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1、!“#$% 及其变异体真核表达载体的构建表达与亚细胞定位! 王育文! 许勇臣! 姜晓峰! （哈尔滨医科大学附属第二医院检验科， 哈尔滨 “#$%4?7=55:34 3 A8B;4 :46=7C=8D:4#$% ;4?229A?=B8-?: +:AC:“( （)*+,“(） ?:I C;I )C8=;9:L9HHH?= H89? ;C8: E=8;C8: E=89;C8: J: )= L9HHH?= H89?;C8: E=898=;9:I 9H;M 2349C85:34： 7* DE=;C8: F9;C8: E=8999;GHHB ?:I D E=;I C: 2345 9HH;M 0;C8: E
2、=8AC:“(； O8=;9:;C8: E=8E=49=CE?, 的 -C4条件下 培养 4 小时收集细胞。以 +DEF;-/参照 -+;- 试剂盒说明书， 以 C2E9DE1JD (O * 设计三条引物： )： (P;,;,II ,+;,+II;I;+I+I,;0P； 4： (P;,;I, +;+;,I+I,;I+;+;I0P； 4P： (PI,;I, ,+;+;,I+I,;+I+ ;+;I;0P。上述下划线 部分分别为 KL1? “、 “H)、 4 组 成一对引物， 扩增产物为 QN#%)0 基因全长 C-R； )、 4P作为一对引物诱变获得 1N#%)0 基因 C-R。 引物由上海生工合
3、成。分别以 ) S 4、 ) S 4P为 引物对 H3., 进行扩增， 反应体系 (* !2。扩增条 件： TB 4 分钟； TB 0* 秒， (B 0* 秒， A4B 0* 秒， 0* 个循环。扩增结束后， 分别取0O * !2 ;- 产物在 48琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。 !“ #“ %$ QN#%)0、 1N#%)0 基因的克隆及鉴定/ 纯化 的 ;- 产物及 UV;)W 质粒经 KL1? “、 “HQN#%)0、 “IR1N#%)0 重组融 合蛋白表达载体/用 ?E=G $、 “H;0 分别进行酶切后， 经定向连接、 转化及筛选， 从阳性 克隆中提取质粒进行初步鉴定并送测序。 !“
4、#“ $ 重组融和蛋白表达载体转染 ;C$A 细胞/ 将培养状态良好的 ;C$A 细胞按适宜比例接种于 4 孔培养板中培养 )W X 4 小时， 使细胞达到 (*8 XW*8 融 合。分 别 用 “IRQN#%)0、“IR 1N#%)0 两种重组质粒制备梭华$;0 质粒 3., 的阳性 对照组及不转染任何质粒 3., 的阴性对照组。 !“ #“ ($激光扫描共聚焦显微镜观察/转染后的 ;C$A 细胞， 在 4 孔板中培养 )4、 4 和 W 小时后， 以 WW =1 激发光波长， 分别用激光扫描共聚焦显微 镜观察蛋白表达情况及其在细胞内的定位。 #$ 结果 #“ !$QN#%)0、 1N#%)
5、0 基因的克隆及鉴定/-+ ;- 扩增得到的两种产物经 48 琼脂糖凝胶电泳显 示均为约 )T U 片段， 清晰明亮， 大小与设计一致， 见图 )。将产物分别克隆入 UV;)W 质粒的多克隆 位点 &;$ 中， 重组体用 KL1? “、 “HQN#%)0、 “IR1N#%)0 重组融合蛋白 表达载体的构建与鉴定/进一步将 UV;)WQN#% )0、 UV; )W1N#%)0 用 ?E=G $和 “H;0 上相应的酶切位点， 使插 入基因的读码框架与 “IR 保持一致， 构建 “IR QN#%)0、 “IR1N#%)0 融合蛋白真核表达载体。 转化后获得的重组体经 KL1? “、 “HQN#%)
6、0、 “IR1N#%)0 融 合 蛋 白 在 ;C$A 细胞的表达与定位/ 利用阳离子脂质体法将 重组体转染 ;C$A 细胞后， 用激光共聚焦显微镜观 察融合蛋白的表达与分布情况。转染 )4 小时后， “IRQN#%)0、 “IR1N#%)0融合蛋白即有表达， 图 !$ )*+,-) 扩增产物 ./0“ !$ 1234/5/678/9: 95 ;? )*+,-) . #B$ #B$ -(-!， 全长 5， 由 5 个外显子和 - 个内含子构成， 其 .?A 为 !， 其中编码 +,(!- 的 0? 个氨基酸组成， 其 末端;“ 个氨基酸残 基为信号肽， 以非糖基化蛋白的形式分泌， 相对分子 质
7、量约 !; “， 成熟的 +,(!- 含 !; 个氨基酸残基。 自 !BB; 年 +,(!- 被发现至今， 众多学者对其进 行了大量研究， 发现其具有多种生物学活性， 与多种 临床疾病密切相关， 其中与哮喘的关系尤其为人们 所重视。研究表明 +,(!- 主要通过与靶细胞上的功 能性受体结合， 活化 DAE(18A8 途径而发挥生物学 功能 3， 2。+,(!- 能够促进 F 细胞合成 +G$， 引起气 道高反应性 （AH?） 、 气道炎症、 黏液过度分泌、 嗜酸 粒聚集等， 在哮喘的发病机制发挥重要作用 7(!“。 +,(!- 存在多种多态性， 但只有外显子 5 的突变可引 起 +,(!- 第
8、 !-“ 位氨基酸改变 （%IJ!-“AKG） ， 进一步 研究证实， 该变异体蛋白与哮喘相关而与 +G$ 水平 无关。由于此位点是 +,(!- 与其受体结合的关键区 域， %IJ!-“AKG 可能在 +,(!- 活性及其与受体相互作 用中发挥重要作用 !。动物模型显示这种变异体 可能通过新的组分传递信号进而引发哮喘， 而相关 研究目前未见报道 !;。如果能够了解这种与哮喘 密切相关的变异体在哮喘中的具体机制， 将会为哮 喘的治疗提供新的作用靶点。因此， 对于这种变异 体蛋白的研究显得十分必要。 本次实验利用基因重组技术， 构建了以 $%、 ;5 和 57 小时分 别用激光共聚焦显微镜观察。转
9、染后 !; 小时即可 见少量阳性细胞中已有绿色荧光出现。随着时间的 延长， 融合蛋白表达量增加， 荧光强度明显增强， 57 小时表达最高。亚细胞定位显示， 第 !-“ 位 AKG! %IJ 的变异没有影响 *+,(!- 分子的天然分布和分子 生物学行为， $%“； ! （!） ： !BR ;L PQIIO(ENKC M， ,WYQ.NQ D， W !“ #$R +JVSKISW=QJ(!-： XSJVKNI .SUQ( NVTK TZ NIISKGQX NOV*.ND R 1XQSJXS， !BB7； ;7 （9-B2） ： ;97R -L %KNSO $， ENITJSJ M， HTISKG
10、 / D !“ #$R A XIWOVSK TZ OSSJ VQG*VIY IQJ=SU CTIY.TKC*QO.O QJ V*S +,(!- GSJS QO NOOTXQNVSU )QV* VTVNI OSKW. +G$ ISSIO QJ V*KSS CTCWINVQTJO TZ )*QVS X*QIUKSJD R D AIISKGY /IQJ +WJTI， ;“； !“9 （-） ： 9“3R 5L HT)NKU 8 4， P*QVVN=SK A， NQ.NJ A , !“ #$R +USJVQZQXNVQTJ NJU NO( OTXQNVQTJ TZ CTIY.TKC*QO.O QJ V
11、*S QJVSKISW=QJ(!- GSJS )QV* NOV*.N NJU NVTCY QJ N 4WVX* CTCWINVQTJD R A. D ?SOCQK /SII MTI FQTI， ;“!； “!;中国免疫学杂志 ;“3 年第 ; 卷 !“ （#） ： #$% “,; /?0( % ( A-， !)!； )D （)） ： !$D% $ 细胞凋亡发生机制 涉及 N#O 途径。至于 KL9,= 再刺激诱导 “#; 细胞 凋亡发生机制是否涉及 K,58 途径中的 H78 和 (, 等亚家族成员， 以及 N#O 途径在 KL9,= 再刺激 诱导 “#; 细胞凋亡发生机制中的地位与具体作用，
12、 还有待于进一步研究阐明。 5B#8 是 ; 细胞内重要的信号转导分子， 其在 ;A7 AS# 活化信号、 BU9! BU9!7 信号、 8 细胞活化 信号的转导中均起一定的作用， 另外亦证实 5B#8 在 AS!O 介导的 “#; 细胞活化信号的转导中起着十分 重要的作用 #， *。5B#8 由一个催化亚基 （5)） 和 一个调节亚基 （5O“） 构成。5) 与蛋白激酶同源， 可催化肌醇环上 # 位羟基生成 #， * 二磷酸磷脂酰肌 醇 （5B9#， *95!） 和#， *， “ 三磷酸磷脂酰肌醇 （5B9#， *， “95#） ， 它们均可作为第二信使在 “#; 细胞活化中 传递信号 “。
13、UZ!D*)! 是 5B#8 的特异性抑制剂， 它通过竞争性拮抗 ,;5 与 5) 的结合使 5B#8 失去 活性而阻断 5B#8 活化途径 +。为了探讨 KL9,= 诱 导 “#; 细胞凋亡是否与 5B#8 有关， 我们用 UZ!D*)! 处理 “#; 细胞， 然后再给予 KL9,= 刺激， 结果发现 ) ) $J- U UZ!D*)! 部分阻断 KL9,= 再刺激诱导 “#; 细胞的凋亡 （凋亡抑制率为 *# _） 。因此我们 推测 KL9,= 再刺激诱导 “#; 细胞凋亡发生机制涉 及 5B#8。但有关 5B#8 在 KL9,= 再刺激诱导 “#; 细胞凋亡信号转导中的具体作用， 还有待
14、于进一步 研究阐明。 !“ 参考文献 G.-/( % B1R.G B61， DD*； +! （!） ： “9“O% !9G.- /6L/./ .2 LE a0/ 012 =301WE. 4 L6 JR ;a90-N?0( % ( U.6MJG 4 RJ3 G0/N0/.9O aUBAH ?. ?. a0/9J 4 JR ?. a0/ a0/ -?V0E ? JR KEGJL0G.3?. -J/ JR =2; G.-/ V30G.-6-03 /.2 MJ=.190G.2 N3J.?V0E 2./ AS* C.3/6/ ASO -.1 ?. ?E6/( % ( B61J-， DDD； +# （!）
15、 ： $“9$!% ! 8，A062.- H T，: JR K88! H78 L6 1J N#O M?V0E( % ( B61J-， !)； +* （!） ： +!*9+!“% #& H2.02 A H，50.- Z B，FJ3 N3J9 .J39%4 LE AS!O /? N?J/N?0J- #9M-.E U A% 5?J/N?J ?. /?. 00-03=. JR 30N0EG?. N?J/9 N?JJ3/，VJ30111 012 UZ!D*)!( % HK4c (， DD+； “： “!“+9“!+$% 收稿 !)“9)$9!D& 修回 !)“99! （编辑& 许四平） !王育文等& BU9# 及其变异体真核表达载体的构建表达与亚细胞定位& 第 # 期