《NY-T 683-2003 犬传染性肝炎诊断技术.pdf.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY-T 683-2003 犬传染性肝炎诊断技术.pdf.pdf（8页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、I C S 1 1 . 2 2 0 R 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 犬 传 染 性 肝 炎 诊 断 技 术 D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r i n f e c t i o u s canin eh e p a t i t i s 2 0 0 3 - 0 7 - 3 0发布 2 0 0 3 - 1 0 - 0 1 实施 中华人民共和国农业部发 布 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 月 U舌 本标准的附录A为规范性附录 本标准由农业部畜牧兽医局提出并
2、归口 本标准起草单位: 农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人: 田克恭、 王宏伟、 遇秀玲 、 陈西钊、 王传彬、 杨秀勇。 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 犬 传 染 性 肝 炎 诊 断 技 术 1 范 围 本标准规定了犬传染性肝炎( I C H) 的临床诊断、 犬传染性肝炎病毒( I C HV) 的分离与鉴定、 酶联免 疫吸附试验和免疫酶组织化学方法等诊断技术。 本标准适用于犬传染性肝炎的诊断。 2 临床诊断要点 2 . 1 临床症状 最急性病例， 患犬在呕吐、 腹痛和腹泻等症状出现后数小时内死亡。急性型病例， 患犬体温呈马鞍 型升高， 精神抑郁， 食欲废绝， 渴欲增加，
3、呕吐， 腹泻， 粪中带血。亚急性病例， 特征性症状是患犬角膜一 过性混浊， 即“ 蓝眼” 病， 有的出现溃疡。慢性病例多发于老疫区或疫病流行后期， 患犬多不死亡， 可以 ,i :t2 . 2病理变化 病犬主要表现全身性败血症变化。在实质器官、 浆膜、 粘膜上可见大小、 数量不等的出血斑点。肝 肿大， 呈斑驳状， 表面有纤维素附着。胆囊壁水肿增厚， 灰白色， 半透明， 胆囊浆膜被覆纤维素性渗出物， 胆囊的变化具有一定的诊断意义。 3 病毒分离与鉴定 3 . 1 材料准备 3 . 1 . 1 试荆 3 . 1 . 1 . 1 改良最低要素营养液( D ME M) 培养基， 配方见第A . I 章
4、3 . 1 . 1 . 2 犬肾传代细胞( MD C K细胞) 。 3 . 1 . 1 . 3 标准阳性血清: I C H V单克隆抗体， 中和抗体效价 1 ， 1 0 2 4 . 3 . 1 . 1 . 4 标准阴性血清: 无 I C H V感染的犬血清。 3 . 1 . 1 . 5 新生牛血清， 青霉素， 链霉素 3 . 1 . 2 器材 a ) 细胞培养瓶; b ) 吸管; c ) 二氧化碳培养箱; d ) 3 7 恒温水浴箱; c ) 普通冰箱及低温冰箱; f ) 离心机及离心管; 9 ) 研磨器械; h ) 普通光学显微镜; ; ) 微量加样器， 容量 5 V L -5 0 p 1
5、-5 0 p L -2 0 0 P L ; j ) 0 . 4 5 p m微孔滤膜。 3 . 1 . 3 样品 I C HV存在于病犬扁桃体、 肝脏、 脾脏等组织器官中。无菌采集这些器官用无血清 D ME M制成 2 0 N组织悬液. 3 0 0 0 r / mi n离心 3 0 mi n 。取上清 1 0 0 0 0 r / mi n离心 2 0 mi n ， 取上清用于 I C HV分离。 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 3 . 2 操作方法 3 . 2 . 1 细胞培养 用含8 %新生牛血清的 D ME M培养基， 在 3 7 C 一 培养 MD C K细胞。每 3 d -
6、4 d传代一次， 细胞长 成单层时， 用于I C H V分离。 3 . 2 . 2 病料接种 将。 . 1 m1处理好的组织悬液接种 MD C K细胞， 3 7 吸附I h ， 加人无血清D ME M继续培养3 d - sd ， 观察结果 3 . 2 . 3 结果观察 I C H V感染M D C K细胞3 d - 5 d 表现为细胞增大变圆、 变亮、 折光性增强、 聚集成葡萄串状。 若第 一次接种未出现细胞病变， 应将细胞培养物冻融后盲传三代。如仍无细胞病变， 则判为 I C H V检测 阴性 。 3 . 2 . 4 I C H V的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物， 用 1 %人“ ()，
7、 型红细胞进行血凝试验， 血凝试验阳性者， 再用 I C H V 单克隆抗体进行血凝抑制试验， 鉴定毒株。 酶联免疫 吸附试验 4 . 1 材料准备 4 门. 1 试剂 4 . 1 . 1 . 1 E I 1 S A抗原包被板。 4 . 1 . 1 . 2 标准阳性血清: 用I C H V抗原免疫犬获得的血清。 4 . 1 . 1 . 3 标准阴性血清: 无工 C H V感染的犬血清 4 . 1 . 1 . 4 酶结合物: 辣根过氧化物酶( HR P ) 标记兔抗犬 1 以; 。 4 . 1 . 1 . 5 磷酸盐缓冲液( P B S ) : 配制见第A . 2 章。 4 . 1 . 1 .
8、6 洗涤液: 配制见第 A . 3 章 4 . 1 . 1 . 7 样品稀释液: 配制见第 A . 4 章 4 . 1 . 1 . 8 底物溶液: 配制见第 A . 6 章. 4 . 1 . 1 . 9 终止液: 配制见第 A . 7 章 4 . 1 . 2 器材 a ) 酶联检测仪; 1 ) ) 微量加样器， 容量5 0 川 -2 0 0 v 工 ; 。 ) 3 7 0 C 恒温培养箱 4 . 1 . 3 样品 采集被检犬血液， 分离血清。血清应新鲜、 透明、 不溶血、 无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 或一3 0 0 C 保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号， 并用样品稀释液作 1 :
9、 1 6 0倍稀释。 4 . 2 操作方法 4 . 2 . 1 试验设阴性对照、 阳性对照各两孔和空白对照一孔。 4 . 2 . 2 在微孔反应板孔中加入 1 1 6 0 稀释的待检血清、 阴性对照血清、 阳性对照血清各 1 0 0川 ， 充分 混匀后， 置3 7 作用2 0 m i n , 4 . 2 . 3 弃去各孔中液体、 甩干。每孔加满洗涤液漂洗三次， 每次 2 m i n ， 甩干 4 . 2 . 4 每孔加人酶结合物 1 0 0/ 1 ， 置3 7 0C 作用2 0 m i n , 4 . 2 . 5 重复 4 . 2 . 3 4 . 2 . 6 每孔加人底物液 1 0 0 p L
10、 ， 置 3 7 C 避光显色 1 0 mi n , 4 . 2 . 7 每孔加人终止液5 0 川 ， 置酶联检测仪于4 5 0 n m波长测定各孔吸光度( O D ) 值。 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 4 . 3 结果判定 4 . 3 . 1 阳性对照血清 O D值)0 . 8 ; 阴性对照血清 O D值簇0 . 工 ， 试验成立. 4 . 3 . 2 若阴性对照O D均值一空白对照O D值小于。 . 0 3 , 按0 . 0 3 计算。 4 . 3 . 3 临界值的计算: 临界值二0 . 1 7 +( 阴性血清对照孔O D均值一空白对照孔 O D值) 。 4 . 3 .
11、4 待检样本的O D值一空白对照O D值所得的差)临界值， 即判为I C H V抗体具有保护效价; 小 于临界值， 即判为I C H V抗体未达到保护效价。 5 免疫酶组织化学法 51 材料准备 5 . 1 . 1 试荆 5 . 1 . 1 . 1 磷酸盐缓冲液( P B S ) : 配制见第 A . 2 章 5 . 1 . 1 . 2 标准阳性血清; I C H V单克隆抗体， 中和抗体效价 1 ， 1 0 2 4 5 . 1 . 1 . 3 标准阴性血清: 无I C H V感染的犬血清。 5 . 1 . 1 . 4 酶结合物: HR P标记的S P A. 5 . 1 . 1 . 5 底物溶
12、液: 配制见第 A . 8章。 5 . 1 . 1 . 6 过氧化氢甲醇溶液: 配制见第 A . 9章 5 . 1 . 1 . 7 盐酸酒精溶液: 配制见第 A . 1 0章. 5 . 1 . 1 . 8 胰蛋白酶溶液: 配制见第 A . 1 1 章。 5 . 1 . 2 器材 a ) 普通光学显微镜 ; b ) 微量加样器， 容量5 0 I 一2 0 0 p ; c ) 石蜡切片机或冷冻切片机; d ) 载玻片及盖玻片; e ) 3 7 恒温培养箱或水浴箱。 5 . 1 . 3 样品 对疑似 I C H V的病死犬或扑杀犬， 立即采集肝、 扁桃体等组织数小块， 置冰瓶内立即送检。不能立 即送
13、检者， 将组织块切成 1 c m X 1 e m左右大小， 置体积分数为 1 0 %的福尔马林溶液中固定， 保存， 送检 5 . 2 操作方法 5 . 2 . 1 新鲜组织按常规方法制备冰冻切片。冰冻切片风干后用丙酮固定1 0 mi n -1 5 m i n ; 新鲜组织或 固定组织按常规方法制备石蜡切片， 常规脱蜡至P B S ( 切片应用白胶或铬矶明胶做粘合剂， 以防脱片) 。 5 . 2 . 2 去内源酶: 用过氧化氢甲醇溶液或盐酸酒精溶液 3 7 作用 2 0 mi n 5 . 2 . 3 胰蛋白酶消化: 室温下， 用胰蛋白酶溶液消化处理2 m i n ， 以便充分暴露抗原。 5 .
14、2 . 4 漂洗; P B S漂洗三次， 每次5 mi n , 5 . 2 . 5 封闭: 滴加体积分数为5 %的新生牛血清或1 : 1 0 稀释的正常马血清， 3 7 湿盒中作用3 0 m i n e 5 . 2 . 6 加适当稀释的标准阳性血清或标准阴性血清, 3 7 0C 湿盒中作用 I h或3 7 0C 湿盒中作用 3 0 m i n 后 4 过夜。 5 . 2 . 7 漂洗同5 . 2 . 4 e 5 . 2 . 8 加适当稀释的酶结合物， 3 7 0C 湿盒作用 1 : 。 5 . 2 . 9 漂洗同5 . 2 . 4 . 5 . 2 . 1 0 底物显色: 新鲜配制的底物溶液显色
15、5 mi n -1 0 m i n后， 用 P B S漂洗两次， 去离子水漂洗一次。 5 . 2 . 1 1 衬染: 苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞质。 5 . 2 . 1 2 从9 0 %乙醇开始脱水、 透明、 封片、 普通光学显微镜观察。 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 5 . 2 . 1 3 试验同时设阳性对照和阴性对照。 5 . 3 结果判定 阳性和阴性对照片本底清晰， 背景无非特异着染， 阳性对照组织细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染， 试 验成立; 被检组织细胞胞浆、 偶见胞核呈黄色至棕褐色着染， 即可判为 I C HV抗原阳性 6 综合判定 当在临床上怀疑有 I C H V
16、感染时， 可根据实际情况在上述方法中选一种或两种方法进行确诊。对 于未接种过 I C HV疫苗的犬， 采用任何一种方法检测呈现阳性结果时， 都可最终判定为 I C HV感染犬。 对于接种过I C HV疫苗的犬， 当病毒分离鉴定试验为阳性结果时， 可最终判定为I C H V感染犬; 当采用 酶联免疫吸附试验检测血清抗体呈现阳性结果时， 可判为I C H V抗体具有保护效价; 呈现阴性结果时， 可判为I C H V抗体未达到保护效价。 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 试剂 的配 制 D ME M( 高加) 培养液 量取去离子水 9 5 0 ml ， 置于适宜
17、的容器中。 将D M E M粉剂1 0 g 加于3 0 的去离子水中， 边加边搅拌。 每1 。 。 。 m l培养液加3 . 7 g 碳酸氢钠。 加去离子水至1 0 0 0 m l ， 用 1 m o l / 工氢氧化钠或盐酸将培养液 p H值调至p H 6 . 9 - 7 . 0 ， 盖紧 AAAAA 容器瓶塞 A . 1 . 5 立即用孔径0 . 4 5 p m的微孔滤膜正压过滤除菌， 4 冰箱保存备用。 A . 2 磷酸盐缓冲液( P B S , 0 . 0 1 mo l / L p H 7 . 4 ) 抓化钠 抓化钾 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 8g 0 . 2 g 0 .
18、2 g 2 . 8 39 加至 1 0 0 0 ml A . 3 洗涤液 Pl i S 吐温一 2 0 1 0 0 0 m l 0 _ 5 m l A . 4 样品稀释液 含体积分数为 1 0 %新生牛血清的洗涤液。 A . 5 磷酸盐一 柠橄酸级冲液( p H 5 . 0 ) 柠檬酸 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 3 . 2 6 g 1 2 . 9 g 7 0 0 m 1 A . 6 E L I S A底物溶液 用二甲基亚矾将 3 3 5 5 - 四甲基联苯胺( T M B ) 配成1 %浓度， 4 保存。使用时按下列配方配制底 物溶液。 磷酸盐一 柠檬酸缓冲液9 . 9 M L 1 %3 3
19、5 5 - 四甲基联苯胺0 . 1 m l . 3 0 %双氧水1 川 N Y / T 6 8 3 -2 0 0 3 A . 7 终止液( 2 m o t / L硫酸) 硫酸 蒸馏水 5 8 mL 4 4 2 m 1 A . 8 免疫酶组织化学底物溶液 3 , 3 一 二胺基联苯胺盐酸盐( D A B ) P BS 丙酮 3 0 %过氧化氢 滤纸过滤后使用， 现用现配。 4 0 mg 1 0 0 mL 5mL 0 . 1 mL A . 9 过叙化氢甲醉溶液( 0 . 3 %) 3 0 %过氧化氢 甲醉 现用现配 。 1mL 9 9 mL A . 1 0 盐酸酒精溶液( 1 0/ a ) 盐酸 7 0 %乙醇 1 mL 9 9 - L A . 1 1 肢蛋白西溶液( 0 . 5 %) 胰蛋白酶 PBS 低温保存。使用时， 用 P B S 稀释为0 . 0 5 鱿。 0 . 5 g 1 0 0 m 1 .