MIGCXCL9表达载体构建及体外活性鉴定.pdf

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1、MI G ( C X C L 9 ) 表达载体构建及体外活性鉴定* 张汝,田聆,肖飞,文艳君,李炯,侯建梅 张伶,李刚,姚兵,陈县城,梅开 四川大学华西医院 生物治疗国家重点实验室 肿瘤中心(成都6 1 0 0 4 1 ) 【摘要】 目的构建MI G( C X C L 9 )真核表达载体,为利用MI G研究肿瘤基因治疗奠定基础。方法从 p B L AS T- MI G上切下含MI G全长的c D NA序列, 定向插入p OR F - mc s真核表达质粒,构建p OR F - MI G重组质粒; 然后经酶切分析和测序鉴定后,通过脂质体介导转染C OS - 7细胞;再进一步用免疫印迹法鉴定重组质

2、粒的表达活 性,用趋化试验鉴定生物学活性。结果 p OR F - MI G重组质粒经酶切分析和测序证实含有MI G的全长c D NA序 列,转染C OS - 7细胞后高效表达MI G蛋白,对活化的淋巴细胞有趋化作用。结论成功构建了MI G( C X C L 9 )真核 表达质粒,为进一步利用p OR F - MI G研究恶性肿瘤基因治疗奠定基础。 【关键词】 MI G ( C X C L 9 ) 趋化因子转染肿瘤基因治疗 【中图分类号】 R 7 3 C o n s t r u c t i o no fp O R F - MI G a n dA c t i v i t yE v a l u a

3、t i o no fMI G i nv i t r o Z H A N GR u ,T q A Nr s t u ,v q A wx y s ,z N | t - u t ,r q J s o t u ,H w #J s t - $y s ,Z H A N Gr s t u ,r q G t u ,| A w% s t u , . / ? - ; 9 8 ? 的表达 转染p OR F - MI G重组质粒的C OS - 7细胞培养 7 2h后, MI G蛋白表达呈阳性, 在P VD F膜上显示 有能与抗MI G抗体特异结合的阳性条带,相对分子 质量为1 2 1 0 3, 而未转染质粒的C OS

4、 - 7细胞作为对 照则未见显示条带(图3 ) 。 2 . 3 ? 趋化功能检测 305AS i c h u a nBn i C( Me dS c i E d i )Vo l . 3 7No DD D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D . 42 0 0 6 图2重组p O R F - MI )测序图 F * +2 , - . / - 0 1 -2 - 3 - 4 5* 0 6

5、 3 * 7 07 8 3 9 -4 - 1 7 5: * 0 6 0 3 p O R F - MI ) ; ? AB C D ? B E CB CF E GD HH B I ? B E C JK ? AB C D ? B E CB C L M H B I ? B E C 图N转染细胞表达OP Q的免疫印迹分析 F * +N R- S 3 - 4 0 : T 7 3 6 S S 6 U7 8 OP Q* 03 4 6 0 S 8 - 1 3 - 21 - T T S V C ? X Y M M B E CE F Z ? D C M F E AD C ? M J c c M GB ? d E e

6、 ? ? D C M F I ? B E C 图f趋化功能检测 F * +f g 9 - 57 3 6 h * S 3 7 i 6 4 2 S OP Q e Y Y c A C ? D c A H B e AE F Y j _k a lm n? D C M F I ? H _ a bI c c d D M M B AB c D I D Y D I B ? oE FI d AE ? D X B M pI E AY D H? E I E Aq B C D C ?Ae B C Z r st r u v w x B y C B F B I D C ?I d AE ? D X B MH B F F C

7、I M c D ? B L ? EI E C ? E c y E e Y x= D ? DD M d E GCD Mz | s =3 ) xj K GD Me M HD MDC y D ? B L I E C ? E c pD C H I E Aq B C D C ? Ae B C Z M L HD MDY E M B ? B L I E C ? E c x * P 0 . 0 V 体外转染结果证实Z 有较强的生物学活性。 转 染 了 Y _R k a lm n的 _ a b细 胞 培 养 上 清 对 K ;L K / I小鼠脾脏活化的淋巴细胞有显著的趋化作 用p这种趋化作用可以被抗Z 抗体所

8、阻断p与转 染空质粒的 _ a b细胞相比差异有统计学意义 P 0 x 0 V ) p与V 0 0C y / ALZ 标准品的趋化作用相 似图4 ) 。 N 讨论 趋化因子家族目前已发现5 0多个成员p诸多研 究已表明趋化因子与肿瘤的生物学行为密切相 关 b 。趋化因子诱导W细胞、 NK细胞、树突状细胞 = )等迁移p刺激免疫应答反应p在肿瘤的免疫辅 助治疗方面已取得了明确的疗效 8 J但对 X 类趋 化因子调节肿瘤新生血管生成的研究报道尚少p我 们构建了 X 类趋化因子-Z 的真核表达载体 Y _R k a lm n p 为进一步利用Y _R k a lm n研究抗血管 基因治疗奠定基础。

9、我们构建的真核表达载体Y _R k a lm n经限制 性核酸内切酶酶切鉴定、 = N;测序证实目的基因 lm n序列正确J 进一步将重组质粒转染到 _ a b细 胞后p用免疫印迹法检测转染细胞表达Z 的情 况p结果显示转染重组质粒的 _ a b细胞可以表达 能被抗Z 抗体特异识别的Z 蛋白p说明所构建 的重组质粒在细胞内具有正确表达活性J再通过趋 化实验检测细胞培养上清的趋化活性p显示转染细 胞培养液上清对小鼠脾脏活性的淋巴细胞的趋化作 用p这种趋化作用可以被抗Z 抗体所阻断p并且 相当于V 0 0C y / ALZ 标准品的活性p说明重组质 粒有具有生物学活性。 405 四川大学学报医学版

10、) 0 0 6年第3 b卷第4 = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = 期 恶性肿瘤无论生长和进展都依赖于新生血管生 长,采用基因治疗策略抑制肿瘤新生血管生长有良 好的应用前景 9 。因为抗血管基因治疗靶向作用于 遗传性稳定的宿主血管内皮细胞,这比直接针对异 质性明显的肿瘤细胞,不容易产生耐药和免疫逃逸 现象 1 0 ;其次目的基因转染效应细胞后,可持续、低 浓度地表达、产

11、生效应分子,比间断、大剂量用重组 蛋白治疗更有效、花费更低 1 1 ;还有肿瘤血管生长 过程复杂,受多基因调控,基因治疗可以导入多种功 能基因,共同发生作用 1 2 。我们构建的p OR F - MI G 真核表达质粒,在体外实验中证实能高效表达MI G 蛋白。由于MI G是具有抑制新生血管生长和免疫调 节双重作用的趋化因子,成功构建的重组质粒可用 于肿瘤基因治疗,为进一步研究抗血管及免疫基因 治疗奠定了基础。 参考文献 1R o l l i n sB J .C h e mo k i n e s .B l o o d , 1 9 9 7 ; 9 0 ( 3 ) : 9 0 9 - 9 2 8

12、. 2R o s s iD ,Z l o t n i k A.T h eb i o l o g yo fc h e mo k i n e sa n dt h e i r r e c e p t o r s .An n uR e vI mmu n o l , 2 0 0 0 ; 1 8 : 2 1 7 - 2 4 2 . 3S t r i e t e rR M,P o l v e r i n i P J ,Ku n k e l S L ,e t a l .T h ef u n c t i o n a l r o l e o f t h e E L RMo t i f i n C X Cc h e

13、 mo k i n e - me d i a t e d An g i o g e n e s i s .JB i o l C h e m, 1 9 9 5 ; 2 7 0 ( 4 5 ) : 2 7 3 4 8 - 2 7 3 5 7 . 4G a s p e r i n i S ,Ma r c h i M,C a l z e t t i F ,e t a l .G e n ee x p r e s s i o na n d p r o d u c t i o no ft h emo n o k i n ei n d u c e db yI F N- ( MI G) ,I F N- i n

14、d u c i b l e T c e l l - c h e mo a t t r a c t a n t (I - T AC) , a n d I F N- i n d u c i b l ep r o t e i n - 1 0(I P - 1 0) c h e mo k i n e s b yh u ma n n e u t r o p h i l s .JI mmu n o l , 1 9 9 9 ; 1 6 2 ( 8 ) : 4 9 2 8 - 4 9 3 7 . 5L i a oF ,R a b i nR L ,Ya n n e l l i J R ,e t a l .Hu m

15、a nMi gc h e mo k i n e : b i o c h e mi c a l a n df u n c t i o n a l c h a r a c t e r i z a t i o n .JE x pMe d , 1 9 9 5 ; 1 8 2 ( 5 ) : 1 3 0 1 - 1 3 1 4 . 6R u e h l ma nJ M,X i a n gR ,An d r e a sG,e ta l .MI G ( C X C L 9 ) c h e mo k i n e g e n e t h e r a p y c o mb i n e s wi t h a n t

16、 i b o d y - c y t o k i n e f u s i o np r o t e i nt os u p p r e s sg r o wt ha n dd i s s e mi n a t i o no f mu r i n e c o l o nc a r c i n o ma .C a n c e r R e s , 2 0 0 1 ; 6 1 ( 2 3 ) : 8 4 9 8 - 8 5 0 3 . 7F r e d e r i c kMJ ,C l a y ma nG L .C h e mo k i n e si nc a n c e r .E x p e r t

17、 R e vMo l Me d , 2 0 0 1 ; 1 8 ( 6 ) : 1 - 1 8 . 8S h a r maS ,S t o l i n aM,L u oJ ,e t a l .S e c o n d a r yl y mp h o i dt i s s u e c h e mo k i n eme d i a t e sT c e l l - d e p e n d e n ta n t i t u mo rr e s p o n s e si n v i v o .JI mmu n o l , 2 0 0 0 ; 1 6 4 ( 9 ) : 4 5 5 8 - 4 5 6 3

18、 . 9S e d l a c e kHH.P h a r ma c o l o g i c a l a s p e c t s o f t a r g e t i n gc a n c e r g e n e t h e r a p yt oe n d o t h e l i a l c e l l s .C r i t R e vOn c o l He ma t o l , 2 0 0 1 ; 3 7 ( 3 ) : 1 6 9 - 2 1 5 . 1 0Ke r b e lR , F o l k ma n J . C l i n i c a lt r a n s l a t i o n

19、o fa n g i o g e n e s i s i n h i b i t o r s .Na t R e vC a n c e r , 2 0 0 2 ; 2 ( 1 0 ) : 7 2 7 - 7 3 9 . 1 1Ki s k e r O, B e c k e r C M, P r o x D , e t a l . C o n t i n u o u s a d mi n i s t r a t i o n o fe n d o s t a t i n b y i n t r a p e r i t o n e a l l y i mp l a n t e d o s mo t

20、i cp u mpi mp r o v e s t h e e f f i c a c ya n dp o t e n c yo f t h e r a p yi na mo u s ex e n o g r a f tt u mo rmo d e l .C a n c e rR e s , 2 0 0 1 ; 6 1 ( 2 0 ) : 7 6 6 9 - 7 6 7 4 . 1 2L i a u G, S u E J , D i x o n KD . C l i n i c a le f f o r t s t o mo d u l a t e a n g i o g e n e s i

21、si nt h ea d u l t :g e n et h e r a p yv e r s u sc o n v e n t i o n a l a p p r o a c h e s .D r u gD i s c o vT o d a y , 2 0 0 1 ; 6 ( 1 3 ) : 6 8 9 - 6 9 7 . ( 2 0 0 50 81 7收稿, 2 0 0 51 12 4修回) 编辑沈进 本刊征稿启事 四川大学学报(医学版) (原华西医科大学学报 )是中文科技核心期刊,曾荣获全国优秀科技期刊一等奖、首届国家期 刊奖提名奖、第二届国家期刊奖百种重点期刊和四川省十佳科技期刊称号。

22、并被美国医学索引 ( I ND E XME D I C US ,I M/ ME D L I NE) 、 生物学文摘 ( B I OL OG I C ALAB S T R AC T S , B A) 、 化学文摘 ( C HE MI C ALAB S T R AC T S , C A) ,荷兰医学文 摘 ( E X C E R P T A ME D I C A, E M) ,俄罗斯文摘杂志 ( AJ ) ,中国科技论文与引文数据库( C S T P C D ) ,中国生物医学文献光盘 数据库( C B Md i s c ) ,中文生物医学期刊文献数据库( C MC C ) ,中国学术期刊网全文数

23、据库( C NKI ) ,中国学术期刊(光盘版) ,万 方数据-数字化期刊群等数据库收录。 为了更好地开展国内外学术交流,促进医药卫生事业的发展,现四川大学学报(医学版) 可对外征稿,凡符合编辑部稿 件要求(见稿约) ,均可向本刊投稿。凡属于国家自然科学基金及其他科研基金资助的来稿,编辑部将适当地给予优先。来稿请 一式两份,电脑打印,并请附上联系电话及E - ma i l 。稿件寄编辑部收,请勿寄给个人。 用英文撰写的稿件投稿时应附上中文稿。英文稿一经采用,刊出时间可提前。 地址:四川省成都市人民南路三段1 7号四川大学学报(医学版)编辑部 邮政编码: 6 1 0 0 4 1 电话/传真: ( 0 2 8 ) 8 5 5 0 1 3 2 0 E - ma i l :h u a x i 1 1 ma i l . s c . c n i n f o . n e t 四川大学学报(医学版)编辑部 505JS i c h u a nUn i v( Me dS c i E d i )Vo l . 3 7No = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = . 42 0 0 6