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1、实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 1 期11 MCMV 感染对小鼠海马Ca2 +i及线粒体膜电位的影响 张英闻良珍程恒 摘要目的： 观察鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对小鼠海马细胞内游离 Ca2 +浓度( Ca2 +i)及线粒体膜电位的 影响。方法： 将 BALB / C 乳鼠同母鼠随机分为实验对照组 （24 只） 和病毒组 （35 只） ， 感染后 56 d 应用荧光分光光度 计和流式细胞仪分别检测两组小鼠海马的Ca2 +i及线粒体膜电位。结果： 病毒感染组小鼠海马Ca2 +i增高及线粒 体膜电位明显下降, 与实验对照组比较差异有显著性( P 值均 0. 01)。结论： 巨细胞病毒感染
2、所引起的小鼠海马 Ca 2 + i及线粒体膜电位的改变可能是其导致神经系统功能紊乱的机制之一。 关键词巨细胞病毒感染海马钙线粒体膜电位 Effect of Ca 2 + iand neuronal mitochondria transmembrane potentials in hippocampus of mice cytome- galovirus infected miceZHANG Ying,WEN Liang-zhen, CHENG Bi-heng. Department of Gynecology and Obstetrics, Tongji Hospital,Tongji Med
3、ical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030,China Corresponding author: WEN Liang-zhen E-mail: wenlz2004R sina. com. cn 【Abstract】 ObjectiveTo explore effect of Ca 2 + iand neuronal mitochondria transmembrane potentials in hippocampus of mice cytomegalovirus(MCMV) infecte
4、d mice.MethodsNewborn mice and femal mice of BALB / C were randomly divided into two groups the virus inoculated group and the control group. After 56 days, single cell of hippocampus was isolated, and mitochondria transmembrane potentials and the intracellular free calcium level Ca2 +iin hippocampu
5、s were measured by means of fluorospectro-photometer and flow cytometry (FCM). ResultsCompared with the control group,the mitochondria transmembrane potentials was decreased( P 0. 01) and the intracellular free calcium level Ca2 +iwas increased ( P 0. 01) in inoculated group. ConclusionThe dysfuncti
6、on of Ca2 +iand mitochondria transmembrane potentials in hippocampus may play an important role in the CMV infected brain. 【Key words】 CytomegalovirusInfectionHippocampusCalciumMitochondria transmembrane potential 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （编号： 30271673） 作者单位： 430030武汉市， 华中科技大学同济医学院附属同济 医院妇产科 通讯作者： 闻良珍 wen
7、lz2004 sina. com. cn 据世界卫生组织 1996 年的一项研究, 中枢神经 系统畸形约占全部先天畸形的 17%, 而人类巨细胞病 毒 (human cytomegalovirus, HCMV) 是引起人类先天性 中枢神经系统畸形的主要病原体之一1。中枢神经系 统被 HCMV 感染后, 最为严重的后果为脑积水、脊柱 裂、小头畸形、脑内钙化、神经性耳聋和四肢瘫痪 等 2。巨细胞病毒 (CMV) 是一种嗜神经病毒, AUTHONY 等 3 证实, 在胚胎发育早期 HCMV 感染最 易导致 CNS 的损伤。 小鼠大脑各种细胞都能被鼠巨细 胞病毒 (MCMV) 感染，因此我们用小鼠模型
8、来探讨 CMV 感染神经系统， 致神经系统功能紊乱的机制。 1材料与方法 1. 1材料MCMV 由同济妇产科围产实验室保存， 使用前将病毒在 NIH3T3 细胞上多次传代以增加毒力 并滴定 TCID50 后用于实验。 1. 2方法 1. 2. 1实验动物BABL / C 小鼠 (购自武汉市防疫 站)， 10 12 周龄， 体重 18 22 g。 雌雄 2: 1 配笼， 待母 鼠怀孕后与雄鼠分离单独喂养。乳鼠出生后当天按窝 随机分为实验对照组 (24 只) 和病毒感染组（35 只） ： 对照组脑内注射生理盐水 0. 02 mL; 病毒感染组脑内 注射 MCMV 毒液 0. 02 mL。 1. 2
9、. 2仪器与试剂流式细胞仪，荧光测定仪为日 本津岛 RF-5301PC, 罗丹明 Rhodamine-123、Fura-2 / AM 均购自 Sigma 公司。 1. 2. 3线粒体膜电位的测定 4 Rhodamine-123 是 一种高度特异性的线粒体荧光染料。线粒体对 Rhodamine-123 的摄取依赖于线粒体膜电位,线粒体 膜电位是线粒体摄取 Rhodamine-123 的动力。冰上取 小鼠双侧海马， 0. 25%胰酶消化, 1 000 r / min 离心收 集细胞, PBS 漂洗 2 遍, 2 mol / L Rhodamine-123 于 37 负载 45 min。1 000r
10、 / min 离心 5 min 去除 Rhodamine-123, 以 0. 01 mol / L PBS 轻洗 2 次, PBS 重悬细胞, 美国 FACS 流式细胞仪(激发峰 488 nm, 发 射峰 525 nm)检测细胞线粒体膜电位变化的平均荧光 强度(MIF)值, 采用 Cell Quest 数据处理。 1. 2. 4脑海马细胞内游离 Ca2 +浓度 ( Ca2 +i) 测定 取对照组动物及病毒感染组动物各 16 只, 活杀后 冰盘上剥离脑组织， 分离出海马约 100 120 mg, 用冰 冷的生理盐水冲洗， 仔细剥离、 剔除软脑膜和血管， 用 常规方法制备 105 107cells
11、 / mL 细胞悬液, 加入 1 12实用医学杂志 2006 年第 22 卷第 1 期 正常组对照组 图 1线粒体膜电位流式图 mmol / L Fura-2 / AM(Sigma 公司)，37负载 45 min, 荧光分光光度计检测, 参考文献 5 计算细胞内 Ca2 + 含量。 发射波长 500 nm, 激发波长 340 nm 和 380 nm, 激发光光栅 5 nm, 发射光光栅 10 nm, 测定时依次记 录静息、加入 1% 三硝基甲苯 (Triton) X-100 和 5 mmol / L EGTA 后 340 nm / 380 nm 荧光比值, 利用公 式 计 算 ： 细 胞 内
12、游 离 Ca2 +含 量(nmol / L) = kd (R-Rmin) / (Rmax-R)， 其中 kd = 224 nmol / L, R 为标 本静息状态测定值；Rmin 为标本加入 EGTA 时 340 nm 与 380 nm 的 荧 光 比 值 ； Rmax 为 标 本 加 入 TritonX-100 时 340 nm 与 380 nm 的荧光比值。 1. 3统计学处理所有实验数据均以 x s 表示, 各 组间比较采用方差分析及 t 检验。 2结果 2. 1小鼠海马神经细胞 Ca2 +i病毒感染组小鼠 海马神经细胞 Ca2 +i浓度 （236. 48 61. 83）nmol / L
13、 明显高于实验对照组 （108. 81 26. 85）nmol / L ， P 0. 01。 2. 2线粒体膜电位病毒接种组线粒体膜电位 (361. 55 46. 33) 较实验对照组 (595. 16 81. 21) 明 显下降， 差异有显著性( P 0. 01)， 见图 1。 3讨论 先天性巨细胞病毒感染所致的大脑畸形及智能、 认知功能障碍的发病机制尚未阐明。本实验采用病毒 接种法使小鼠脑组织病毒感染, 并且经行为学测试存 在学习和记忆功能障碍，属国内首创。在中枢神经系 统中, 海马结构是一个重要脑区, 它不仅有着复杂的 生理机能,而且与多种中枢神经系统的疾病过程有 关。在与学习、 记忆有
14、关的脑区中, 海马结构的作用显 得特别突出6。 本实验利用荧光分光光度计检测海马神经细胞 Ca 2 + i, 结果发现病毒感染组小鼠海马神经细胞静息 态 Ca2 +i升高, 分析其原因, 我们认为是 CMV 感染 使钙通道异常, 引起 Ca2 +内流增多、或钙泵的功能受 损, 使 Ca2 +在胞内聚积所致 7， 就其临床意义而言, 可 能是导致病毒感染小鼠认知功能障碍的分子异常改 变的指标之一。曾有学者 8 认为, 认知障碍是由于神 经细胞静息态 Ca2 +i过高启动了细胞凋亡机制, 引 起迟发性神经元坏死所致; 另外, 还有学者9报告, 大 鼠海马神经细胞静息态Ca2 +i过高, 可能提高了
15、突 触传递的阈值、 易化突触的抑制、 影响突触传导、 神经 递质释放和信号转导等, 从而导致了学习、记忆功能 障碍。 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种 细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而 线粒体跨膜电位 DYmt 的下降，被认为是细胞凋亡级 联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡 特征 （染色质浓缩、 DNA 断裂） 出现之前， 一旦线粒体 DYmt 崩溃， 则细胞凋亡不可逆转。感染组小鼠海马神 经细胞线粒体膜电位较对照组明显下降，说明 MCMV 感染诱导小鼠海马神经细胞凋亡异常增加。 本实验通过流式细胞仪对小鼠海马线粒体膜电 位及神经细胞静息态 Ca2 +i的测
16、定发现 CMV 感染导 致海马神经细胞胞浆游离 Ca2 +增强, Ca2 +自稳平衡紊 乱, 细胞外 Ca2 +内流入细胞, 主要集聚在线粒体内, 破 坏线粒体结构和功能，致使线粒体膜电位下降引起机 体凋亡异常， 导致机体出现各种病理后果。总之, Ca2 + 过度内流可能是细胞结构的基本损害和最终死亡的 原因， 可能是 CMV 感染导致胚胎生长发育异常、 神经 系统损害及智力障碍的机制之一。 4参考文献 ROIZMAN B,WHITLEY R J,LOPEX C,et al.The human herpesvirusesM.New York New York Press, Ltd, 1996：
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