NY-T 772-2004 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法.pdf.pdf

《NY-T 772-2004 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法.pdf.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《NY-T 772-2004 禽流感病毒 RT-PCR 试验方法.pdf.pdf（14页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、I C S 1 1 . 2 2 0 B 4 1 NY 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 禽流感病毒 R 丁 一 P C R 试验方法 2 0 0 4 - 0 2 - 1 7 发布2 0 0 4 一 0 2 一 1 7 实施 中 华 人 民 共 和 国农 业 部发 布 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 前 州 曰 曰 本标准由中华人民 共和国 农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准推荐了两种试验方法。 本标准中附录A 、附录 C 为规范性附录， 附录B 、附录 D为资料性附录。 本标准起草单位

2、：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、 农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王秀荣、 孙明、刘明、王宏伟、陈化兰、刘丽玲。 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 禽流感病毒 R T 一P C R试验方法（ 一） 范围 本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒H 5 , H 7 , H 9 血凝素亚型及N l , N 2 神经 氨酸酶亚型的R T 一 P C R 鉴别技术。 本标准适用于检测禽组织、 分泌物、 排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。 2 规范性引用文件 下列文件中的 条款通过本标准的引用而成为本标准的条款， 凡是注日 期的引用文件， 其随后所有的 修改单（ 不包括

3、勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件， 其最新版本适用于 本标准。 G B / T 1 8 9 3 6 高致病性禽流感诊断技术 3 实验室条件 3 . 1仪器： P C R仪、 台式低温高速离心机、 电泳仪、 电泳槽、 冰箱、 手提紫外线灯、 紫外凝胶成像仪、 微量 移液器、 水浴箱等。 3 . 2 从事 R T- P C R工作的实验室尽可能分区， 根据条件划分出 R N A提取区、 基因扩增区、 电泳区。 特别注意电 泳后的琼脂糖凝胶要及时处理， 避免对实验室造成污染。 3 . 3 注意

4、个人防护和环境保护， 电泳中用到的E B可诱发基因突变， 试验中被 E B 污染的 物品要有专用 收集处， 并通过焚烧进行无害化处理。 4 试剂的准备 4 . 1 试剂 4 . 1 1 变性液见 A . 1 . 4 . 1 . 2 2 M醋酸钠溶液（ p H 4 . 0 ） 见A . 2 o 4 . 1 3 水饱和酚( p H 4 . 0 ) 0 4 . 1 . 4 氯仿 异戊醇混合液见 A . 3 a 4 . 1 . 5 M一 ML V反转录酶( 2 0 0 u 乍L ) a 4 1 . 6 R N A酶抑制剂（ 4 0 u 今L ) a 4 1 . 7 T a q D N A聚合酶( 5

5、u / x L ) 。 4 . 1 . 8 1 . 0 琼脂糖凝胶见A . 4 o 4 . 1 . 9 5 0 x T A E 缓冲 液见 A . 5 . 4 . 1 1 0 澳化乙锭（ 1 0 tt g 今L ） 见A. 6 . 4 . 1 1 1 加样缓冲液见 A . 7 o 4 . 1 1 2 焦碳酸二乙酪( D E P C ） 处理的灭菌双蒸水见 A . 8 . 4 . 1 1 3 5 x 反转录反应缓冲液见A. 9 . 4 1 1 4 2 . 5 m m o l d N T P s 见 A . 1 0 . 4 . 1 1 5 1 0 x P C R B u f f e r 见 A.

6、1 1 o N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 4 . 1 . 1 6 D N A 分子量标准。 4 . 2 引物 见附录 B , 操作程序 5 . ！ 样品的采集和处理 按照G B / T 1 8 9 3 6中提供的方法进行。 5 . 2 R N A的提取 5 . 2 . 1 设立阳 性样品对照、 阴性样品对照。 5 . 2 . 2 异硫氛酸观一步法 5 . 2 . 2 . 1 将组织或细胞中加人适量的变性液， 匀浆。 5 . 2 . 2 . 2 将混合物移至一管中， 按每毫升变性液中立即加人0 . 1 m L乙酸钠、 1 M L酚, 0 .2 m L 氯仿 异 戊醇混合液。加人每

7、种组分后， 盖上管盖， 倒置混匀。 5 . 2 . 2 . 3 将匀浆剧烈振荡1 0 s ， 冰浴1 5 m in ， 使核蛋白质复合体彻底裂解。 5 . 2 . 2 . 4然后1 2 0 0 0 r p m , 4 离心2 0 m i n ， 将一上 层 含R N A的 水 相移人一 新管中 。 为了降 低被 处于 水 相和有机相分界处的D N A污染的可能性， 不要吸取水相的最下层。 5 . 2 . 2 . 5 加入等体积的异丙醇， 充分混匀液体， 并在一 2 0 条件下沉淀 R N A 1 h 或更长时间。 5 . 2 . 2 . 6 4 1C 1 2 0 0 0 r p m离心1 0

8、m in ， 弃上清， 再用7 5 的乙醇洗涤沉淀； 然后离心， 再用吸头彻底吸 弃上清， 在自 然条件下干燥沉淀， 溶于适量D E P C 处理的水中。- 2 0 贮存， 备用。 5 . 2 . 3 选择市售商品化 R N A提取试剂盒， 完成 R N A的提取。 5 . 3 反转录 5 . 3 . 1取5 p L R N A ， 加1 p L 反 转录 引物， 7 0 *C 5 m in , 5 . 3 . 2 冰浴2 m i n , 5 . 3 . 3 继续加人： 5 x 反转录反应缓冲液4 p L 0 . 1 M D T T 2 p L 2 . 5 m m o l d N T P s

9、2 p l _ M一 ML V反转录酶0 . 5 p L R N A酶抑制剂0 . 5 p L D E P C水1 1 L 3 7 水浴 1 h ， 合成 c D N A链。 取出后， 可以直接进行P C R ， 或者放于一 2 0 保存备用。 试验中同时 设立阳性对照和阴 性对照。 5 . 4 P C R 根据扩增目的的不同， 选择不同的上、 下游引物， M - 2 2 9 U / M - 2 2 9 L 是型特异性引物， 用于扩增禽 流感病毒的 M基因片段； H 5 一3 8 0 U / H 5 一 3 8 0 L , H 7 一 5 0 1 U / H 7 一 5 0 1 L , H 9

10、 一 7 3 2 U / H 9 一 7 3 2 1 . 分别特 异性扩增 H 5 , H 7 , H 9 亚型血凝素基因片段； N 1 一 3 5 8 U / N 1 一 3 5 8 L , N 2 一 3 7 7 U / N 2 一 3 7 7 L 分别特异性 扩增 N 1 , N 2 亚型神经氨酸酶基因片段。 P C R 为5 0 IA L 体系， 包括： 双蒸 灭菌 水3 7 . 5 讨 J 反转录产物4 it L 上游引物0 . 5 t L N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 下游引 物0 . 5 p L 1 0 x P C R B u f f e r 5 p L 2 .

11、5 n u n o l d N T P s 2 p L T a q 酶0 . 5 p L 首先加人双蒸灭菌水， 然后再按照顺序逐一加人上述成分， 每一次要加人到液面以下。全部加完 后， 混 悬， 瞬 时离 心， 使液 体都 沉降到P C R 管 底。 在 每个P C R 管中 加入1 滴液 体 石蜡（ 约2 0 p L ) 。 循环 参数为 9 5 C 5 m i n , 9 4 r- 4 5 s , 5 2 C 4 5 s , 7 2 C 4 5 s ， 循环 3 0 次， 7 2 延伸6 m in 结束。设立阳性对照和阴 性对照。 5 . 5 电泳 5 . 5 . 1 制备 1 . 0 琼

12、脂糖凝胶板， 见A . 4 . 5 . 5 . 2取5 p L P C R 产物， 与0 . 5 p L 加样 缓冲 液混 合， 加 人琼 脂糖 凝胶 板的 加样 孔中 。 5 . 5 . 3 加人分子量标准。 5 . 5 . 4 盖好电泳仪， 插好电极， 5 V / c m电压电泳， 3 0 m in - - 4 0 m in a 5 . 5 . 5 在手提紫外线灯下观察； 或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档， 打印。 5 . 5 . 6 用分子量标准比较， 判断P C R片段大小。 6 结果判定 6 . 1 在阳 性对照出现相应大小扩增带、 阴性对照无此带出现的情况下判定结果。 6 . 2

13、用M一 2 2 9 U / M一 2 2 9 L 检测， 出现大小约2 2 9 b y 扩增片段时， 判定为禽流感病毒阳性， 否则判定 为阴性。 6 . 3用H 5 一 3 8 0 U / H 5 一 3 8 0 L 检测， 出 现大 小约3 8 0 b y 扩增片 段时， 判定 为H 5 血 凝素亚型 禽流 感病 毒阳性， 否则判定为阴性。 6 . 4 用H 7 一 5 0 1 U / H 7 一 5 0 1 L检测， 出现大小约5 0 1 b y 扩增片段时， 判定为H 7 血凝素亚型禽流感病 毒阳 性， 否则判定为阴 性。 6 . 5 用H 9 一 7 3 2 U / H 9 一 7 3

14、 2 L检测， 出现大小约7 3 2 b y 扩增片段时， 判定为1 -1 9 血凝素亚型禽流感病 毒阳 性， 否则判定为阴 性。 6 . 6 用N 1 一 3 5 8 U/ N l 一 3 5 8 L检测， 出现大小约3 5 8 b y 扩增片段时， 判定为N 1 神经氨酸酶亚型禽流 感病毒阳性， 否则判定为阴性。 6 . 7 用N 2 一 3 7 7 U / N 2 一 3 7 7 L检测， 出现大小约3 7 7 b y 扩增片段时， 判定为N 2 神经氨酸酶亚型禽流 感病毒阳性， 否则判定为阴性。 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 禽流感病毒 R T 一P C R试验方法（

15、二） 范围 本标准规定了禽流感病毒型特异性检测技术和禽流感病毒 H 5 , H 7 , H 9 血凝素亚型的反转录聚合 酶链反应（ R T一 P C R ) 鉴别诊断技术。 本标准适用于检测禽组织、 分泌物、 排泄物和鸡胚尿囊液中禽流感病毒核酸。 2 试剂 2 . 1 变性液见 C . l o 2 . 2 2 m o l / L 醋酸钠溶液（ p H 4 . 0 ) 见C . 2 o 2 . 3 酚 氯仿/ :R 戊醇混合液见 C . 3 o 2 . 4 2 . 5 m m o l / L d N T P见 C . 4 o 2 . 5 1 0 x P C R缓冲液见 C . 5 . 2 . 6

16、 澳化乙锭（ E B ) 溶液见 C . 6 o 2 . 7 T A E电 泳缓冲液见 C . 7 o 2 8 2 琼脂糖凝胶见 C . 8 o 2 . 9 上样缓冲液见 C . 9 a 2 . 1 0 1 0 p m o l车L R T- P C R引物见附录D o 2 . 1 1其他 试剂： 5 p T a q D N A聚 合 酶, 1 0 1 .小 L A M V反 转录 酶， 4 0 K 乍 L, R N A酶 抑 制剂， 异丙 醇, 7 0 % 乙醇。 3 实验室条件 3 . 1 实验室应配备的仪器 分析天平、 台式冷冻高速离心机、 真空干燥器、 制冰机、 P C R扩增仪、 电泳

17、仪、 电泳槽、 紫外凝胶成像 仪（ 或紫 外 分析 仪） 、 液 氮罐 或一 7 0 冰箱、 微波 炉、 组 织研 磨器、 一 2 0 冰 箱、 可 调移液器（ 2 1 .L , 2 0 jA L , 2 0 0 1 L , 1 0 0 0 1 L ) o 32 实验室分区 P C R整个试验分 P C R反应液配制区 配液区、 模板提取区、 扩增区、 电泳区。 流程顺序为配液区 模板提取区 、扩增区，电泳区。 严禁器材和试剂倒流。 4 操作程序 4 . 1 样品的采集及处理 4 . 1 . 1 样品的采集 病死或扑杀禽， 取脑、 肺等组织； 待检活禽， 用棉拭子蘸取气管分泌物或泄殖腔排泄物，

18、 放于 5 0 甘 油生理盐水中（ 要求送检病料新鲜， 严禁反复冻融病料） 。 4 . 1 . 2 样品的处理 4 . 1 . 2 . 1 组织样品处理 称取待检病料0 . 0 5 g ， 置于研磨器中剪碎并研磨， 加人6 0 0 p L变性液继续研磨。取已 研磨好的待 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 检 病 料上清3 0 0 p L ， 置 于1 . 5 m L 灭菌 离心管中， 加人1 0 0 t .L 变性 液， 混匀。 4 . 1 . 2 . 2 分泌物和排泄物样品处理 将棉 拭子 充分 捻动、 拧干 后弃去 拭 子。 4 C 8 0 0 0 r p m离心5 m in

19、， 取上 清1 0 0 p L ， 置于1 . 5 m L 灭 菌离心管中， 加人3 0 0 Ii L 变性液， 混匀。 4 . 1 . 2 . 3 阳性对照处理 取禽 流感 病毒 液1 0 0 p .L， 置于1 . 5 m L 灭菌 离心管中， 加人3 0 0 p .L 变 性液， 混匀。 4 . 1 . 2 . 4 阴性对照处理 取灭 菌双 蒸水1 0 0 p L， 置 于1 . 5 m L 灭菌 离心 管中， 加人3 0 0 t i L 变 性液， 混匀。 4 . 2 病毒 R N A的提取 4 . 2 . 1取已 处理的 待 检 样品以 及阴 性对照、 阳 性对照， 每管 依次加人醋

20、 酸钠 溶液3 0 Ii L 、 酚墩仿屏戊 醇 混 合液3 0 0 t .L , 颠 倒1 0 次混 匀， 冰 浴1 5 m i n , 4 r 1 0 0 0 0 r p m离心1 5 m in . 4 . 2 . 2取上 清3 0 0 p .L 置于 新的 经D E P C 水处 理过的1 . 5 m L 灭菌 离心 管中， 加人 等体 积异 丙醇， 混 匀， 置于液氮中3 m in 或一 7 0 冰箱2 0 m i n 。取出样品管， 室温融化， 4 C 1 5 0 0 0 r p m离心2 0 m in . 4 . 2 . 3 弃上清， 沿管壁缓缓滴人 1 m L7 0 乙醇， 轻轻

21、旋转洗一次后倒掉， 将离心管倒扣于吸水纸上 1 m in， 真空干燥 1 5 m in 。 4 . 2 . 4用1 0 u L 无R N A 酶的 灭 菌双 蒸水和1 j L R N A 酶抑 制剂 溶解沉 淀。一 2 0 储 存备用。 4 3 R T 一PC R 4 . 3 . 1 引物选用 4 . 3 . 1 . 1 型特异性引物用于检测禽流感病毒核蛋白基因（ N P ） 片段。 4 . 3 . 1 . 2 H 5 亚型引物用于检测禽流感病毒 H 5 亚型血凝素基因（ H A ） 片段。 4 . 3 . 1 . 3 H 7 亚型引物用于检测禽流感病毒 H 7 亚型血凝素基因（ H A ）

22、片段。 4 . 3 . 1 . 4 H 9 亚型引物用于检测禽流感病毒 H 9 亚型血凝素基因（ H A ） 片段。 4 . 3 . 2 反应体系 本 试验 为反 转录 和P C R 扩 增同时 进 行， 反 应液 总体 积为2 5 A L . D E P C 处理的 灭 菌双 蒸水1 3 I L 2 . 5 m m o l / L d N T P 2 . 5 t i L 1 0 p m o l 今L R T 一 P C R引物1 . 5 ,u L 1 5 m m o l / L 氯化镁2 t A L 1 0 x P C R缓冲液2 . 5 p .L A M V 反转 录酶0 . 2 t A

23、L R N A酶抑制剂0 . 3 ji L , 5 u T a q D N A 聚 合酶1 Ii L 提取的样品R N A 2 y L 混 匀 并做 好 标记， 加人2 0 I L 矿物油覆盖， 在P C R扩 增仪上进行以 下循环： 4 2 C 4 5 m in , 9 5 C 3 m i n ; 扩增条件为9 5 1C 3 0 s , 5 0 C 4 0 s （ 用型特异性引物时， 为5 5 r- 4 0 s ) , 7 2 C 4 0 s , 3 5 个循环后， 7 2 延 伸 1 0 m in . 4 . 4 电泳 取P C R 扩 增产 物1 5 p L 与3 fL L 上 样缓冲

24、液 混合， 点样 于2 琼 脂糖凝 胶孔中， 以5 V / C M电 压进 行 电泳， 4 0 m in ， 紫外凝胶成像仪或紫外分析仪上观察结果。 5 结果判定 5 . 1 在阳性对照出现相应大小扩增带、 阴 性对照无带此出 现的情况下判定结果。 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 5 . 2 用型特异引物检测被检样品出现3 3 0 b y 条带时， 判定为禽流感病毒阳性， 否则为阴性。 5 . 3 用H 5 亚型引物检测被检样品出现5 4 5 b y 条带时， 判定为H 5 亚型禽流感病毒阳性， 否则为阴性。 5 . 4 用H 7 亚型引物检测被检样品出现6 3 4 b y 条带

25、时， 判定为H 7 亚型禽流 感病毒阳性， 否则为阴性。 5 . 5 用H 9 亚型引物检测被检样品出现4 8 8 b y 条带时， 判定为H 9 亚型禽流感病毒阳 性， 否则为阴性。 N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 附录A （ 规范性附录） 相关试剂的配制 A . 1 变性液 4 M 异硫氰酸肌 2 5 m M柠檬酸钠 2 姚O 0 . 5 %( m / V ） 十二烷基肌酸钠 0 . 1 M R 一 琉 基乙 醇 具体配制： 将2 5 0 g 异硫氰酸肌, 0 . 7 5 M（ p H 7 . 0 ） 柠檬酸钠1 7 . 6 m L和2 6 . 4 m L 1 0 % ( m

26、 / V ） 十二 烷基肌酸钠溶于2 9 3 m L 水中。 6 5 条件下搅拌、 混匀， 直至完全溶解。室温条件下保存， 每次临用前按 每5 0 m L 变 性 液加 人1 4 . 4 m o l / L 的p 一 琉基乙 醇0 . 3 6 m L 的 剂 量 加人。 变性 液可 在室温 下 避光 保存 数 月。 A . 2 2 m o l 几 乙酸钠溶液 p H 4 . 0 ) 乙酸钠 冰乙酸 灭菌双蒸水 1 6 . 4 g 调p H至4 . 0 加至 1 0 0 m L A . 3 撅仿 异戊醉混合液 氯仿 异戊醇 4 9 mL 1 mL A . 4 1 . 0 %琼脂糖凝胶的配制 琼脂

27、糖 0 . 5 x T A E电泳缓冲液 1 . 0 g 加至 1 0 0 M L 微波炉中 完全 融化， 待冷 至5 0 C - 6 0 时， 加 澳化乙 锭（ E B ) 溶 液5 p .L ， 摇匀， 倒入电 泳板 上， 凝固 后 取下梳子， 备用。 A - 5 5 0 x T A E电泳缓冲液 A. 5 A. 5 . 2 0 . 5 m o l 几 乙二按四乙酸二钠（ E D T A ) 溶液 （ p H 8 . 0 ) 二水乙 二馁四乙酸二钠 灭菌双蒸水 氢氧化钠 灭菌双蒸水 T A E电泳缓冲液（ 5 0 X） 配制 经基甲 基氨基甲 烷（ T ri s ) 冰乙酸 0 . 5 m

28、 o l / L乙二铁四乙酸二钠溶液（ p H 8 . 0 ) 灭菌双蒸水 1 8 . 6 1 g 8 0 n 止 调p H至8 . 0 加至 1 0 0 ML 2 4 2 g 5 7. 1 mL 1 0 0 ML 加至 1 0 0 0 M L N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A . 6 澳化乙锭（ E $ ) 溶液 澳化乙锭 灭菌双蒸水 2 0 m g 加至 2 0 m L A . 7 1 0 x 加样缓冲液 聚蔗糖 灭菌双蒸水 澳酚蓝 二甲苯腊 2 5 g 1 0 0 mL 0 . 1 g 0 . 1 g A. 8 D E P C水 超纯水1 0

29、0 m L 焦 碳酸二乙 醋( D E P C ) 5 0 p L 室温过夜， 1 2 1 高压 1 5 m in， 分装到 1 . 5 m L D E P C 处理过的 微量管中。 A. 9 M-ML V反转录酶 5 x反应缓冲液 1 m o L T r is 一 H C l ( p H 8 . 3 ) K C l M g C 12 DTT 灭菌双蒸水 5 mL 0 . 5 5 9 g 0 . 0 2 9 g 0 . 1 5 4 g 加至 1 0 0 m l - 2 0 p L 2 0 p L 2 0 p L 2 0 p L A . 1 1 1 0 x P C R缓冲液 1 M T r is

30、 一 H C l ( p H 8 . 8 ) 1 M KC l No n i d e t P 4 0 1 . 5 m o L Mg C 1 2 灭菌双蒸水 1 0 mL 5 0 mL 0 . 8 mL 1 mL 加至 1 0 0 m L N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 附录B 资料性附录） 禽流感病毒 R T - P C R试验用引物 B . 1 反转录引物 U n i 1 2 : 5 一 A G C A A A A G C A G G 一 3 ， 引物浓度为 2 0 p m o l o B . 2 P C R引物 见表B . 1 ， 引物浓度均为2 0 p m o l o 表

31、BP C R过程中 选择的引物 引物名称引物序列 长度 b y 扩增目的 M 一2 2 9 U5 一 T TC I A A C C G A G G T U G A A A ( ： 一 3 2 2 9 通用引物 M 一2 2 9 L5 一 A A G C G T C T A C G C T G C A G T C C 一 3 1 1 5一3 8 0U5 ， 一 A G T G A A T T G G A A T A T G G T A A C T G一3 3 8 0H5 HS一3 8 0L5 一 A A C T G A G T G T T C A T T T T G T U A A I ， 一

32、3 H7一5 0 1 U 5 一 A A T G C A C A R G G A G G A G G A A C T一 3 5 0 1 H7 H7一5 01 L5 一 T G A Y G C C C C G A A G C T A A A C C A一 3 H9一7 3 2 U 5 ， 一 T C A A C A A A C T C C A C C G A A A C T G T一 3 7 3 2H9 H9一7 3 2L5 ， 一T C C C G T AA G AA C AT G TC C AT A C C A一3 N1一3 5 8 U 5 一A TT R AA A TA C A AY GG

33、 Y AT AA T AA C一3 3 5 8 N1 N1一3 5 8L5 ， 一（ TC WC C GA AA A CY C C ACI Y ,C A一3 N2一3 7 7U 5 ， 一 （ i T G T G Y A T A G C A h G G T C C A G C T C A A G一 3 3 7 7N2 N2一3 7 7L5 一 G A G C C Y T T C C A R T T G T C “ i C 1 G C A一3 注： W ( A T ) ; Y 二（ C T ) ; R ( A G ) o N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 附录C （ 规范性附录） 试

34、剂的配制 C . 1 变性液 柠檬酸钠 一 卜 二烷基肌氨酸钠 R 一 琉基乙醇 硫氰酸肌 灭菌双蒸水 0 . 7 6 4 g 0 . 5 g 0 8 6 8 mL 4 7 . 2 8 g 加至 1 0 0 m L C . 2 2 m o l 几 乙酸钠溶液（ p H 4 . 0 ) 乙酸钠 冰乙酸 灭菌双蒸水 1 6 . 4 g p H至4 . 0 加至 1 0 0 m L C . 3 酚 级仿 异戊醇混合液 酸性酚 氯仿 异戊醇 5 0 mL 4 9 mL 1 ml C. 4 2. 5 mmo l / L d 1 V T P d A T P ( 1 0 0 m m o l / L ) d

35、T T P ( 1 0 0 n u n o l / L ) d G T P ( 1 0 0 m m o l / L ) d G i P ( 1 0 0 m m o l / L ) 灭菌双蒸水 2 0 t L L 2 0 lA L 2 0 p .L 2 0 p .L 力 f 至8 0 0 p L C . 5 1 0 X P C R缓冲液 灭菌双蒸水 三经甲 基氨基甲 烷（ l r is ) 氯化钾 曲 拉通 X 一 1 0 0 盐酸 灭菌双蒸水 7 0 mL 0 . 1 5 8 g 0 . 3 7 3 g 0 1 mL 调 p H至 9 . 0 加至 1 0 0 mL C . 6 澳化乙锭( E

36、 B ) 溶液 嗅化 乙锭 灭菌双蒸水 0 . 2 g 加至 2 0 n i l- C . 7 T A E电泳缓冲液【 5 0 X） C . 7 . 1 0 . 5 m o l / L . 乙 二铁四乙 酸二钠（ E D T A ) 溶液（ p H 8 . 0 ) N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 C. 7 2 二水乙二钱四乙酸二钠 灭菌双蒸水 氢氧化钠 灭菌双蒸水 T A E电泳缓冲液（ 5 0 X） 配制 三轻甲基氨基甲烷（ T ri s ) 冰乙酸 0 . 5 m o l / L乙二钱四乙酸二钠溶液（ p H 8 . 0 ) 灭菌双蒸水 用时用灭菌双蒸水稀释使用。 1 8 .

37、 6 1 g 8 0 mL 调p H至8 . 0 加至 1 0 0 m L 2 4 2 g 5 7. 1 mL 1 0 0 mL 加至 1 0 0 0 M L C. 82 琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 T A E电泳缓冲液（ 5 0 X） 灭菌双蒸水 微波炉中完全融化， 加澳化乙锭（ E B ) 溶液5 0 p .L . 上样缓冲液 4 g 4 mL 1 9 6 mL C. 9 澳酚蓝0 . 2 g ， 加双蒸水1 0 m L 过夜溶解。5 0 g 蔗糖加人5 0 m L 水溶解后， 移人已溶解的澳酚蓝溶 液中， 摇匀定容至1 0 0 m L o N Y / T 7 7 2 -2 0 0 4 附录

38、D 资料性附录） 禽流感病毒R T - P C R 试验用引物 D . 1 1 0 p m o l 小L型特异性引物配制 2 O D的 上游 型 特异 性引 物加 灭菌 双 蒸水至4 6 2 I L , 2 O D的 下游 特异性引 物加灭 菌双蒸 水至4 4 5 IA L 。使用时， 2 种引物等体积混匀即可。 D . 2 1 0 p m o l / w L H 5 亚型引物配制 2 O D的上游H 5 亚型引物加灭菌双蒸水至4 9 4 t .L , 2 0 D的下游H S 亚型引物加灭菌双蒸水至4 8 4 f .L 。 使用时， 2 种引物等体积混匀即可。 D . 3 1 0 p m o

39、l 小L H 7 亚型引物配制 2 O D的 上 游H 7 亚 型引 物加 灭菌 双 蒸水 至4 8 7 Ii L , 2 O l 的 下游H 7 亚型引 物加 灭菌双 蒸水至4 8 8 ti L 。 使用 时， 2 种引 物等 体 积混 匀即 可。 D . 4 1 0 p m o l 小L H 9 亚型引物配制 3 O r 的上游H 9 亚型引物加灭菌双蒸水至4 9 2 1 .L , 2 O l ） 的 下游H 9 亚型引物加灭菌双蒸水至5 1 6 p L 。 使用时， 2 种引物等体积混匀即可。 裹 D. 1 引物名称序列扩增片段大小扩增片段位置用途 上游型 特异性引物 下游型特异性引物；

40、 5 ， 一 C A G R T A G - G G G C H A T A A G R A C 一3 5 一（ 3 C A TT G T C T C C G A A G A A A T A A G一 3 3 3 0 饰 核蛋白基因 12 0 0一 15 2 9 禽流感病毒 型鉴定 上游 H S 亚型引物 下游H S 亚型引物 5 ， 一A C A C A T GC Y C A RG A C A TA C T一3 5 一C T Y T GR TT Y AG T G TT G AT G T一3 5 4 5 b y 血凝素基因 1 5 5 一6 9 9 禽流感病毒 H S 亚型鉴定 上游H 7 亚

41、型引物 下游H 7 亚型引物 5 一 （ 3 G G A T A C A A A A T G A A Y A C 7 一3 5 一 C C A T A B A R Y Y T R G T CT G Y T C 一 3 6 3 4 饰 血凝素基因 1 2一6 45 禽流感病毒 H 7 亚型鉴定 上游H 9 亚型引物 下游 H 9 亚型引物 5 一 C T C C A C A C A G A G C A Y A A T G G一 3 5 一 G Y A C A C T T G T T G T T G T R l 一 3 4 8 8 饰血凝素基因 1 5 1 一63 8 禽流感病毒 H 9 亚型鉴定 注： Y =C / T R = A / G H= A / C / T B =G / C / T .