室内质控数据结果 舀6 螽 簧 搿5 籍 蓉 舔5 ， 厂、M入 。 y V“ V l2345678 9l Ol l1 21 3 1 51 61 71 81 92 0 次数 图4 髓V D N A
22、室内质控图 虽然近年来，随着临床基因扩增检验实验室管理暂行办 法和临床基因扩增检验实验室工作规范的贯彻实施，以及 卫生部临床检验中心对全国各地部分临床基因扩增检验实验 室技术验收工作的陆续展开，许多地区牾床基因检验实验室已 开展临床基因检测工作，但是一些实验室在质量控制尤其是室 内质控方面仍存在很大问题n 】，。即刻法”质控能很好的克服 传统单一应用质控图法必须连续检测质控血清2 0 次后才能进 入质控的缺陷，在测定3 次后即可进入质控状态，监测实验结 果的可靠程度，为样本量较少、实验周期长的实验室提供了良 好的质量保证。虽然“即刻法”可以解决室内质控的一些问 题，但它仍然存在一些问题一】，“
23、即刻法”前3 次结果对后续质 控结果影响较大；当前3 次结果精确度很好时，对后续质控结 果的精确度要求亦较高，否则容易出现失控，且多为假失控；当 前3 次结果不稳定，s 较大时，对后续质控结果影响更大，后续 结果中会出现较多的假在控和假失控。“即刻法”同样不能判 断连续趋势性上升或下降失控，对试剂的灵敏度也不能进行监 控。 质控图能直观的监测质控结果及其变化趋势，但质控图本 身只是一种工具，因此也有个质量问题，即它具备什么条件才 能真正起到过程控制作用H 。当一个质控图绘制成功，就必 须进行分析绘制质控图的过程是否在“控制”条件下进行，此 时的质控图实质上是“分析用质控图”。本室质控图绘制后，
24、 c V 为3 9 ，小于临床允许误差；2 0 次质控值均在x 2 s D 范 围内，并符合w e s t g a 耐质控规则的l ，。、2 ：。和4 。s ，此质控图可以 用做“管理用质控图”，控制检验过程。同时此质控图绘制出 了警告线和失控线，给判断检测结果数值是否在控制限内提供 了方便，大大提高了工作效率，非常有利于临床推广应用。 所以“即刻法”虽然能解决质控中的一些问题，但还应结 合L J 质控图法相结合对H B V D N A 的荧光定量检测进行 室内质量控制，这样综合两种方法的优点，对于应用荧光定量 P c R 的方法进行H B V D N A 检测的室内控制不失为一种切实 可行的
25、方法。 参考文献： 1 J a r d iR ，R o d r i g I 】e z F ，B u t iM ，e ta 1 Q t I 蚰6 住m v ed c t c d i m0 f h c p a l i l i s Bv i m sD N Ai n8 唧mb yar l e wr a p i dl 嘲l t i m en u o n 港啪P C R8 8 s a y J JV i r a lH e p a l ，2 0 0 1 ，8 ：4 6 5 4 7 1 2 H oS K ，Y 咖W c ，k n gE K ，e ta 1 脚e dq 啪t i 6 c a t i 0 fh e
26、p l I t i t i 8 Bv i r I HD N Ab yr e a l 一畦m P C R 面n gn u 帐撇衄th y 晡d i z a l i o I Ip I o b e 8 J JM e dM i c m b i o l ，2 0 0 3 ，5 2 ：3 9 7 4 0 2 3 王治国，李小鹏，武平原临床检验定量测定室内质控系统的建立 J 检验医学，2 0 0 4 ，1 9 ：6 9 4 秦晓光适用于免疫测定的“即刻法”质控方法一G m b b s 氏异常值 取舍法 J 中华医学检验杂志，1 9 9 2 ，1 5 ：3 7 5 张惠荣，耿海杰E u s A 检测H I V
27、 抗体“即刻法”室内质控 J 中 国卫生检验杂志，2 0 0 5 ，1 5 ( 4 ) ：4 9 1 6 徐庆华，殷仰周，董丽丹抗一H c V 试剂的“即刻法”室内质控 【J 中国输血杂志，2 0 0 1 1 4 ( 2 ) ：8 5 7 李素敏，韩俊虎用血细胞计数仪对成分血进行“即刻法”室内质 控 J 中国输血杂志，2 0 0 2 ，1 5 ( 6 ) ：4 0 6 4 0 7 8 张伟民，夏晓华，宋超浙江省1 0 0 所临床基因扩增实验室技术复 审结果和现状分析 J 浙江检验医学，2 0 0 7 ，5 ( 3 ) ：4 3 4 4 9 宋宏先，张吉才，郭建华。即刻法”室内质控存在的问题探讨 J 检验医学，2 0 0 4 ，1 9 ( 3 ) ：2 6 9 2 7 0 1 0 秦晓光室内质控的主要工具一质量控制图 J 中华检验医学 杂志，2 0 0 3 ，2 6 ( 1 1 ) ：7 1 0 一7 1 3 收稿日期：2 0 0 8 0 3 一1 9 万方数据