KSC联合紫杉醇对人肝癌HepG-2细胞株的抑制作用研究.pdf

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1、第5 卷第1 1 期 2 0 0 9 年1 1 月 亚太传统医药 A s i a P a c i l l cT r a d i t i o n a lM e d i c i n e V 0 1 5N o 1 l N O V 2 0 0 9 K S C 联合紫杉醇对人肝癌H e p G 一2 细胞株的抑制作用研究 凌 娜1 ，一，邓丹1 ，一，季宇彬1 ，2 ( 1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 7 6 ； 2 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 7 6 ) 摘要：目的：研究硒酸酯多糖( K S C ) 与紫杉醇( T A X

2、 ) 联合对肝癌细胞株H e p G 一2 的生长抑制作用，判断联合用 药的效果。方法：采用M r r 法测定药物的体外杀伤作用，应用金氏公式进行联合用药分析。结果：K S C 与T A X 单 用均可抑制H e p G - - 2 细胞的生长。且呈时间一剂量依赖性。二者合用后对H e p G - - 2 细胞的抑制作用显著增强。两 药合用的中效浓度分别为3 1 6 8 4 m g L 和0 2 7 2 n m o l L ，较两药单用时的中效浓度低( K S C 单用为4 6 6 3 2 m g L 。 T A X 单用为1 6 8 4 n m o l L ) 。两药合用的绝大多数q 值在0

3、 8 8 2 0 9 8 9 ，为相加作用。结论：K S C 与T A X 联用可显著增 强对H e p G - 2 细胞的抑制作用，二者具有协同相加抗肿瘤作用。 关键词：硒酸酯多糖( K S C ) ；紫杉醇( T A X ) ；肝癌细胞H e p G - - 2 ；M t i t ；q 值 中图分类号：R 一3 3文献标识码：A文章编号：1 6 7 3 2 1 9 7 ( 2 0 0 9 ) l l 0 0 1 3 0 3 硒酸酯多糖( k a p p a s e l e n o c a r r a g e e n a n 。K S C ) 又称硒化 卡拉胶，为硒与卡拉胶合成的新型生物活性

4、多糖。具有抗 氧化、抗肿瘤、提高免疫力及降低化疗药物的毒副作用等 活性【I 圳。研究表明K S C 对多种体外培养的肿瘤细胞均有 生长抑制作用 “ 】，但K S C 与其它化疗药物联合抗肝癌的 作用鲜有报道。本文采用M T Y 法观察K S C 联合紫杉醇对 人肝癌细胞株H e p G 一2 的抗肿瘤活性。根据金氏公式 6 1 定 量分析两药合用时的相互作用效果。以了解K S C 与紫杉 醇联合用药的特性和临床应用的可行性。 1 材料与方法 1 1 材料 细胞：人肝癌细胞株H e p G - 2 。 试剂：R P M I l 6 4 0 培养基( 美国G I B C O 产品) ，胎牛血 清(

5、 杭州四季青) ，硒酸酯多糖( 张家港天赐福生物工程有 限公司惠赠，硒含量为1 6 8 ) ，噻唑蓝( M r I ，I ) 、P I 染料和 二甲基亚砜( D M S O ) 均为美国S i g m a 公司产品。 仪器：自动酶标仪5 5 0 ( 1 3 本B I O R A D 公司) ，倒置显 徽镜( 1 3 本N I O K O 公司) ，C 0 2 孵箱( 1 3 本株式会社) 。 1 2 方法 1 2 1细胞培养 H e p G - - 2 细胞在含1 0 胎牛血清的R P M I 一1 6 4 0 培养液 ( 青霉素1 0 0 I U m L ，链霉素1 0 0 U m L )

6、中，于3 7 、5 C 0 2 孵箱中培养，细胞为上皮样贴壁生长，每2 3 天传代1 次。 1 2 2M T T 实验 取对数生长期的H e p G 一2 细胞制成4 x 1 0 4 个细胞m L 的悬液，按40 0 0 个孔接种于9 6 孔板，每孔加1 0 0 1 _ L L 。 2 4 h 后加入各种不同浓度药物的实验组( K S C 组、紫杉醇 组、K S C + 紫杉醇联合组) ，每孔加1 0 0 1 x L ，使K S C 的终浓度 为1 5 、3 0 、6 0 、1 2 0 m g L ，T A X 的终浓度为0 2 、0 5 、1 、2 、 5 n i n o l L ，联合组为

7、l 娼C ( 1 5 、3 0 、6 0 、1 2 0 m g L ) + 1 n m o l L T A X ，K S C ( 3 0 m g L ) + T A X ( 0 2 、0 5 、l 、2 、5 n m o l L ) ，对照组 加等量不含药物的培养液，每个剂量5 个平行孔。于5 C 0 2 ，3 7 培养箱中继续培养2 4 、4 8 、7 2 h 后，弃上清，每孔 加1 0 0 斗L 的M T T ，继续培养4 h 后，弃上清，每孔加2 0 0 v L 的D M S O ，微量振荡器摇匀，用酶标仪，在参考波长 4 9 0 n m ，检测波长5 7 0 n t o 条件下测定光密

8、度值( O D ) 以溶 剂组处理的肿瘤细胞为对照组，用下面公式计算药物对肿 瘤细胞的抑制率。 抑制率= ( 对照组平均O D 值一加药组平均O D 值) 对照组平均O D 值x 1 0 0 1 2 3药物联合作用效应计算 以药物浓度作为因变量，细胞抑制率作为应变量，即 收稿日期：2 0 0 9 0 8 1 0 基金项目：哈尔滨商业大学科研基金项目( 9 2 5 0 8 8 6 4 ) 作者简介：凌娜( 1 9 7 9 - ) ，女，安徽蚌埠人，博士，哈尔滨商业大学助理研究员，研究方向为海洋抗肿瘤药物。 一1 3 万方数据 第5 卷第l l 期 亚太传统医药 V 0 1 5N o 1 1 2

9、0 0 9 年1 1 月A s i a P a c i f i cT r a d i t i o n a lM e d i c i n e N o v 2 0 0 9 X - - - - - 药物浓度，y = 抑制率，建立回归方程。利用该方程求出药 物中效浓度( 抑制率为5 0 时药物的浓度，I C ) 。计算两种 药物单用及合用7 2 h 时的中效浓度。 协同效应判断：为判断两药合用是拮抗、相加或增强 的协同效应，按照金氏公式求q 值。q = E ( A + B ) E A + ( 1 一 E A ) x E B ，E ( A + B ) 为两药合用时的抑制率；E A 、E B 为各 药单用

10、时的抑制率。q 1 1 5 表 示两药作用增强；q = 0 8 5 1 1 5 表示两药作用相加。 1 2 4 统计学处理 所有数据均用面8 表示，使用统计软件S P S S l 6 O 中方 差分析和q 检验进行样本均数之间的两两比较，药物中效 浓度的计算采用回归方程。 2结果 2 1 K S C 、T A X 单用及联合对H e p G 一2 细胞增殖的影响 K S C 、T A X 单独作用于H e p G 一2 细胞2 4 、4 8 、7 2 h 后。 细胞生长明显受抑制，其抑制率随药物浓度和作用时间的 增加而升高。具有剂量和时间依赖性，与对照组相比差异 显著( P 0 0 1 ) ；

11、联合用药组与对应浓度的单一用药组相 比，对H e p G 一2 细胞的抑制效果更加显著，3 0 m g L 的K S C 与T A X ( 0 2 051 、2 、5 n m o l L ) 合用7 2 h ，可使紫杉醇的抑 制率从单独用药的1 6 3 2 一6 6 5 6 提高到联合用药的 4 7 7 3 8 0 6 4 ，I n m o l LT A X 与K S C ( 3 0 、6 0 、1 2 0 m g L ) 联合7 2 h 的抑制率分别为l ( s C 单独用药的1 2 8 9 、1 1 8 6 、 1 1 6 8 倍联合用药组与对照组相比吸光度有显著性差异 ( P 0 0 1

12、 ) ( 表1 ，图1 ) 。 表lK S C 、T A X 单用及联合对H e p G _ 2 细胞增殖的影响( 互s ，n = 1 5 ) 组别百丽百 对照组 K s c + T A ) 【 3 6 0 - 0 一0 2 5 0 7 4 4 - 0 0 0 0 1 2 0 5 7 2 ，q 30 2 507 4 4 ：- 00 1 7 一 3 一一一 m g r + n m 0 1 p ) 0 3 4 6 o 0 1 3 3 7 70 5 2 4 - z 0 0 0 9 * 8 ”0 6 1 8 - 0 0 1 8 “ 1 2 7 4 0 3 1 2 i - 0 0 2 3 1 8 6 5

13、0 3 6 0 - 0 0 3 2 * * 3 6 2 40 4 5 3 - - 0 0 3 3 * * 4 8 5 1 0 。2 6 8 i - 0 0 0 3 ”2 5 5 00 2 3 0 o 0 0 9 * * 5 8 4 80 2 4 6 ：e 0 0 1 0 “ * 6 6 3 4 0 2 5 4 i - 0 0 1 4 “ * 3 0 4 80 2 1 9 - 2 0 0 1 2 ”6 0 2 00 2 2 l 0 0 0 6 * * 6 9 3 l 0 3 5 0 - - 0 0 1 72 8 80 4 9 0 o 0 0 71 4 3 70 6 2 3 土0 0 l l 1

14、6 3 2 0 3 2 3 0 0 1 51 0 2 90 4 8 3 ：t - 0 0 1 31 5 5 20 5 4 2 0 0 0 8 * * 2 7 1 4 0 3 2 2 q ) 0 2 81 0 4 60 4 3 4 0 0 0 8 * 2 4 0 60 4 4 1 i - O 0 0 6 * * 4 0 7 8 0 2 6 6 ：t 0 0 1 2 + 2 6 0 00 3 8 4 0 0 0 9 * * 3 2 8 30 3 11 i - O 0 0 9 * * 5 8 2 1 0 2 3 9 , - 0 0 2 6 ”3 3 6 90 3 2 3 0 0 1 2 + 4 3

15、5 20 2 4 9 ：t - 0 0 0 4 * * 6 6 5 6 0 3 3 3 - 0 0 0 17 4 70 5 2 1 x O 0 6 88 8 70 6 4 9 0 0 5 41 6 9 0 0 2 9 l - e 0 0 0 2 * * 1 9 1 90 2 9 4 - z 0 0 0 6 * * 4 8 5 80 2 1 2 - - 0 0 0 8 * * 6 2 5 2 0 2 7 2 土0 0 1 8 + 2 6 7 30 2 2 9 i - 0 0 0 7 * * 5 9 9 80 1 5 9 - e 0 0 0 6 * * 7 8 6 6 o 2 3 3 0 0 0

16、5 * * 3 5 3 40 2 2 3 0 0 0 6 * * 6 0 9 60 1 4 2 - 0 0 0 5 * * 8 0 9 3 0 3 1 5 x - O 0 0 7 1 2 5 60 3 2 2 0 0 0 9 * * 4 2 7 50 3 8 9 , 0 0 0 9 * * 4 7 7 3 0 3 1 2 - 0 0 1 0 1 3 3 20 3 0 5 - 0 0 0 5 * * 4 6 6 20 2 2 9 i - 0 0 0 7 “ * 5 5 j 0 9 0 2 9 3 i - 0 0 1 4 “ 1 8 5 30 2 8 7 0 0 0 6 4 9 8 l0 2 1

17、7 0 0 0 8 * * 6 4 1 7 0 2 7 4 - 2 0 0 0 9 + + 2 3 7 80 2 6 0 - 0 0 0 9 * * 5 4 5 90 1 7 4 i - 0 0 0 7 * * 7 6 5 6 O 2 5 5 0 0 1 2 + 2 9 1 50 2 2 l 0 0 0 8 * * 6 1 3 2 0 1 4 4 i - 0 0 0 7 * * 8 0 6 4 注：与对照组比较，+ P O 0 5 ，+ 哦0 O l 。 一1 4 一 般8 H r a g ：L )霰匪( n m o l ，L J 圈1K S C 与T A X 单用及联合对H e p G 一2

18、 细胞生长的影响( 7 2 h l 2 2 按中效方程式算出两种药物单用及合用时的中效浓 度I C 蜘) 、相关系数( r ) 根据M T r 法测定的吸光度列出直线回归方程。得到 K S C 、紫杉醇单独或联合作用于H e p G 一2 细胞7 2 h 的中效 浓度( 表2 ) 。单用时的中效浓度：K S C 为4 6 6 3 2 m g L T A X 为1 6 8 4 n m o l L ，l n m o l L T A X 与K S C 联合应用时的中效 浓度为3 1 6 8 4 m g L ，3 0 m g LK S C 与T A X 联合时的中效浓 度为0 2 7 2 n m o

19、l L ，远小于单一应用时的中效浓度。 衰2 K S C 、T A X 单用及联合对H e p G - 2 细胞作用7 2 h 的回归方程、I C 勋、相关系数 2 3 K S C 与T A X 抗H e p G 一2 细胞的协同效应 两药合用时，按金氏公式计算q 值，判断两药之间是 协同、相加或拮抗。结果表明，K S C 的浓度为3 0 1 2 0 m g L 时，与l n m o l LT A X 联合应用表现为相加作用( q = 0 9 0 0 0 9 8 9 ) ，T A X 为0 5 5 n m o l L 时，与3 0 m g L 的K S C 联合效 果亦表现为相加作用( q =

20、 0 8 8 2 0 9 7 4 ) ，而且协同效。 ! 呈两 药剂量依赖性提高( 见表3 、表4 ) 。 表3l n m o l LT A X 与K S C 联合作用q 值 表43 0 m g LK S C 与紫杉醇联合作用q 值 3 讨论 肝癌是我围常见和高发的恶性肿瘤，临床上常采用顺 铂、羟基喜树碱、阿霉素、丝裂霉素等作为化疗药物。但 易产生耐药性。紫杉醇( p a c l i t a x e l ，商品名T a x 0 1 ) 是从红豆 杉中提取的一种化合物，由于具独特的抗癌机理和广谱高 效的抗癌活性，是继阿霉素和顺铂后最热点的抗癌药物之 一，目前，紫杉醇已成功用于治疗晚期卵巢癌、乳腺

21、癌等， 嚣黜糍麓篇裂淼娑嚣 万方数据 第5 卷第1 1 期 2 0 0 9 年1 1 月 亚太传统医药 A s i a P a c i f i cT r a d i t i o n a lM e d i c i n e V 0 1 5N o 1 l N O V 2 0 0 9 尤其对耐常规药物的肿瘤取得了较好的疗效。有研究报 道紫杉醇能抑制体外培养的肝癌细胞增殖，诱导细胞凋 亡 8 】，使细胞阻滞在S 期和G 2 M 期 9 1 。紫杉醇作为化疗药 物临床上效果显著，但存在一些毒副作用，如过敏反应、神 经系统损伤、造血抑制、心脏毒性等。临床恶性肿瘤的化疗 中l ( S C 具有良好的化疗辅助治

22、疗作用。已证实硒酸酯多 糖、富硒麦芽等有机化合物可拮抗顺铂、环磷酰胺等细胞 毒药物所致的耳毒性、肾毒性、生殖系统和免疫造血系统 毒性，促进宿主造血和免疫功能的恢复 1 0 - 1 1 】。同时，研究也 发现硒与肿瘤细胞的耐药性相关硒与柔红霉素抗癌药物 联合应用其疗效优于单一用药时的抗肿瘤效应其机理可 能为硒竞争性地结合P 一糖蛋白( P g P ) ，或通过调节细胞 内药物与其作用靶部位结合。增强柔红霉素的抗癌效应 从而在一定程度上克服耐药。 本研究结果表明K S C 与紫杉醇单独用药时均可抑 制人肝癌细胞H e p G 一2 的生长，并呈剂量和时间依赖性。 二者联合应用时。尤其是在药物浓度较

23、大时对人肝癌细 胞株H e p G 一2 有协同相加作用。说明两药联合应用比单独 应用时抗肝癌效果更好。另外。紫杉醇作用H e p G 一2 细胞 7 2 h 的中效浓度( I C ) 从单用时的1 6 8 4 n m o l L 降至联合 时的0 2 7 2 n m o l L ，降低了紫杉醇的用量及毒副作用。总 之。本研究发现K S C 与紫杉醇联用后，可增强对肝癌细胞 的增殖抑制。提示二者联用可能是提高肝癌疗效的一种 有效方法并且临床上指导医生筛选出最合理的联合用 药方案，使化疗药物的毒副作用进一步减少，有效率进一 步提高。 参考文献： 1 林正杰，王雨硒酸脂多糖种新型的有机硒化合物 c

24、 ，微 量元素分析与应用武汉：同济医科大学出版社。1 9 9 3 ：3 4 - 3 6 2 张哲文，魏虎来，苏海翔硒酸酯多糖的免疫调节与抗肿瘤作用 J 兰州大学学报，2 0 0 5 。3 1 ( 2 ) ：8 8 9 1 3 刘珊林，施冬云。潘喜华，等硒对肝癌细胞凋亡作用的研究 J 生物物理学报，1 9 9 8 ，1 4 ( 3 ) ：5 5 3 5 5 7 4 何更生，程棕，陆瑞芳，等硒酸酯多糖对人乳腺癌细胞株 ( B c a P 2 3 7 ) 生物学作用的研究 J 中华预防医学杂志，1 9 9 7 ，3 1 ( 2 ) ：1 0 5 1 0 5 5 吴兴，陈峥嵘，陈中伟硒酸酯多糖诱导人骨

25、肉瘤细胞凋亡作用 的体外实验 J 肿瘤防治杂志，2 0 0 4 ，l l ( 9 ) ：9 2 7 9 3 0 6 金正均合并用药中的相加 J 中国药理学报，1 9 8 0 ，l ( 2 ) ：7 0 一 7 6 7 W Y L L I EA H A p o p t o s i s ：d e a t hg e t sab r a k e J N a t u r e 。1 9 9 4 ，3 6 9 ( 6 4 7 8 ) ：2 7 2 2 7 3 8 李娟，单长民肝癌的细胞凋亡及其紫杉醇的诱导作用研究 J 中国优生与遗传杂志，2 0 0 7 ，1 5 ( 2 ) ：2 1 2 3 9 何松，沈薇

26、，沈鼎明体外观察紫杉醇对肝癌H e p G 一2 细胞生长 的影响 J 重庆医学，2 0 0 3 ，3 2 ( 3 ) ：2 6 8 2 7 0 1 0 蒋芹，张为民，杨成喜硒酸酯多糖辅助癌症化疗的临床观察 J 肿瘤防治研究，1 9 9 7 ，2 4 ( 2 ) ：1 1 0 _ 1 1 1 1 1 李方，石廷章硒酸酯多糖期临床研究 J 中国肿瘤临床， 2 0 0 0 。”( 4 ) ：3 0 9 3 1 1 1 2 穆玉兰微量元素与肿瘤耐药性关系的研究进展 J 中国癌 症杂志。2 0 0 2 。1 2 ( 2 ) ：1 8 4 1 8 6 ( 责任编辑：胡静) E f f e c to fC

27、 o m b i n a t i o no fK a p p a - s e l e n o c a r r a g e e n a na n dP a c l i t a x e lo n H u m a n H e p a t o m aH e p 脾S t r a i n L i n gN a l ，一D e n gD a n l , 2 ) j iY u b i n l ，2 ( 1 L i f eS c i e n c ea n dE n v i r o n m e n tS c i e n c eR e s e a r c hC e n t e r ，H a r b i nU n

28、i v e r s i t yo fC o m m e r c e ，H a r b i n 1 5 0 0 7 6 ，C h i n a ；2 E n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e ro fN a t u r a lA n t i c a n c e rD r u g s ，M i n i s t r yo fE d u c a t i o n ， H a r b i n15 0 0 7 6 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v e ：T os t u d y t h ei n t e

29、 r a c t i o no fk a p p a - s e l e n o c a r r a g e e n a n ( K S C ) a n dp a c l i t a x e l ( T A X ) o nh u m a nh e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m aH e p G - 2i nv i t r oi no r d e rt oj u d g et h ee f f e c to fc o m b i n a t i o n M e t h o d s ：T h eM - I - I w a gu s e dt oe

30、s t i m a t et h ek i l l i n ge f f e c to fd r u g s a n dt h eK i n g sp r i n c i p l ew a gu s e dt oa n a l y z eu n i o no fm e d i c a t i o n R e s u l t s ：K S Ca n dT A Xc o u l dr e s p e c t i v e l yi n h i b i tH e p G - 2c e l l s p r o l i f e r a t i o ni na t i m ea n dc o n c e n

31、 t r a t i o nd e p e n d e n tp a t t e r n s w h i c hw a se n h a n c e ds i g n i f i c a n t l y8 8c o m b i n e dw i t he a c ho t h e r 7 1 1 I em e d i a n e f f e c tc o n c e n t r a t i o n s ( I C 卯) o fK S Ca n dT A Xi nc o m b i n a t i o nw e r e3 1 6 8 4 m g La n d0 2 7 2 n m o l L ，

32、w h i c hW a sl e s st h a nt h a to fs i n g l eU z eo f K S G ( 4 6 6 3 2 m g L ) a n dT A X ( 1 6 M n m o l L ) T h eqv a l i l e 8o fm o s tc o m b i n a t i o n sw e r ef r o m0 8 8 2t o0 9 8 9a n dt I I e ya c t e di na na d d i t i v e p a t t e r n C o n c l u s i o n ：K S Cc o m b i n e dw

33、i t hT A XC a l ls i g n i f i c a n t l ye n h a n c et h ee f f e c t so fg r o w t hi n h i b i t i o na n dt h e yp l a ya l la d d i t i v e 锄t i t u m o re f f e c ti nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a K e yW o r d s ：K a p p a - s e l e n o c a r r a g e e n a n ( K S C ) ；P a c l i t a x e l ( T A X ) ；H e p a t o m aH e p G 一2s t r a i n ；M 1 I ；qv a l u e 一1 5 万方数据