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1、!“#$%87?498 4=4AA978 7B !“#$%8 ?)A E8%A%)8， 355? ! DCE45?9F4： 37 -879: ; D BC7;:E9 C7F 7C ?G;7EFFG9: ?9;EI7H ?DD?HJ G4?37 : IH +3%/+ C7F ;C7F ;:C E: ;GC;7887K: IH ;C?9D:-;: E9;7 ; ;7CF: IH GDE9= ;7C 3*.4J 3:- ?DD?H ME; 79 ;E-?;E79 2HD;:F （,:K 09=8?9 ZE7% 8?ID 公司） 。B03 V“? 蛋白表达及纯化系统 （,7L?% =:9 公司） 、
2、凝胶 .,( 回收试剂盒及 /+ 纯化试剂 盒 （均为 ,7_ Q“)Q“ 7D;?C 公司） ； 超速离心机 （Z:-MF?9 1 a# 型） 、 .,( 扩增仪 （/0 公司， Q5# 型） ，酶标仪、 洗板器 （ZE7%3:M 公司） 、 电 泳仪、 紫外仪、 低压层析仪 （均为 /!?A:!69;?!;?;“ 胶 回收 X.C （W6#,“ :NC “YZ +(S)I） 作目标 8“# 回收。 M?#F;?;J进行转化， 培养后分别接种单菌落于 %) E- FR 中 J)* +I) TQ E.0 培养过夜， 按 %L 比例转接至 2) E- FR 中， 再 于 J)* +I) TQ E
3、.0 培养约2 小时， 使 ;R% 菌液 83) 达到 )K I 左右， P?%)H8J达到 )K + 左右， 降温 %(*培 养 % 小时。取出 % E- 离心沉淀菌体作表达空白对 照， 加入 69;, 至终浓度为)KJ EEY-Q F。于 %(*培养 %3 小时， 离心收集菌体， 进行 A8A 电泳鉴定。 !“ #“ )$ 纯化$ $6#+ 粗制品的取得： 2) E- 菌液离 心后收集的菌体， +)*放置过夜。然后悬浮于 +2 E- 细胞裂解缓冲液 （含溶菌酶和 8“# 酶“） 。%)* 水浴+) 分钟， I*、 %) ) TQ E.0 离心% 小时， 小心取 出上清液， 用滤纸过滤即为粗
4、制品。%融合蛋白的 纯化： M?#F;?; 分析。 的 6#+ 进行生物素化。 !“ #“ +$ 免疫分析$ 用 !A! 6#+ 测定试剂盒对二种 表达蛋白进行分析。取 M?#F;?;F6A# （双抗原夹心法） 的建立$ 将表达纯 化的带有 ?R9 的 6#+ 包被到酶标板孔内， 封闭后， 加入生物素化的带有 ,A; 的 6#+ 和待测样品到反 应孔内， 孵育后， 倒尽内液。加入过氧化物酶标记的 链酶亲和素， 经反应、 洗板、 ;?R 显色， 最后于 I2) 0E 读数。 #$ 结果 #“ !$ 人胰 !“# 的提取及对 6#+ 的 78“# 进行 8“# 扩增$ 由于条件的限制， 所取得的胰
5、脏标本还不是 绝对新鲜， 约在 I*放置 J 小时， 并且没有用液氮速 冻， 所以 !“# 有部份降解， 电泳只能看到从 3 )K + 45 的带状，但从 9:! 及蓝白斑筛选结果看， 效果仍 非常理想， 所有的白斑均为阳性克隆。 #“ #$ 6#+ 和 M?#F;?;?ABC D? 酶解 和非酶解的蛋白的抑制作用相同。而对照管无抑制 作用， 这表明融合蛋白的存在与否并不影响目标蛋 白的抗原性， 见图 %。 !“ $一次洗板 1-!.“ 的建立$取 # !+, *:8?80: 1234567 80823: 0: :67231A32:/ =BAI： EJ /=“ *?C5IC； #J !K“;E
6、# 陈; 浩， 翁秀芳， 吴雄文 !“ #$% 人 !#, 基因的克隆及表达I 1 华 中科技大学学报 （医学版） ， #(Z； NN （+） ： +:Z1 Z; PCT8C7T - %， 7CE=7 I， 73,89D=7 I 6 !“ #$% %=E： 7=F34B89D C9B A7VEC448TC839 3F ,34=AH4=E =?7=EE=B 89 AC44CD=E C9B 7=A3,G89C9 Y*:A ?73=89I 1 I !,H: 93934 P=?7=EE89D A4CEE “ ,34=AH4=EI 1 A8=9A=， +LL(； #ZM： N 房崇芸， 吴雄文， 韩军艳 !“ #$% 长期混合淋巴细胞培养:细胞毒实 验模型的建立I 1 中华器官移植杂志， #(+； # （） ： #*:#*L1 +; 吴雄文， 梁智辉1 实用免疫学实验技术P 1 武汉： 湖北科学技 术出版社， #(#： +L:+ 修回 #(:+:# 徐; 杰） +#潘晓平等; !K“+# 的表达及人抗 !K“+# 抗体测定方法的建立; 第 N 期