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1、收稿日期2003 - 12 - 25修回日期2004 - 05 - 08 *基金项目浙江省跨世纪学术和技术带头人培养基金 （No.992086） ； 温州市 “551 人才工程” 培养基金 （No.98113） ； 浙江省教育厅科研基金 （No.20000670） 资助项目 Tel：0577 - 88830144，0577 - 88851093；E- mail： 文章编号 1000 - 4718 （2005） 09 - 1739 - 05 HO - 1/ CO 径路在肺缺血 - 再灌注损伤中的作用* 王万铁1， 周伟斌1， 倪世蓉1， 徐正 1， 陈锡文2， 方周溪3 （温州医学院 1病理生
2、理学教研室，2实验动物中心，3电镜室，浙江 温州 325027） 摘要目的： 探讨血红素氧合酶 - 1 （HO- 1） /一氧化碳 （CO） 径路在肺缺血 - 再灌注损伤中的作用。方法： 采用在体兔单肺原位缺血 - 再灌注模型。实验兔 40 只， 随机均分为假手术对照 （C） 组、 肺缺血 - 再灌注 （I- R） 组、 肺 缺血 - 再灌注加氯铁血红素 （H） 组和肺缺血 - 再灌注加锌原卟啉 （Z） 组。分别在缺血前、 缺血后、 再灌注 1 h、 2 h、 3 h 抽血， 检测一氧化碳血红蛋白 （COHb） 浓度。实验结束时取肺组织检测湿干重比 （W/D） 、 肺泡损伤率 （IAR） ，
3、观察肺组 织超微结构的改变、 HO- 1 的活力、 表达部位及强度。结果：血浆 COHb 浓度， I- R 组、 H 组明显高于 C 组， 以 H 组为 著 （P 0.01） ； H 组、 Z 组显著高于、 低于 I- R 组 （P 0.01） 。肺组织 HO- 1 活力 H 组最高， 其次是 I - R 组， Z 组和 C 组最低 （P 0.05 和 P 0.01） 。I- R 组、 H 组、 Z 组 HO- 1 在肺血管内皮、 部分血管平滑肌、 外膜层及部分气道上皮 均有阳性表达， 明显高于 C 组， 尤以 H 组最为明显 （P 0.01） 。W/D、 IAR 值， I - R 组和 Z
4、组均明显高于 C 组， 尤以 Z 组为著， H 组虽较 C 组为高， 但显著低于 IR 组和 Z 组 （P 0.05 和 P 0.01） 。肺组织形态学异常改变， 以 Z 组为著， H 组较轻。结论：HO- 1/CO 径路对缺血 - 再灌注肺发挥积极的保护作用。 关键词 再灌注损伤；肺；血红素氧合酶 （脱环） ；一氧化碳 中图分类号 R363文献标识码 A Role of heme oxygenase - 1/carbon monoxide system in pulmonary ischemia - reperfusion injury WANG Wan - tie1，ZHOU Wei -
5、bin1，NI Shi - rong1，XU Zheng - jie1，CHEN Xi - wen2， FANG Zhou - xi3 （1Department of Pathophysiology，2Centre of Experimental Animal，3Department of Electron Microscope，Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027，China） ABSTRACT AIM：To investigate the effect of heme oxygenase - 1（HO - 1） /carbon monoxide（C
6、O）system on pul- monary ischemia- reperfusion injury （PIRI）in rabbits. METHODS：Single lung ischemia and reperfusion animal model was used in vivo. The rabbits were randomly divided into three groups（n = 10 in each） ，control group（C） ，PIR group（I - R） ，PIR + hemin group （H）and PIR+ zinc protoporphyri
7、n IX （ZnPP）group （Z） . Changes of several parameters which included plasma car- boxyhemoglobin （COHb）at different time points，wet to dry ratio of lung tissue weight （W/D） ，the injured alveoli rate （IAR）and the HO- 1 enzymatic activity were measured at 180 min after reperfusion in lung tissue. The ti
8、ssue slides were also stained by im- munohistochemistry（IHC）and in situ hybridization （ISH）for HO- 1 to detect the expression of HO- 1 in lung and to analyze the optical density. The lung tissue was prepared for electron microscopic observation at 180 min after reperfusion. RESULTS：The plasma conten
9、t of COHb in I- R，H，and Z group increased in a time - dependent manner after I - R. But the increment of H group was higher than that of I- R group，while that of Z group was lower. The HO - 1 activity in lung tissue was highest in H group，followed by IR group，Z group，and C group （P 0.05 and P 0.01）
10、. Except C group，HO - 1 was upregulated in all other groups in the pulmonary endothelial cells，part of pulmonary vascular smooth muscle cells，extima of vessels and epithelial cells of airway. H group had the highest average optical density value，then the IR group，Z group and C group （P 0.05 and P 0.
11、01） . The value of W/D and IAR was highest in Z group，the second was in IR group，then the H group and C group （P 0.05 and P 0.01） . The abnormal changes of the lung tissue in morphology in I- R group，Hemin treatment mitigated the injury of I - R in H group and ZnPP exacerbated the impairment of ultr
12、astructure in Z group were also observed. CONCLUSION： 9371中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology2005， 21 （9） ： 1739 - 1743 HO- 1/CO system possesses notable protective effects on lung during pulmonary ischemia- reperfusion injury in rabbits. KEY WORDS Reperfusion injury；Lung；Heme oxygenase（decyc
13、lizing） ；Carbon monoxide 以往研究表明 1 - 3 ， HO - 1 的诱导可对缺血 - 再灌注心、 肝、 肾等脏器提供保护作用。但有关血红 素氧合酶 - 1 （heme oxygenase - 1， HO - 1） /一氧化碳 （carbon monoxide，CO） 径路在肺缺血 - 再灌注损伤 （pulmonary ischemia - reperfusion injury，PIRI） 中的作 用， 报道较少 4 。本研究在实验兔 PIRI 模型上， 观察 肺组织湿干重比 （wet to dry ratio of lung tissue weight， W/D）
14、、 肺泡损伤率 （injured alveoli rate， IAR） 、 肺组织 超微结构的改变、 血浆一氧化碳血红蛋白 （carboxyhe- moglobin， COHb） 浓度及 HO - 1 活力的变化； 应用免 疫组化、 原位杂交方法观察 HO - 1 表达部位及强度； 并分别于手术前或再灌注前给予 HO - 1 激动剂 - 氯 铁血红素 （hemin） 或抑制剂 - 锌原卟啉 （zinc protopor- phyrin IX， ZnPP） 观察其对上述指标的影响， 从而探讨 HO- 1/CO 径路在 PIRI 中所起的作用， 为临床防治 PIRI 提供理论基础。 材料和方法 1
15、实验动物 健康日本大耳白兔 40 只， 雌雄不拘， 体重 1.7 - 2.7 kg， 由温州医学院实验动物中心提供。 2主要仪器及试剂 2.1主要仪器DW2000 型动物人工呼吸机 （上海 嘉鹏科技有限公司） ， UNIVERSAL 32R 型低温高速离 心机 （Germany HETTICH 公司） ， 电热鼓风干燥箱 （上 海实验仪器总厂） ， 752 分光光度计 （上海精密科学仪 器有限公司） ， BS210S 型自动电子天平 （北京赛多利 斯仪器系统有限公司） ， 电热恒温水浴箱 （上海医用 恒温设备厂） ， JY92 -型超声波细胞粉碎机 （宁波 新芝科技研究所） ， FSH- II
16、 型高速电动匀浆器 （江苏 金坛金城国胜实验仪器厂） ， 普通病理切片机， 光学 显微镜， LKB - V2088 超薄切片机， H - 600 透射电镜 （Japan 日立公司） ， CMIA 彩色医学图像分析系统。 2.2主要试剂氯铁血红素 （hemin，H5533，Lot 072K1221） 、 还原型辅酶（dihydronicotinamide adenine dinucleotidephosphate， NADPH，N1630，Lot 081K7059） 、 焦碳酸二乙酯 （diethylpyrocaronate， DE- PC） 、 锌原卟啉 IX （ZnPP IX，ALX - 4
17、30 - 049 - M100， L09617） 购自 Canada Alexis 公司， HO - 1 免疫组化一 抗、 即用型 SABC 过氧化物酶试剂盒、 原位杂交探针 及检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司， 其余均为市售分析纯试剂。 2.3特殊试剂的配制卟啉类化合物 （包括氯铁血 红素和锌原卟啉 IX） 用 0.1 mol/L NaOH 溶解， 临用时 0.1 mol/L HCl 调 pH 值至 7.4， 生理盐水稀释至所需 浓度。避光操作及保存于避光环境。NADPH 用 0.01 mol/L NaOH 溶解。 3动物模型复制及分组 3.1模型复制氨基甲酸乙酯 4 mL （1.0
18、 g） /kg 静 脉麻醉， 颈外静脉插管滴注生理盐水 0.5 - 1.5 mL/min， 颈总动脉插管以备抽血。气管切开外接动 物呼吸机， 吸纯氧， 呼吸频率 30 times/min。沿左胸骨 切断第 3、 4、 5 肋骨， 打开胸腔， 游离左肺门， 穿过阻 断带。静脉注射肝素 （1 mg/kg） 抗凝， 按 Sekido 等 5 法复制兔 PIRI 模型。 3.2实验分组实验兔随机分为 4 组：（1）假手术 对照（control， C） 组，n = 10， 左肺门穿过阻断带后不 阻断肺门， 其余步骤同缺血 - 再灌注组；（2） 缺血 - 再灌注（ischemia - reperfusio
19、n，I - R） 组， n = 10， 左肺 门过阻断带后 （缺血前， T0） 抽血， 然后阻断左肺门1 h （缺血 1 h， T1） ， 抽血， 随即松开阻断带行再灌注3 h， 每隔 1h 抽血分别为 （再灌注 1 h， T2； 再灌注 2 h， T3； 再灌注 3 h， T4） 时点， 再灌注末取左肺组织标本；（3） 缺血 - 再灌注 + 氯铁血红素（I - R + hemin，H） 组， n = 10， 手术前 48 h 腹腔注射氯铁血红素 （每次 40 mol/kg， 2 times/d， 共 2 d） 6以诱导 HO - 1 表达， 其 余步骤同 I - R 组；（4） 缺血 - 再
20、灌注 + 锌原卟啉（I - R + ZnPP IX，Z 组） ，n = 10， 松开阻断带前 15 min 静脉注射 ZnPP IX （10mol/kg） 7 ， 其余步骤同 I - R 组。 4血浆 COHb 含量测定 采用乐宏元等 8 报道的方法测定。 5肺组织 HO- 1 活力检测 按照 Zhou 等 9方法测定。蛋白含量用考马斯 亮兰法检测。 6肺组织 HO- 1 免疫组化分析 采用 SABC 法制片， 以显色呈棕黄色为阳性表 达， 并应用华东理工大学研制的吸光度分析软件读 取吸光度 （A） 值。 7肺组织 HO- 1 原位杂交分析 HO - 1 寡核苷酸探针序列为：（1） 5- AG
21、AAT GCTGA GTTCA TGAGG AACTT TCAGA - 3 ；（2） 5- GCTGC TGGTG GCCCA CGCCT ACACC CGCTA - 3 ； 0471 （3） 5 - TTCCT GCTCA ACATC CAGCT CTTTG AGGAG - 3 。 原位杂交操作步骤：（1） 肺组织石蜡切片 60 烘烤 1 h， 常规脱蜡至水； 蒸馏水新鲜配制 3%过氧化 氢， 室温处理 10 min 灭活内源性过氧化物酶， 水洗 3 次； 切片滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 37 消化 12 min， 暴露 mRNA 核酸片段， 原位杂交用 PBS 液洗 5 min，
22、3 次， 蒸馏水洗 1 次； 干的杂交盒底部加 20%甘油 20 mL 以保持湿润， 切片滴加预杂交液 20L， 42 3 h， 甩去多余液体， 不洗； 滴加含 HO - 1 寡核苷酸探针的杂交液 20L， 盖上玻片， 恒温水浴 箱 42 杂交过夜 （约 17 h） ， 阴性对照滴加不含探针 的杂交液； 揭掉盖玻片， 37 水温的 2 SSC 洗涤 5 min， 2 次， 37 0.5 SSC 洗涤 15 min， 1 次， 37 0.2 SSC 洗涤 15 min， 1 次； 滴加封闭液 37 30 min， 甩 去多余液体， 不洗； 滴加生物素化鼠抗地高辛， 37 60 min， 原位杂交
23、用 PBS 液洗 5 min， 4 次； 滴加 SABC - POD 液， 37 20 min， 原位杂交用 PBS 液洗 5 min， 3 次； 滴加生物素化过氧化物酶 37 20 min， 原位杂 交用 PBS 液洗 5 min， 4 次； DAB 显色 30 min， 充分水 洗， 苏木素复染， 充分水洗， 梯度乙醇脱水， 封片。 （2） 镜检： 显色呈棕黄色为阳性表达。 （3） 应用华东 理工大学研制的吸光度分析软件读取吸光度 （A） 值。 8肺组织 W/D 比值测定 取部分肺门旁组织生理盐水充分漂洗， 滤纸吸 干多余水分， 称重为湿重。在恒温电热鼓风干燥箱 70 24 h 烘干称重为
24、干重， 两者之比为肺湿/干重 比值 （W/D） 。 9肺组织 IAR 测定 肺组织经 4%多聚甲醛加 DEPC 固定， 常规石蜡 包埋切片， HE 染色， 显微镜下观察各标本组织学改 变。在 200 倍视野下连续观察 200 个肺泡， 按 Murata 等 10 方法数出内含红细胞和/或白细胞超过 2 个以 上的肺泡 （视为损伤肺泡） 数， 然后计算出损伤肺泡 的百分数， 作为肺泡损伤的定量评价指标。 10肺组织电镜观察 取左肺门旁 0.1 cm 0.1 cm 0.1 cm 大小的组 织 2 - 3 块， 2.5%戊二醛前固定， 1%锇酸后固定， 乙 醇丙酮系列梯度脱水后 Epon 812 包
25、埋， 超薄切片， 醋 酸硝酸铅双重染色， 透射电镜下观察。 11统计学处理 采用 SPSS 11.5 统计软件分析。所有数据进行 正态性检验， 用均数 标准差 （-x s） 表示。多组样 本均数比较进行方差齐性检验， 组间比较采用单因 素方差分析 （One - way ANOVA） ， 组内不同阶段比较 采用随机区组双因素方差分析 （two - way ANOVA） ， 即广义线性模型 （general linear model，GLM） 中的单变 量 （univariate） 分析。方差齐性者两两比较采用 LSD 法， 方差不齐者进行 Dunnet s T3 检验。相关分析采 用 Bivar
26、iate 过程的 Pearson 等级相关法。并用线性回 归过程求得系数。 结果 14 组实验兔肺缺血 - 再灌注不同时点血浆 COHb 水平的变化 结果见表 1、 图 2。 24 组实验兔肺组织 HO - 1 活性、 免疫组化、 原位 杂交吸光度值的变化 结果见表 2、 图 1、 2、 3、 4。 表 1 4 组实验兔肺缺血 - 再灌注不同时点血浆 COHb 水平的变化 Tab 1Change of plasma COHb level in different time points during PIR among four groups （% .-x s. n = 10） GroupT0
27、T1T2T3T4 C0.95 0.050.96 0.050.97 0.030.97 0.030.97 0.05 IR0.95 0.041.23 0.04* *1.72 0.03* *2.06 0.05* *2.35 0.03* * H1.64 0.04* *# #2.69 0.04* *# #3.50 0.06* *# #4.64 0.04* *# #5.09 0.06* *# # Z0.96 0.040.98 0.04# #0.98 0.04# #1.01 0.03# #1.08 0.05* *# # * *P 0.01 vs C；# # P 0.01 vs IR； P 0.05，P 0.0
28、1 vs T0 in the same group；P 0.01 vs T1 in the same group； T0：pre - ischemia；T1：ischemia 1 h；T2：reperfusion 1 h；T3：reperfusion 2 h；T4：reperfusion 3 h. 34 组实验兔肺组织 W/D 和 IAR 值的变化 结果见表 3。 4肺组织超微结构改变 C 组： 毛细血管内皮细胞结构正常， 连接紧密， 基底膜完整。型肺泡上皮细胞正常。型肺泡上 皮细胞结构完整， 线粒体嵴清楚， 板层小体数量未见 改变， 微绒毛无减少。 IR 组： 肺内毛细血管内皮细胞肿胀， 可
29、见核染色 质聚集并靠核膜周边分布， 胞核固缩倾向， 核间隙增 大。型肺泡上皮细胞内吞饮小泡较少。型肺泡 1471 表 2 4 组实验兔肺组织 HO- 1 活性、 免疫组化、 原位杂交吸 光度值的变化 Tab 2Change of HO - 1 activity in lung tissue，AV of IHC and ISH （-x s. n = 10） Group HO-1 （nmol g- 1protein h- 1） AV of IHCAV of ISH C165.4748.980.1490.0150.1330.009 IR526.4365.32* *0.1680.016* *0.148
30、0.013* * H941.69100.11* *# #0.1930.016* *# #0.1620.011* *# # Z259.7448.72* *# #0.1740.015* *0.1520.011* * * *P 0.01 vs C；# # P 0.01 vs IR. 表 3 4 组实验兔肺组织 W/D 和 IAR 值的变化 Tab 3Change of W/D and IAR values in lung tissue among four groups in rabbits （-x s. n = 10） GroupW/DIQA （%） C4.18 0.2015.1 4.5 IR5.
31、40 0.39* *49.7 6.5* * H4.93 0.29* *# #28.1 6.8* *# # Z6.08 0.21* *# #57.1 6.5* *# * *P 0.01 vs C；# P 0.05， # # P 0.01 vs IR ；W/D：wet to dry ratio of lung tissue weight；IAR： injured alveoli rate. 上皮细胞表面微绒毛减少， 线粒体肿胀， 板层小体稀 少， 出现较多空泡。肺泡隔水肿， 肺泡隔及毛细血管 内炎症细胞附壁， 以中性粒细胞为主。 H 组： 毛细血管和肺泡结构有所改善， 毛细血管 内炎症细胞减少，
32、染色质分布较均匀。型肺泡上 皮细胞内吞饮小泡较多。型肺泡上皮细胞表面微 绒毛及板层小体增多。肺泡隔轻度水肿。 Z 组： 毛细血管和肺泡上皮细胞结构损伤较明 显， 血管内皮细胞肿胀明显， 呈高柱状向腔内突起， 界限模糊， 部分细胞出现核固缩， 内弹力板重度扭 曲， 内皮细胞基底部与内弹力板分离， 形成拱桥样改 变。型肺泡上皮细胞内吞饮小泡较少。型肺泡 上皮细胞表面平坦， 微绒毛极少， 板层小体稀少并逸 出胞质中， 伴有空泡。肺泡隔水肿， 炎性细胞聚集。 5相关性分析 血浆再灌注末 COHb 含量与肺组织 HO - 1 活性 两者之间呈正相关 （ r = 0.967， P 0.01） ； 肺组织
33、W/D与 IAR 之间呈正相关 （r = 0.845， P 0.01） ； 肺 组织 HO - 1 活性与 W/D、 IAR 之间存在负相关， 相关 系数 r 分别为 - 0.799和 - 0.862， P 0.01； 肺组织 HO - 1 免疫组化及原位杂交吸光度值与 IAR 之间存 在正相关， 相关系数 r 分别为 0.801 和 0.780， P 0.01。 2471 讨论 血红素氧合酶存在 3 种不同基因产物的同功 酶： HO - 1、 HO - 2 和 HO - 3。HO 通过裂解血红素分 子- 中位碳桥， 产生等摩尔胆绿素、 游离铁及 CO。 胆绿素随后在胆绿素还原酶催化下还原为胆
34、红素， 而铁可诱导铁蛋白并与之结合。胆红素、 CO 及铁诱 导的铁蛋白都有抗氧化功能， 是 HO - 1 抗炎症、 抗增 生的候选效应子， 也是当前研究的热点。 内源性 CO 的产生至少有两种途径 11 ：（1） 主要 途径是由血红素在 HO 催化下氧化生成；（2） 次要途 径是由一些有机分子氧化产生， 包括酚和四烷盐的 自动氧化、 脂质过氧化及有机化合物的光电氧化。 机体生成的 CO 一部分由肺排出， 另一部分与血红蛋 白 （Hb） 结合以 COHb 形成存在。因此， 可以用测呼 出气中 CO 浓度或血中 COHb 浓度来间接反应HO - 1 的活性。 本研究发现， I - R 组 COHb
35、 浓度随着肺缺血和 再灌注时间的延长而逐渐升高， 各时点与缺血前及 缺血后相比均有显著差异， 与 C 组相同时点比较亦 有显著差异。肺组织 HO - 1 酶活力 I - R 组亦高于 C 组， 免疫组化及原位杂交显示 HO - 1 普遍阳性表 达， 表明 I - R 可诱导肺 HO - 1 的表达， 这一结果与 Zhang 等 12 报道相一致。况且， I - R 组肺组织 W/D、 IQA 明显高于 C 组， 电镜亦显示肺组织超微结构明 显异常， 提示 I - R 导致肺组织损伤。但 HO - 1 的诱 导是介导 PIRI 还是作为一种代偿性机制保护 PIRI？ 由此， 我们在本实验中应用了
36、 HO - 1 激动剂及抑制 剂进一步探讨其作用。在 H 组中， 我们观察到 HO - 1明显上调的证据， 如血浆 COHb、 组织 HO - 1 酶活力均比 I - R 组高， HO - 1 表达呈强阳性， 吸光 度值比 I - R 组高， 而肺损伤性指标均较 I - R 组有 所改善。在 Z 组， HO - 1 抑制剂于再灌注前使用后， HO - 1活性受抑制， PIRI 进一步加重。这一结果表 明， HO - 1 表达的上调可减轻肺缺血 - 再灌注损伤。 参考文献 1 Melo LG，Agrawal R，Zhang L，et al. Gene therapy strategy for l
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