HIF-1α及VEGF在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的作用.pdf

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1、江西医学院学报2 0 0 9 年第4 9 卷第1 0 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a ed i a n g x i2 0 0 9 。V o l4 9 N o1 0 H I F - l a 及V E G F 在大鼠视网膜 缺血再灌注损伤中的作用 张小年。游志鹏。汪昌运 ( 南昌大学第二附属医院眼科，南昌3 3 0 0 0 6 ) 1 9 摘要：目的探讨缺氧诱导因子一l a ( H I F 一1 a ) 及血管内皮牛长网子( V E G F ) 在大鼠视网膜缺m 再灌注损伤中的作 用。方法建讧大鼠视网膜缺m f l f 灌注模型。7 0 只S D

2、 大鼠随机分为缺m 阿灌注组和对照组每组3 5 只。缺血 再灌注组大鼠结扎左侧颈总动脉。对照组大鼠左侧颈总动脉不结扎。每组按再灌注后小同时间段f l f 分为1 、6 、1 2 、 2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 组每组5 只人鼠。以免疫组织化学法榆测视 I ) 9 膜I | IH I F 一1 口和V E G F 的表达。结果缺吼阿灌 注组在阿灌注后6h 开始榆测到H I F V 一1 n 和V E G F 有表达。2 4h 表达最强。对照组未检测到H I F l a 和V E G F 的 表达。结论H I F - I a 在视网膜缺I 缸 l 灌注损伤中发挥霞要作t t l ，

3、V E G F 在视网膜缺m f l 灌注损伤中的表达I | 能受 H I 卜1 a 的诱导而发挥作用。 关键词：缺氧诱导因子l a ；血管内皮生长因子；缺血再灌注损伤；视网膜疾病；动物。实验；大鼠 中图分类号：R 一3 3 2 文献标识码：A 文章编号：l o o o 一2 2 9 4 ( 2 0 0 9 ) 1 0 - - 0 0 1 9 - - 0 3 T h eE x p r e s s i o no fH I F 一1 伍a n dV E G F i nR a t SR e t i n aI n ju r e db yI s c h e m i a r e p e r f u s i

4、 o n Z H A N GX i a o - n i a n ，Y O UZ h i p e n g 。W A N GC h a n g - y u n ( D e p a r t m e n to O p h t h a l m o l o g y ，t h eS e c o n dA i l i a t e dH o s p i t a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y ，N a n c 。h a n g3 3 0 0 0 6 ，C h i n a ) A B S T R A C T ：O b i e c t i v e T oi n v e

5、 s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fh y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r la l p h a ( H I F l a ) a n dv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( V E G F ) i nr a t Sr e t i n ai n j u r e db yi s c h e m i a r e p e r f u s i o n M e t h o d s T h em o d e lo fr e t i n

6、a li s c h e m i a r e p e r f u s i o nw a ss e tu pi n7 0S Dr a t s ，w h i c h w e r ed i v i d e di n t ot w og r o u p sw i t h3 5r a t si ne a c h ：i s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u pa n dc o n t r o lg r o u p T h ec o m m o nc a r o t i da r t e r yo fe a c hr a tw a sl i g a t e d

7、 ，a n dt h er i g h ts i d ew a st h ec o n t r 0 1 E v e r yg r o u p w a ss u b d i v i d e di n t og r o u p1 ，6 ，1 2 ，2 4 ，4 8 ，7 2a n d1 4 4h o u r sa f t e ri s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y ，a n d w i t h5r a t si ne a c hg r o u p P r o t e i n so fH I F l ea n dV E G Fw e r e

8、m e a s u r e db yI m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( I H C ) m e t h o di nr a t Sr e t i n a R e s u l t s I ni s c h e m i a r e p e r f u s i o ng r o u p ，e x p r e s s i o no fH I F 一1 a a n dV E G Fw a sd e t e c t e da tt h e6h o u ra f t e ri s c h e m i a r e p e r f u s i o n 。r e a

9、 c h e dt h eh i g h e s tl e v e la tt h e 2 4h o u r ，a n dw e a k e n e dg r a d u a l l yl a t e r N oe x p r e s s i o n so fH I F l aa n dV E G Fw e r ef o u n di nt h e c o n t r o lg r o u p C o n c l u s i o nH I F 一1 aa n dV E G Fm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nr e t i n a li s c

10、 h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y ，a n dt h et w of a c t o r sm a yr e l a t i v et ot h er e t i n a li s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y K E YW O R D S ：h y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r - l a l p h a ；v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ； r e

11、 p e r f u s i o ni n ju r y ；r e t i n a ld i s e a s e ；a n i m a l s ，l a b o r a t o r y ；r a t s 视网膜缺血再灌注损伤的机制，目前大多数学者认为其是一个多因素综合作用的结果，它包括氧 收稿日期：2 0 0 9 - - 0 6 2 2 作者简介：张小年( 1 9 8 3 一) 。女，硕士。住院医师，主要从事青光眼的临床诊疗研究。 通信作者：游志鹏，博士主任医师。教授。E m a i l ：y z p 7 4 s i n a c o r n 。 万方数据 2 0 江西医学院学报2 0 0 9

12、年第4 9 卷第1 0 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a eJ i a n g x i2 0 0 9 ，V o l4 9 。N o1 0 自由基的作用、微血管损伤和白细胞的作用以及细 胞内钙的超载现象等。缺氧诱导因子一1 a ( h y p o x i a i n d u c i b l e a c t o r la l p h a ，H I F - 1 a ) 是缺氧条件下 广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，能激 活许多缺氧反应性基因的表达，是哺乳动物和人在缺 氧条件下维持氧稳态的关键性物质心 。H I F - l a 是缺 血缺氧诱

13、导细胞产生的核转录因子，能诱导下游血管 内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ， V E G F ) 基因的表达 3 。本研究以免疫组织化学法 检测H I F l a 及V E G F 在大鼠视网膜缺血再灌注损 伤中的表达，探讨H I F - l a 及其诱导的V E G F 在视 网膜缺血再灌注损伤的作用。 1 材料和方法 1 1实验动物及分组 健康S D 大鼠7 0 只( 由南昌大学医学院动物科 学部提供) ，体质量2 0 0 2 5 0g ，鼠龄8 1 0 周，雌雄 不限。随机分为缺血再灌注组

14、和对照组，每组3 5 只。每组按缺血再灌注后不同时间段再分为1 、6 、 1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 组，每小组5 只大鼠。 1 2 主要试剂 小鼠抗大鼠H I F l a 单克隆抗体购自美阁N e o - m a r k e r s 公司，小鼠抗大鼠V E G F 单克降抗体购自 美国s a n t ac r u z 公司。兔抗鼠S P 一9 0 0 0 试剂盒、 D A B ( Z L I 一9 0 3 2 ) 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生 物技术有限公司。 1 3 视网膜缺血再灌注模型的建立 结扎大鼠左侧颈总动脉建立视网膜缺血再灌注 模型。将戊巴比妥按3 0m

15、 g k g 的剂量对大鼠进行 腹腔内注射。酒精消毒颈部皮肤，沿颈正中剪开皮 肤、皮下组织、肌肉层，分离出气管前筋膜，剪开气管 前筋膜，找出其左侧颈总动脉，以丝线结扎。以0 5 的托品卡胺充分散瞳，直接检眼镜观察眼底，以视网 膜颜色苍白为缺血形成的标志。右侧作为自身对照 眼。结扎1h 后，松开丝线。对照组除左侧颈总动 脉分离后不结扎外，其它方法同前。分别在缺血再 灌注后1 、6 、1 2 、2 4 、4 8 、7 2 、1 4 4h 行断颈处死大鼠， 迅速取出眼球，4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。 1 4 免疫组织化学实验法 采用链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶连接法 ( S P 法) 进行检

16、测，依照试剂说明书：石蜡切片置烤 箱5 5 6 0 约l 2h 以防脱片，常规脱蜡，双蒸水 漂洗5m i n 3 次；切片放入p H6 0 的柠檬酸盐缓 冲液，置高压锅中水浴加热至沸腾，保持喷气2r a i n 后，再室温自然冷却约3 0m i n ，P B S 漂洗5r a i n 3 次；加3 双氧水灭活内源性过氧化物酶，置室温 5 1 0m i n ，蒸馏水漂洗5m i n 3 次；滴加正常山羊 血清封闭液，室温孵育2 0m i n ；滴加1 ：1 0 0 稀释的 小鼠抗大鼠H I F - l a ，1 ：2 0 0 小鼠抗大鼠V E G F ， 4 过夜，P B S 漂洗5m i n

17、X3 次；滴加生物素标记 的山羊抗兔I g G ，置搴温2 0m i n ，P B S 漂洗5r a i n 3 次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，3 7 孵育 1 0 1 5m i n 。P B S 漂洗5m i n 4 次；滴加D A B 显 色剂，镜下控制显色，自来水充分漂洗；苏木精复染 约2 5S ，1 盐酸酒精分化约5 0S ，氨水返蓝，自来水 充分漂洗；苏木精轻度复染，脱水、透明、封片，光学 显微镜观察拍照。阴性对照：根据双盲法原则，以 P B S 液代一抗，其余步骤同上。 采用I m a g e P r oP l u s5 0 图像分析系统进行图 像分析，H I F - l a

18、 与V E G F 免疫组化染色切片，阳性 染色为棕黄色，每个标本各取一张，在同一放大倍率 下随机选择5 个不同视野，测最窗口区域内的累计 光密度( I O I ) 值) ，取平均值。 1 5 统计学方法 实验数据以S P S S1 3 0 统计软件包处理，采用 单因素方差分析，实验数据以i 5 表示，P 0 0 5 判定差异有显著性。 2结果 2 1 视网膜中H l F - l n 蛋白的表达 缺血再灌注组视网膜中H I F - l a 在再灌注后6h 开始表达，在2 4h 表达最强，可见H I F l a 主要在视 网膜神经节细胞层表达，内核状层亦可见少量表达。 对照组在缺血再灌注后未能检

19、测到H I F - l a 的表 达。2 组视网膜缺血再灌注各时段H I F l a 蛋白平 均光密度( I O D ) 的变化见表1 。 表12 组视网膜缺血再灌注各时段H I F - l a 蛋白平均I O D 值的变化( i 士s ) 与对照组比较，* P = 0 0 0 0 I 与2 4h 比较G P = 0 0 0 0 万方数据 2 2 视网膜中V E G F 蛋白的表达 缺血再灌注组视网膜中V E G F 在再灌注后6h 开始表达，在2 4h 表达最强，可见V E G F 主要在视 网膜神经节细胞层，内核状层亦可见表达。对照组 2 l 在缺血再灌注后未能检测到V E G F 的表达

20、。2 组视 网膜再灌注各时段V E G F 蛋白平均1 0 D 值的变化 见表2 。 表2 各组视网膜缺血再灌注各时段V E G F 蛋白平均I O D 值的变化( i 士$ ) 与对照组比较。* P = o 0 0 0 与2 4h 比较A P = 0 0 0 0 3 讨论 视网膜缺血再灌注损伤是一种较为常见的临床 疾病。如视网膜中央动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、缺 血性视神经病变、糖尿病视网膜病变等，均可造成不 同程度的视网膜缺血，在血液再通后，视功能反而下 降，视网膜损伤加重。因此，积极探索其发病机制和 有效的药物治疗方法，具有重要的临床意义。 现已证实H I F l a 有调节红细胞生成、铁

21、代谢、 血管形成和葡萄糖代谢等多种功能。这些H I F l a 的靶基因产物在肿瘤的细胞代谢、新生血管生成、肿 瘤增殖、侵袭和转移中也具有重要的作用，V E G F 即是其中的一个靶基因。H I F - l a 可诱导V E G F 的 表达、促新生血管形成 3 。H I F - 1 a 与缺血性视网膜 病变有密切的关系，并可诱导V E G F 的表达增加。 O z a k iH 等 4 在缺血性视网膜病变模型中研究表 明，V E G F 是H I F 1 a 的靶基因之一，调节V E G F 的 表达可能是H I F l a 参与早产儿视网膜病变( R O P ) 发病的重要作用机制之一。T

22、 r e i n sC 等 5 对增生 性糖尿病性视网膜病变时的视网膜检查发现，视网 膜色素上皮细胞( R P E ) 在增加表达V E G F m R N A 的同时，H l F - 1 a 的表达也明显增加，推测H I F - I a 的表达是缺氧状态下导致视网膜新生血管生成的关 键。国内外研究发现在缺氧条件下培养的人R P E 细胞中的H I F - l a 能诱导V E G F 的表达；张鹏等 研究证明缺血缺氧可通过H I F _ 1 a 上调人R P E 细 胞V E G F 的表达；B h i s i t k u lR B 等 7 1 在体外R P E 细胞缺氧培养下，使用R N

23、A 干扰抑制H I F - 1 a 基因 表达时，V E G F 的表达亦被显著性的抑制，表明 H I F - 1 a 是缺氧条件下视网膜新生血管的始动因素。 本研究结果显示，在缺血再灌注后6h 开始大 鼠视网膜中有H I F - 1 a 的表达，并逐渐增强，在2 4h 时达到最高峰。说明在缺血再灌注损伤时，H I F l a 已被激活。H I F l a 的活化方式有多种，其中缺血、 缺氧是H I F - I a 重要的活化方式之一，活化后的 H I F 一1 a 能调节多种细胞因子的表达。H I F - 1 a 调节 多个靶基因的表达。H I F l a 的靶基因主要包括以 下几种：红细胞

24、生成素( E P 0 ) 编码基因；V E G F 编码基因；葡萄糖载体蛋白1 ( G T 一1 ) 和糖酵解酶； 血红素加氧酶1 ( H O - 1 ) 和诱导型N o 合酶( i N 一 0 S ) 编码基因。这些基因的转录增加可促进细胞在 缺氧状态下的适应 8 。 本研究结果显示，在缺血再灌注后6h 开始大 鼠视网膜中有V E G F 的表达，并逐渐增强，在2 4h 时达到最高峰。而V E G F 作为H I F 1 a 的下游因 子，其在缺血再灌注组视网膜中的表达可能与 H I F - 1 a 的转录有关，其表达上调可能是H I F - l a 诱 导的结果。H I F - I a 与

25、多种疾病有关，目前已涉及到 许多领域研究其激活机制和信号转导通路，已证实 它能诱导多种靶基因，造成组织的损伤。 综上所述，研究H I F 一1 a 及V E G F 在视网膜缺 血再灌注损伤中的表达，探讨H I F - I a 在视网膜缺 血再灌注损伤发展进程中的机制，对临床以H I F - I a 为靶基因治疗各种视网膜缺血性疾病提供了新思 路。 参考文献： i - 1 3T s u j i k a w aA ，O g u r aY ，H i r o s h i b aN ，e ta 1 R e t i n a lI s c h e m i a - r e p e r - f u s i o

26、 nI n j u r yA t t e n u a t e db yB l o c k i n go fA d h e s i o nM o l e c u l e so f V a s c u l a rE n d o t h e l i u m J I n v e s tO p h t h a l m o lV i sS c i ，1 9 9 9 。4 0 ( 6 ) I 1 1 8 3 1 1 9 0 2 3 B r a c k e nCP ，W h i t e l a wML 。P e e tDJ T h eH y p o x i a - i n d u e i b l e F a

27、c t o r s ；K e yT r a n s c r i p t i o n a lR e g u l a t o r so fH y p o x i cR e s p o n s e s 口 C e l lM o lL i f eS e i ，2 0 0 3 ，6 0 ( 7 ) ：1 3 7 6 1 3 9 3 3 L a n d oD ，G o r m a nJJ 。W h i t e l a wML ，e ta 1 O x y g e n - d e p e n d e n t R e g u l a t i o no fH y p o x i a i n d u e i b l

28、 eF a c t o r sb yP r o l y la n dA s p a r 。 a g i n y lH y d r o x y l a t i o n J E u rJB i o c h e m 2 0 0 3 ，2 7 0 ( 5 ) I7 8 1 7 9 0 4 O z a k iH ，Y uAY 。D e l l aN ，e ta 1 H y p o x i aI n d u c i b l eF a c t o r - l a l p h ai sI n c r e a s e di nI s c h e m i cR e t i n alT e m p o r a la

29、 n dS p a t i a l C o r r e l a t i o nw i t hV E G FE x p r e s s i o n J I n v e s tO p h t h a l m o lV i s S c i 。1 9 9 9 。4 0 ( 1 ) 1 1 8 2 - 1 8 9 ( 下转第4 0 页) 万方数据 4 0 江西医学院学报2 0 0 9 年第4 9 卷第l O 期 A c t aA c a d e m i a eM e d i c i n a eJ i a n g x i2 0 0 9 ，V o l4 9 ，N o1 0 作。气腹压力设定以能保证手术野暴露

30、的最小压力 为宜，本院妇科腹腔镜术中气腹压力设定为1 5 9 6 k P a 以下，较为合适。 2 ) 术中并发症及相关因素。本组资料术中并 发症均为子宫全切术中出现，其中输尿管损伤1 例， 髂外动脉损伤1 例，2 例均改为开腹手术。术中脏 器损伤主要是膀胱输尿管损伤 2 。3 及肠管损伤。输 尿管损伤可能与举宫不充分有关，在处理子宫动脉 和主韧带时要充分将子宫推向腹腔，使输尿管滑向 两侧以减少损伤。输尿管的电灼伤在术中不易及时 诊断，患者常在术后延迟出现临床表现，症状和体征 与损伤程度有关，最长在术后3 周余才有临床症 状【4 J 。输尿管损伤后立即修补，根据损伤程度行吻 合术或栽植术，放置

31、双管、导尿管，一般预后良好。 在分离盆腔粘连时最好使月j 双极、钝性分离，避免使 用单极，因后者对术者操作要求较高，容易损伤周围 脏器。本组1 例髂外动脉损伤就是用单极分离粘连 时造成。本组中无肠管损伤，可能与术中警惕和重 视及操作有关。为减少术中并发症，在腹腔镜探查 后发现盆腔粘连严重、特殊部位肌瘤、宫角妊娠或其 他情况导致手术难度加大时，适时中转开腹不失为 明智之举，切不町刻意追求低的中转开腹率 5 。 3 )术后并发症与手术种类、手术时间、创面大 小有关。文献报道，术后并发症占总并发症的 1 4 2 。本组术后并发症占总并发症的5 6 O o ， 主要是术后发热，多数( 1 0 1 2

32、) 发生在肌瘤剥除和子 宫全切术后。检查腹部体征、引流液性状及血常规 未见明确感染迹象，经预防用抗生素及解热药物对 症治疗后恢复正常。考虑与手术创面过大、术中电 凝过多、冲洗液存留过多有关。手术创面较大者术 后应用预防性抗生素及支持疗法，保持引流管通畅。 术后并发症还有2 例是腹部切口裂开，均为左下腹 切口。1 例为附件切除术，左下腹0 5c m 切口拔引 流管后；另1 例是肌瘤剥除术放置肌瘤钻的1 5c m 切口。考虑与感染有关。 4 ) 腹腔镜手术并发症的发生率与手术难度有 关。C h a p r o nC 等将腹腔镜手术分为4 类：诊 断性腹腔镜操作及输卵管通液；轻度粘连分离、早 期子宫

33、内膜异位的处理、卵巢囊肿穿刺、输卵管绝育 等；输卵管开窗、异位妊娠、卵巢囊肿、子宫内膜异 位症的处理，盆腔炎症等；( 4 ) 阴式子宫切除、子宫肌 瘤挖除等。诊断性腹腔镜操作的并发症发生率为 0 2 7 ，而腹腔镜手术的并发症发生率为1 8 3 0 2 。据中南大学湘雅二医院报道，腹腔镜下 全子宫切除、子宫肌瘤剔除、附件手术共48 3 2 例， 并发症发生率分别为4 2 2 、1 6 0 、0 7 6 6 。 本组资料与之相比有一定差距，可铑与手术例数较 少有关，有待于进一步大样本研究。 参考文献： 1 C h a p r o nC ，Q u e r l e uD ，M a g eG ，e t

34、a 1 C o m p l i c a t i o n so fG y n e c o l o g i eL a p a r o s c o p y M u l t i c e n t r i eS t u d yo f7 6 0 4L a p a r o s e o p i e s J JG y n e c o lO b s t e tB i o lR e p r o d ( P a r i s ) ，1 9 9 2 ，2 1 ( 2 ) ：2 0 7 2 1 3 2 M a cC o r d i c kC ，L 6 c u r uF ，R i z kE ，e ta 1 M o r b i

35、d i t yi nL a p a r o s c o p i eG y n e c o l o g i c a lS u r g e r y ：R e s u l t so faP r o s p e c t i v eS i n g l e - c e n t e rS t u d y J S u r gE n d o s e ，1 9 9 9 ，1 3 ( 1 ) ：5 7 6 1 3 H a r k k iS i r 6 nP ，S j 6 b e r gJ ，M a k i n e nJ ，e ta 1 F i n n i s hN a t i o n a l R e g i s t

36、 e ro fL a p a r o s c o p i cH y s t e r e c t o m i e s ：aR e v i e wa n dC o m p l i c a t i o n so f1 1 6 5O p e r a t i o n s J A mJO b s t e tG y n e c o l ，1 9 9 7 ， 1 7 6 ( 1P t1 ) ：1 1 8 - 1 2 2 4 吴霞，张建萍，卢丹，等妇科腹腔镜手术并发症相关因素的分 析L J 实用妇产科杂志- 2 0 0 7 ，2 3 ( 2 ) ：9 1 - 9 3 5 范雪梅，张秋实，叶明。妇科腹腔镜手术中转

37、开腹4 5 例临床分 析口 中国微创内科杂志，2 0 0 9 。9 ( 7 ) ：6 2 0 6 2 2 6 夏晓梦，方小玲，黄风英。等妇科腹腔镜手术并发症5 4 例临床 分析【J 中国妇产科临床杂志，2 0 0 9 。1 0 ( 3 ) ：1 7 9 1 8 1 ( 责任编辑：钟荣梅) ( 上接第2 1 页) 5 T r e i n sC ，G i o r g e t t iP e r a l d iS ，M u r d a e aJ ，e ta 1 R e g u l a t i o no fd u c t i o no fV E G Fi nR P EC e l l s ：U p r e

38、 g u l a t i o nb yC o n s t i t u t i v e l y V a s c u l a rE n d o t h e l i a lG r o w t hF a c t o rE x p r e s s i o nb yA d v a n c e d A c t i v eH I F Ia n dI n h i b i t i o nb yR N AI n t e r f e r e n c e J I n v e s t G l y c a t i o ne n dP r o d u c t s l - J 1 JB i o lC h e m 2 0 0 1

39、 ，2 7 6 ( 4 7 ) ：4 3 8 3 6 - O p h t h a l m o lV i sS c i ，2 0 0 4 ，4 5 l D A b s t r a e t 4 5 2 4 3 8 4 1 8 S e m e n z aGL H y d r o x y l a t i o no fH I F - 1 ：O x y g e nS e n s i n ga tt h e 6 张鹏。王雨生，张星等缺氧对人视网膜色素上皮细胞增生和M o l e c u l a rL e v e l J P h y s i o l o g y ( B e t h e s d a ) ，2 0 0 4 ，1 9 ：1 7 6 1 8 2 V E G F 表达的影响 J 眼科新进展2 0 0 4 ，2 4 ( 1 ) ：6 - 8 ( 责任编辑：钟荣梅) 7 B h i s i t k u lRB ，R u a nDT S h e r w o o dJ ，e ta 1 H I F - IM e d i a t e dI n 万方数据