MDR1、GSTπ特异性SIRNA真核表达载体的构建及表达.pdf

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1、复 旦学报( 医学版) F u d a n Un i v J Me d S c i 2 0 0 6 J a n . , 3 3 0) 2 9 MD R 1 , G S T 二特异性 s i R N A真核 表达载体的构建及表达 冯 敏 华 ， 张 技 2顾 静 文 ， “林 果 为 ( 复旦大学附属华山医院血液科、 2 检验中心上海2 0 0 0 4 0 ) 【 摘要】 目的构建多药耐药基因( MD R l ) 、 谷胧甘肤 S - 转移酶( G S T 7 c ) 特异性小干扰 R N A( s i R N A ) 真核表达 载体并检测其表达。方法参照s i R N A模板设计原则， 设计并

2、化学合成2 条s i R N A模板序列， 退火后将其插人 质粒p S i l e n c e r 2 . 1 - U 6 ， 限制性酶切和基因测序进行鉴定。脂质体介导下转染 K 5 6 2 / A d r 细胞， 实时荧光定量 P C R分析 MD R 1 , G S T n m R N A的表达， 荧光免疫组化检测 P g p , G S T 7 c 蛋白的表达。结果重组质粒 p S i l e n c - e r 2 . 1 - MD R 1 , G S T 7 c 经酶切、 测序分析表明 s i R N A模板序列成功插人预计位点， 并且序列正确。用 p S i l e n c e r

3、 - m d r l , p S i l e n c e r 2 . 1 - G S T 二 分别转染 K 5 6 2 / A d r 细胞株， m d r l m R N A表达量下降了7 1 . 5 Y o , G S T n rn R N A表达 量下降了3 9 . 8 %, 荧光免疫组化显示P g p , G S T n 表达均显著减少 ( P x s 1 a 1 的盖 玲 r 丫 1 门 t 6 1, 7 六 , 乞 27 1 1 幻卜、 话 心 . n论 r + 仁1 岛 图1 重组质粒的测序图谱( 靶向G S T rz m R N A反义链) F i g 1 S e q u e

4、n c i n g m a p o f r e c o m b i n a n t v e c t o r ( a g a i n s t G S T n m R N A r e v e r s e c h a i n ) 复旦学报( 医学版) 2 0 0 6 年 1 月， 3 3 ( 1 ) 5 . 创 , 1 w1 2 1 6 6 , . -Y5 日 0 1 1 日 .u 1 Z T 6 6 1 八 61 3 7 5 S rt i G: 1 1 6 人阳 7 ;9 9 C :E 5切 7 7 x 0 P G G 7 B G N7 . KB.OCpIH 1.14iict: 亡 印 拍 二 t

5、 环 仁 ( “ 百 “ 井 “ 了 了 弋 r L I二 ( .1 1 f 了 r f f 丫 盖 下 C . 耽 71 4 ( r r 仁 丫 1 魂5 了 p .2 1 加 的 1 丫目田.， 压1 认l u 4 rt 4 F 4 4 4 护 勺 日 蕊 玲胜， “:加1 1 NS OV 6 m . . 肠、 】 叭 门 月 自 闭目N - .3 1 汉曰叻. 口 . ， 5 2 月 刁知 翔.2 2二 曳 ) 0 日 0 苦 刁 口 八 M . C S 7 J m 2 2 . 2 0 6 5位 洲几 M . C 9 7 s p 巧二 、 闷. ， 目 ， 洲5 p .肠 N 翻 m口

6、二 日 八一 1 月 启 已 t + l t l 召 L L G I t i e 6 f y i Z f i l ( l 4 ( W+ t - 下 n, m i“.4 a “. “ 一 ，翻日31 2 , ! t u l 气 ( FU N - 4 (4 + a 4+ ， 。 _ . _二八 。 . 八 。 、 自 。 八 _ L.劝 。 。 M . 。 。 M ， 八 八 。 八 _. 。 八 八M 。劝， ._ _ 八 _ _ 人 人 图 2 重组质粒的测序图谱( 靶向MD R - 1 m R N A反义链) F i g 2 S e q u e n c i n g ma p o f r e

7、c o m b i n a n t v e c t o r ( a g a i n s t MD R 1 m R N A r e v e r s e c h a i n ) 转染前后荧光免疫组化结果荧光显微镜下可 见 K 5 6 2 / A d r 组有大点状的绿色荧光， P - g p阳性细 胞为( 7 1 . 2 5 1 9 . 6 5 ) 0 o , p S i l e n c e - m d r l 转染后的荧光 细胞降低为( 3 2 . 2 5 士 5 . 9 7 ) 0 0 ( 尸 0 . 0 0 1 ) ， 差别具有 显著性; K 5 6 2 / A d r 组有多量点状的红色荧

8、光， G S T n 阳性细胞为( 8 1 . 2 5 土6 . 4 9 ) Y o , p S i l e n c e - G S T 二转染 后的荧光细胞数显著下降， 为( 4 1 . 2 5 1 4 . 4 3 ) Y ,) ( P 0 . 0 0 1 ) ( 表 1 ) 。 表1 G S T a 和P - g p 荧光免疫组化表达 7 a b 1 T h e e x p r e s s i o n o f P - g p a n d G S T n b y i m m u n o fl u o re s ce n ce t e s t( %) GS T P - g P Pr e t r

9、 a n s f e c t i o n K 5 6 2 / A 7 3 8 2 91 7 9 t r a n s f e c t i o n K 5 6 2 / G S T Pr e t r a n s f e c t i o n Te s t l Te s t 2 Te s t 3 Te s t 4 M c a n 尸 3 8 44 4 7 3 6 8 1 . 2 5土6 . 4 9 4 1 . 2 5士4 . 4 4 K 5 6 2 / A 6 2 71 8 7 6 5 7 1 . 2 5士9 . t r a n s f e c t i o n K5 6 2 / P - g p 2 s

10、4 4 3 2 3 7 6 5 3 2 . 2 5士5 . 9 7 0 . 0 0 0 1 1 91 0 . 0 01 5 2 5 讨论 在较早的哺乳动物 R N A i 实验中， s i R N A是通 过化学方法合成的， 价格昂贵， 且需要设计多个不同 的 s l R N A以确定最有效的一个 6 。后来， L e w i s D L I 和Mc C a f f r e y APE, 报道直接将 s i R N A注射到 小鼠体内抑制基因表达并得成功， 但进一步研究发现 直接向细胞导人 s i R N A存在基因沉默维持时间短、 体内运载难和转染效果不稳定等问题， 因此限制了该 技术的应用

11、。为了能够在哺乳动物细胞中持续表达 s i R N A ， 现已开发出一种表达载体， 可以在细胞内表 达s h R N A s L 3 3 。本实验应用近年来发现的p S i l e n c e r 表达载体系列， 这是用于哺乳动物细胞中表达 s i R - N A的一系列载体。p S i l e n c e r 2 . 1 - U 6 质粒依赖R N A 聚合酶Ul ( P o t l u ) 启动子 在宿主细胞内操纵小分子 双链 R N A的表达， 它用于克隆小分子寡核昔酸( 约 5 0 - me r ) ， 该寡核昔酸包括 2 段与目的基因同源的互 补序列， 2 段序列之间有一长度为 5

12、 -7 n t 的插人片 段。小分子寡核昔酸克隆至P o t mU 6 启动子下游， 转录后形成发夹型 R N A， 其中互补双链长 1 9 一2 1 b p , 5 一 7 n t 的中间插人片段可折叠成环。重组质粒 p S i l e n c e r 2 . 1 - M D R 1 , G S T 二 经酶切、 基因测序证明寡 核昔酸片段成功插人预计位点， 且序列与我们设计合 成的靶向MD R 1 , G S T 二的反义链( R e v e r s e c h a i n ) 完 全一致， 成功构建 s i R N A真核表达载体 p S i l e n c e r 2 . I U 6

13、n e o - MD R 1 , G S T 7 r 。分别转染 K 5 6 2 / A d r 细 胞株， 实时荧光定量 P C R检测并经 G A P D H基因水 平校正发现转染后的 K 5 6 2 / A d r 细胞株 m d r l 表达 量下降了 7 1 . 5 环， G S T 7 r m R N A 表达量下降了 3 9 . 8 0 o ， 差别有显著意义。荧光免疫组化显示 P g p 阳性细胞转染前后从 ( 7 1 . 2 5士9 . 6 5 ) %降低为 ( 3 5 . 2 5 15 . 9 7 ) 写( P 0 . 0 0 1 ) ， 差别有显著性; G S T n 阳

14、性细胞转染前后从 ( 8 1 . 2 5士6 . 4 9 ) %下降为 ( 4 1 . 2 5 士 4 . 4 3 ) 肠( 尸 0 . 0 0 1 ) ， 差别具有显著性。由 此质粒介导的R N A干扰操作简便， 通过质粒的复制 扩增， 显著降低制备 s i R N A的成本。可长期用于白 血病多药耐药基因功能的研究。 下转第 3 8页) 3 8复旦学报( 医学版) 2 0 0 6 年 1 月， 3 3 (l) 为一项综合指标评价结核病患者的经济水平， 在非 项目县发现了经济状况对就诊延误时间有较大的影 响 ， 经 济 收 人 高 者 延 误 时 间 短 ， 从 而 影 响 了 结 核 病

15、患 7 者的及时就医， 从结核病医疗服务的角度印证了这 一问题在农村地区的存在。 8 t r e a t m e n t f o r t u b e r c u l o s i s i n e a s t L o n d o n J . C o m m u n D i s Pu b l i c He a l t h， 2 0 0 3, 6 ( 2 ) : 1 3 3 L i e n h a r d t C , R o w l e y J ， Ma n n e h K, e t a l . F a c t o r s a f f e c t i n g t i m e d e l a y t o

16、 t r e a t m e n t i n a t u b e r c u l o s i s c o n t r o l p r o g r a m m e a s u b - S a h a r a n A f r i c a n c o u n t r y : t h e e x p e r i e n c e o f t h e G a m- J . I n t J T u b e r c L u n g D i s ， 2 0 0 1 D e mi s s i e M, L i n d t j o r n B, B e r h a n e , 5 ( 3 ) : 2 3 3 Y_

17、P a t i e n t a n d h e a l t h 参考文献 Wo r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n . G l o b a l t u b e r c u l o s i s c o n t r o l : s u r - v e i l l a n c e , p l a n n i n g , f i n a n c i n g R . WH O R e p o r t ， 2 0 0 5 , G e - n e v a ( WHO / HT M/ T B / 2 0 0 5 . 3 4 9 ) 全国结核病流行病学调查指导组，

18、 全国结核病流行病学抽样 调查办公室. 2 0 0 0 年全国流行病结核病抽样调查 J . 中国防 痔杂志， 2 0 0 2 , 2 ( 2 4 ) : 6 5 L o n n r o t h K, T h u o n g L M, L i n h P D, e t a l . D e l a y a n d d i s c o n t i - n u i t y - a s u r v e y o f T B p a t i e n t s s e a r c h o f a d ia g n o s i s i n a d i v e r - s i f i e d h e a l t h

19、 c a r e s y s t e m J . I n t J T u b e r c L u n g D i s ， 1 9 9 9 , 3 ( 1 1 ) : 9 9 2 王黎霞， 岳舒敏， 钱元福， 等. 结核病患者的社会经济学调查 J .中国防痔杂志， 2 0 0 2 , 3 ( 2 4 ) ; 1 3 0 徐腌， 修燕， 朱成仁， 等. 江苏农村结核病健康教育状况 J . 中 国健康教育， 2 0 0 2 , 1 1 ( 1 8 ) ; 6 8 8 L e w i s K E, S t e p h e n s C, S h a h i d i MM, e t a l . D e l

20、 a y i n s t a r t i n g 9 习 1 0 1 1 1 2 s e r v i c e d e l a y i n t h e d i a g n o s i s o f p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s i n E - t h i o p i a . J B MCP u b l i c H e a l t h , 2 0 0 2 , 2 ( l ) : 2 3 S h e r m a n L F , F u j i w a r a P I , C o o k S V, e t a l . P a t i e n t a

21、n d h e a l t h c a r e s y s t e m d e l a y s i n t h e d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t o f t u b e r c u - l o s i s J . I n t J T u b e r c L u n g D i s ， 1 9 9 9 , 3 ( 1 2 ) : 1 0 8 8 C h e n g G, T o l h u r s t R, L i R Z , Me n g Q Y, e t a l . F a c t o r s a f - f e c t i n g d

22、e l a y s i n t u b e r c u l o s i s d i a g n o s i s i n r u r a l C h i n a : a c a s e s t u d y i n f o u r c o u n t i e s i n S h a n d o n g P r o v i n c e J . T r a n s R S o c T r o p Me d Hy g, 2 0 0 5 , 9 9 ( 5 ) : 3 5 5 U p l e k a r M, J u v e k a r S , Mo r a n k a r S , e t a l . T

23、 u b e r c u l o s i s p a - t i e n t s a n d p r a c t it io n e r s i n p r i v a t e c l i n ic s i n I n d i a J . I n t J T u - b e r c L u n g Di s ， 1 9 9 8 , 2 : 3 2 4 卫生部统计信息中心第三次国家卫生服务调查分析报告 J . 中国医院， 2 0 0 5 , 1 : 3 ( 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 6 - 1 3 ; 编辑: 张秀峰) ( 上接第 3 2 页) 参考文献 1 Z a m o r e P

24、 D , T u s c h l T , S h a r p P A, e t a l . R N A i : d o u b l e s t r a n d e d R N A d i r e c t s t h e A T P d e p e n d e n t c l e a v a g e o f m R N A a t 2 1 t o 2 3 n u c l e o t id e i n t e r v a l s J . C e l l , 2 0 0 0 , 1 0 1 : 2 5 2 Wu H, Ha i t WH, Y a n g J M. S m a l l i n t e

25、 r f e r i n g R N A - i n d u c e d s u p p r e s s i o n o f MD R I ( P - g l y c o p r o t e i n ) r e s t o r e s s e n s i t i v i t y t o mu l t i d r u g r e s i s t a n c e c a n c e c e l l s 仁 J . C a n c e r R e s e a r c h ，2 0 0 3 , 6 3 : 1 5 1 5 3 S u i G, S o o h o o C , A f f a r e l

26、 B , e t a l . A D N A v e c t o r - b a s e d R N A i t e c h n o l o g y t o s u p p r e s s g e n e e x p r e s s io n i n m a m m a l ia n c e l l s J . P r o c Na t l Ac a d S c i , 2 0 0 2 , 9 9 ( 8 ) : 5 5 1 5 4 E l b a s h i r S M, H a r b o r t h J , L e n d e c k e l W, e t a l . D u p l e

27、 x e s o f 2 1 - 7 阳 n u c l e o t i d e RNAs me d i a t e R NA i n t e r f e r e n c e i n c u l t u r e d ma m- m a l i a n c e l l l i n e s J . N a t u r e , 2 0 0 1 , 4 1 1 : 4 9 4 Mc Ma n u s MT, S h a r p P A . G e n e s i l e n c i n g i n m a m m a l i a n s b y s m a l l i n t e r f e r i

28、n g R N A s J . N u t R e v G e n e , 2 0 0 2 , 3 : 7 3 7 P a u l C P , G o o d P D , Wi n e r I , e t a l . E f f e c t i v e E x p r e s s i o n O f S m a l l I n t e r f e r i n g R N A i I n h u m a n c e l l s J . N a t u r e B i o t e c h n o l ， 2 0 0 2 , 2 0 : 5 0 5 L e w i s D L , H a g s t

29、 r o m J E , L o o m i s A G, e t a l . E f f i c i e n t d e l i v e r y o f s i R N A f o r i n h i b i t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n p o s t n a t a l m i c e J “ N a t u r e G e n e t i c s ， 2 0 0 2 , 3 2 : 1 0 7 Mc C a f f r e y A P , Me u s e L , P h a m T T T, e t a l . R N A i n t e r f e r e n c e i n a d u l t m i c e 仁 N a t u r e , 2 0 0 2 , 4 1 8 ; 3 8 |日IJ 户j6 厂.L厂L ( 收稿日期: 2 0 0 5 - 0 4 -1 1 ; 编辑: 刘忠英)