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1、ERK 和 JNK 通路在沙土鼠脑缺血预处理中的表达及作用 王耀岐1， 2， 李 军2， 曹 红2， 李广明2， 曾因明2 （1. 中国医科大学第一临床学院麻醉科， 辽宁 沈阳 110001； 2. 徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室， 江苏 徐州 221002） 中国图书分类号： R-332； R 322. 81； R 329. 25； R 345. 57； R 394. 2； R 743. 31； R 977. 3 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 03 -0337 -04 摘要： 目的 探讨 ERK 和 JNK 在沙土鼠脑缺血预处理中的 表达及作用。方法 采
2、用沙土鼠前脑缺血再灌注损伤模型。 随机分为假手术组 （SH） 、 预处理对照组 （IC） 、 预处理缺血组 （IP） 及脑缺血再灌注组 （IR） ； 各组根据再灌注 15 min、 2 h、 4 h、 6 h、 1 d、 3 d、 5 d 及7 d 又分8 个亚组。在预定时间点行开 阔法行为学检查、 TUNEL 法海马 CA1/3 区凋亡细胞检测、 免 疫组织化学 SP 法测定 p-ERK、 p-JNK 在海马区的变化。结 果 IP 可减少沙土鼠探索活动及海马 CA1 区凋亡锥体细胞 数量 （vs IR，P 0. 05） 。IP 能改善其行为学 异常， 各时间点爬行格子数较 IR 组分别减少
3、15%、 60%、 50%、 34% （P 0. 01， P 0. 05）。 2. 2 IP 对锥体细胞存活数的影响 SH 组 HE 染 色， 可见海马 CA1 区有 3 4 层锥体细胞， 排列整 齐、 紧密， 细胞核呈蓝黑色， 胞质淡红色， 高倍镜下细 胞核大而圆， 有 1 2 个核仁； 5 min 脑缺血使 CA1 区失去正常结构， 细胞排列散乱， 细胞数量减少， 再 灌后 1、 3、 5、 7 d 存活锥体细胞数分别仅为 SH 组的 89%、 45%、 29%、 22% （P 0. 01） 。IP 有明显的脑 保护作用， 除再灌 d 1 外， 其余 3 d 海马 CA1 区 100 m
4、2内存活锥体细胞数目较 IR 组分别增加 81%、 93%、 152% （P 0. 01） ； 对 CA3 区神经元也有不同 程度的保护作用 （Tab 1） 。 2. 3 IP 对凋亡锥体细胞数的影响 TUNEL 法检测 发现 SH 组 CA1 区无凋亡锥体细胞， 3 min 脑缺血 CA1 区出现少量凋亡锥体细胞。5 min 脑缺血使凋 亡锥体细胞明显增加， 核固缩或染色质边聚， 可见凋 亡小体； 再灌注 1、 3、 5、 7 d 其 CA1 区凋亡锥体细胞 数比 IC 组分别增加 200%、 181%、 92%、 110% （P 0. 01） ； CA3 区分别增加 70%、 78%、 6
5、5%、 59% （P 0. 01） 。IP 可使 5 min 脑缺血引起的凋亡锥体细胞 数减少， CA1 区各时间点凋亡锥体细胞数分别仅为 IR 组的 30%、 49%、 51%、 50% （P 0. 01） ； CA3 区 分别是 45% （P 0. 05） 、 76%、 74%、 80%。各组同 一时间点凋亡锥体细胞数 CA3 区低于 CA1 区 （P 0. 01， Tab 2） 。 Tab 1 Effect of IP on the number of surviving neurons in hippocampal CA1 region after ischemic reperfusi
6、on in gerbil （“x s， n =6） GroupSHICIRIP IR 1d60 352 7# 54 5# 57 5# IR 3d60.4 3.348.3 13.3#27.3 8.1#49.3 1.9# IR 5d60.4 3.351.9 9.2#17.7 9.5#34.1 2.8# IR 7d60.4 3 47 7# 13 7# 33 8# #P 0. 05，#P 0. 01 vs SH；#P 0. 05，#P 0. 01 vs IC；P 0. 01 vs IR Tab 2 Effect of IP on the number of apoptosis neurons in h
7、ippocampal CA1 region after ischemic reperfusion in gerbil （“x s， n =6） GroupSHICIRIP IR 1 d0 06. 3 2. 1#19. 5 6. 5#6. 0 2. 3# IR 3 d0 017 3#49 8#22 10# IR 5 d0 018 6#34 8#17 6# IR 7 d0 012 4#25 10#13 5# #P 0. 01 vs SH；#P 0. 01 vs IC；P 0. 01 vs IR 2. 4 IP 对 p-ERK、 p-JNK 表达的影响 SH 组 p- 833中国药理学通报 Chin
8、ese Pharmacological Bulletin 2006 Mar； 22 （3） ERK、 p-JNK 无明显表达。IC、 IP、 IR 组海马 CA3 区 p-ERK 在再灌后 15 min 有表达， 后逐渐增强， 于再 灌4 h 达高峰后逐渐下降， 至再灌后7 d 仍有少许表 达。IP 组各时间点海马 CA3 区 p-ERK 的表达水平 较 IC、 IR 组明显增强 （P 0. 01， P 0. 05 ） ， 其中再 灌后 4 h CA3 区较 IC 组增加 57%， 较 IR 组增加 32%。4 组各时间点 CA1 区 p-ERK 均无明显表达。 IC、 IR、 IP 组 CA
9、1、 CA3 区再灌后 15 min 即有 p-JNK 的表达， 逐渐增强至再灌后 1 d 最明显， 后逐渐减 弱， 但再灌后 7 d 仍能检测到， CA1 区表达水平高于 CA3 区 （P 0. 01，P 0. 05 ） 。IR 组 CA1 区 p-JNK 表达较 IC 组明显增高 （P 0. 1， P 0. 05） ， 其中再 灌后 1 d CA1 区 JNK 活性较 IC 组高 72%。IP 显著 降低 CA1 区 JNK 磷酸化水平 （vs IR P 0. 01， P 0. 05） ， 其中再灌后 1 d 降幅达 49%（Tab 3 4） 。 Tab 3 Effect of IP on
10、 the expression of p-ERK in hippocampal CA1 region after ischemic reperfusion in gerbil （OD value，“x s，n =6） GroupICIRIP IR 15min14 317 423 4# IR 2 h16 320 428 4# IR 4 h22 528 535 5# IR 6 h19 424 433 5# IR 1 d15 319 426 4# IR 3 d13.2 2.715.3 3.722.3 3.7# IR 5 d8.8 2.310.4 3.219.2 3.0# IR 7 d5.5 2.27
11、.3 2.011.0 1.8# #P 0. 01 vs IC；P 0. 05，P 0. 01 vs IR 3 讨论 1990 年 Kitagawa 等 1在沙土鼠脑缺血的实验 研究中， 首次提出了 IP 的概念。此后各国学者对 IP 的机制进行了广泛的研究， 提出了许多假说。近年 来以受体激活为起点， 以细胞内信号转导为主线， 构 成预处理保护机制研究的重点， 其中 MAPK 途径在 IP 中的作用引起了人们的关注。MAPK 是细胞外信 号引起核反应的细胞信息传递的汇聚通路之一。引 起 ERK 激活的细胞外信号主要是生长因子等有丝 分裂刺激， 而缺血缺氧、 应激、 紫外线、 细胞因子多种 细胞
12、外刺激主要激活 p38 和 JNK 通路 4。 开阔法是较为经典的行为学检查方法， 其检查 结果与海马的损伤程度密切相关 5。当海马功能 受损时， 表现为探索活动活跃。本实验观察到5 min 前脑缺血再灌注后沙土鼠探索活动活跃。IP 可显 著改善脑缺血引起的沙土鼠行为学异常， 明显增加 海马 CA1 区存活锥体细胞数， 使凋亡锥体细胞显著 减少； 同时 CA3 区存活神经元也有不同程度的增 加。表明 IP 可以减轻沙土鼠脑缺血再灌注损伤， 有 明显脑保护作用， 与文献报道一致 1。本实验发现 5 min 脑缺血使对缺血敏感的海马 CA1 区 p-JNK 表 达增加， p-ERK 无明显表达，
13、CA3 区存活的神经元 上有 p-ERK 的表达， 而 p-JNK 的表达较弱， CA1 区 缺乏保护信号而增强有害信号的表达可能是脑缺血 后神经元延迟性死亡的的重要机制。Hu 等 6用 Western blotting 和激光共聚焦显微镜在大鼠脑缺血 模型上观察 15 min 脑缺血后 MAPK 的活性变化， 发 现缺血再灌注后 30 min 和 4 h 在耐受缺血的 CA3/ DG 区细胞核有 p-ERK 表达， 在死亡的 CA1 区神经 元无表达。而 JNK 的底物 c-Jun 却在 CA1 区选择性 表达， 提示 ERK 参与缺血后的细胞保护， JNK 介导 了神经元损伤。研究结果与我
14、们相近。而 Namura 等 7的研究结果却显示 ERK 介导了神经元死亡， 与 上述结果大相径庭。可能与动物的种属和实验模型 有关。本研究发现缺血预处理使 CA1 区 JNK 活性 明显降低， p-ERK 仍无明显表达， 而 CA3 区 ERK 活 性明显增强， 说明 IP 通过下调伤害性信号 （JNK） 的 传导保护海马 CA1 区神经元， 增强保护性信号 （ERK） 的表达减轻CA3区神经元损伤， 从而使沙土 Tab 4 Effect of IP on the expression of p-JNK in hippocampal CA1 and CA3 regions after isc
15、hemic reperfusion in gerbil （OD value，“x s， n =6） Group IC CA1CA3 IR CA1CA3 IP CA1CA3 IR 15min6.6 1.9#4.3 1.614.3 2.7#5. 3 2. 18. 4 2. 2#5. 6 1. 9 IR 2 h14.6 3.2#6.2 2.123.5 3.3#7. 7 2. 117. 0 3. 0#7. 0 2. 3 IR 4 h7.1 2.0#4.7 1.48.3 2.2#4. 2 1. 37. 2 2. 45. 2 1. 4 IR 6 h8.9 2.27.3 1.711.6 2.6#7. 6 2
16、. 410. 1 2. 3#5. 7 1. 6 IR 1 d15.3 3.6#9.4 2.726.3 4.1#12. 5 3. 417. 7 3. 5#9. 3 2. 5 IR 3 d13.3 3.3#6.3 2.118.7 3.8#8. 4 3. 114. 2 3. 1#7. 5 2. 0 IR 5 d11.7 2.8#5.9 1.616.4 5.1#7. 6 2. 510. 4 3. 5#6. 9 1. 6 IR 7 d5.4 1.7#3.2 1.312.3 2.9#3. 6 1. 47. 2 1. 8#3. 7 1. 2 #P 0. 05，#P 0. 01 vs CA3；#P 0. 05
17、，#P 0. 01 vs IC；P 0. 05，P 0. 01 vs IR 933中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Mar； 22 （3） 鼠爬行格子数明显减少， 行为学异常改善。具体的 作用机制尚不十分清楚， 可能与 ERK、 JNK 对 AP-1 的调节有关， AP-1 是 Fos、 Jun 蛋白通过亮氨酸拉链 形成的同源或异源二聚体， 通过与靶基因启动子上 游的 AP-1 位点结合， 调控神经细胞的生长、 分化和 损伤修复。 综上所述， 我们认为 ERK 通路是神经元的存活 通路， JNK 通路参与了神经元损伤。IP 可能通过抑
18、制 CA1 区 JNK 磷酸化， 增强 CA3 区 ERK 活性而保 护海马细胞。应用 MAPK 特异性抑制剂和激动剂， 重视对其上游和下游成分的研究， 有助于进一步认 识这一复杂的网络信号传导系统， 最终揭示其在 IP 中的作用及机制， 为临床防治缺血缺氧性疾病提供 有效手段和理论依据。 参考文献： 1 Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M， et al. Ischemic tolerance phenomenon found in the brain J . Brain Res， 1990， 528 （1） ： 21 -4. 2 Ahn N G. The MAP
19、kinase cascade：Discovery of a new signal transduction pathway J . Mol Cell Biochem， 1993， 127 -128： 201 -8. 3 Colbourne F，Corbett D. Delayed and prolonged postischemic hy- pothermia is neuroprotective in the gerbils J . Brain Res， 1994， 654 （2） ： 265 -9. 4 Miranda S， Foncea R， Guerrero J， et al. Oxi
20、dative stress and upreg- ulation of mitochondrial biogenesis genes in mitochondrial DNA- depleted Hela cells. Biochem Biophys Res Commun， 1999， 258 （1） ： 44 -9. 5 Colbourne F， Corbett D. Delayed postischemic hypothermia：A six month survival study using behaviorl and histological assessments of neuro
21、protection J . J Neurosci， 1995， 15 （11） ： 7250 -60. 6 Hu B R，Liu C L， Park D J. Alteration of MAP kinase pathways after transient forebrain ischemic J . J Cereb Blood Flow Metab， 2000， 20 （7） ： 1089 -95. 7 Namura S，Iihara K，Takami S， et al. Intravenous administration of MEK inhibitor U0126 affords
22、brain protection against forebrain ischemic and focal cerebral ischemic J .Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98 （20） ： 11569 -74. The expression and role of ERK and JNK in cerebral ischemic preconditioning in gerbil WANG Yao-qi1， 2，LI Jun2，CAO Hong2， LI Guang-ming2， ZENG Yin-ming2 （1. Dept of Anesthesia
23、，the First Affiliated Hospital of Chinese Medical University， Shenyang 110001， China； 2. Jiangsu Province Key Lab of Anesthesiology Xuzhou Medical College， Xuzhou 221002， China） Abstract： Aim To explore the expression and role of ERK and JNK in cerebral ischemic preconditioning in gerbil. Methods Fo
24、rebrain ischemia was induced by occlusion of bilateral carotid arteries. Gerbils were ran- domly divided into sham group （SH） ，ischemic-pre- conditioning control group （ IC） ，ischemic-precondi- tioning group （IP） ， ischemia-reperfusion group （IR） . The gerbils were killed in 15 min， 2， 4， 6 h， 1， 3，
25、 5 and 7 d in each group following reperfusion. Open field test was used to examine the behavioral deficit in the due time. The number of surviving and apoptosis neurons in hippocampal CA1/3 region was counted，and the activity of p-ERK and p-JNK in hippocampus was de- tected using SP immunocytochemi
26、cal technique. Re- sults The behavioral mark and the number of apopto- sis neurons in hippocampal CA1 region in group IP were much less than that in group IR（P 0. 01） ，no expression of p-ERK was detected in CA1 region in each group，but the levels of p-JNK were markedly ex- pressed in CA1 region，espe
27、cially at 1d after reperfu- sion. The levels of p-JNK in CA1 region were much lower in group IP than that in group IR（P 0. 01） ， and the expression of p-ERK in CA3 region was signifi- cantly enhanced in IP group（vs IR，P 0. 05，P 0. 01） .Conclusion Cerebral ischemia caused p- ERK and p-JNK to be expre
28、ssed differently in gerbil hippocampal regions.Ischemic-preconditioningmay protect gerbil hippocampal neurons from ischemic inju- ry through inhibiting the expression of p-JNK in CA1 region and enhancing the activity of p-ERK in CA3 re- gion. Key words： ERK；JNK；IP；cerebral ischemia；gerbil 043中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 Mar； 22 （3）