PHVEGF165基因导入促进硬皮病小鼠模型毛发生长及再生.pdf

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1、书书书 文章编号:1 0 0 0 - 5 4 0 4(2 0 0 5)1 1 - 1 1 0 3 - 0 3 论著 p h V E G F 1 6 5基因导入促进硬皮病小鼠模型毛发生长及再生 黎 智, 阎国富, 何 威, 何云志, 黄 海 ( 第三军医大学新桥医院皮肤科, 重庆4 0 0 0 3 7) 提 要:目的 观察V E G F对硬皮病小鼠模型毛发生长的作用。方法 将p h V E G F 1 6 5质粒导入博莱霉素诱导的硬皮病 小鼠模型背部皮肤。每周测量毛发的长度, 常规病理观察皮肤组织病理学改变, 并用免疫组化及原位杂交方法检测V E G F的 表达。结果 发现V E G F有明显促

2、毛发生长作用。p h V E G F 1 6 5质粒导入的小鼠皮肤毛囊数目明显增多, 真皮及毛囊区V E G F 及V E G FmR NA表达增强。结论 V E G F对硬皮病小鼠模型毛囊的再生有明显的促进作用。 关键词:博莱霉素; 硬皮病; 血管内皮生长因子; 毛囊; 电穿孔 中图法分类号:R - 3 3 2;R 4 5 9. 9;R 5 9 3. 2 5 文献标识码:A T r a n s u d a t i o no fp h V E G F 1 6 5 i n t o s c l e r o t i c s k i nt op r o m o t eh a i rg r o w t

3、ha n dr e g e n e r a t i o n i nm i c e L IZ h i,YANG u o - f u,HE W e i,HEY u n - z h i,HUANG H a i(D e p a r t m e n to fD e r m a t o l o g y,X i n q i a oH o s p i t a l,T h i r dM i l i t a r y M e d i c a lU n i v e r s i t y,C h o n g q i n g4 0 0 0 3 7,C h i n a) A b s t r a c t:O b j e c t

4、 i v e T os t u d yt h ee f f e c to fV E G Fo nt h eh a i rg r o w t h i nm i c ew i t hs c l e r o d e r m a . M e t h - o d s p h V E G F 1 6 5w a s t r a n s u d e d i n t o t h e s k i no f t h eb a c ko fm i c ew i t hs c l e r o d e r m a . T h e l e n g t ho f t h eh a i r s w a sm e a s u r

5、 e da n dt h ec h a n g e so f t h es k i nw e r eo b s e r v e dw i t ho p t i c a lm i c r o s c o p y . T h ee x p r e s s i o no fV E G F w a sd e t e r m i n e dw i t hi mm u n o h i s t o c h e m i c a l a s s a ya n di n s i t uh y b r i d i z a t i o n. R e s u I t s V E G Fe x e r t e ds i

6、g n i f i - c a n te f f e c t o n t h eg r o w t ho f h a i r s . T h e t r a n s d u t i o no f t h ep l a s m i d so f p h V E G F 1 6 5 i n t o t h e s k i no fm i c ew i t h s c l e r o d e r m ap r o m o t e dt h e i n c r e a s eo fh a i r f o l l i c l e s . E x p r e s s i o no fV E G FmR N

7、Aa n dp r o t e i no c c u r r e d i nt h e d e r m i sa n dh a i r f o l l i c l e s i n t h e a r e aw i t ht r a n s u d a t i o no f p h V E G F 1 6 5v e c t o r . C o n c I u s i o n V E G Fc a ns i g n i f i - c a n t l yp r o m o t e t h eg r o w t ha n dr e g e n e r a t i o no f t h eh a i

8、r f o l l i c l e s i nt h em i c ew i t hs c l e r o d e r m a . K e yw o r d s:b l e o m y c i n;s c l e r o d e r m a;v a s c u l a rg r o w t hf a c t o r;h a i r f o l l i c l e;e l e c t r o p o r a t i o n 血 管 内 皮 生 长 因 子 (v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t h f a c t o r,V E G F) 家

9、族是一类多功能的细胞因子, 参与众 多生理病理状态下血管的发生和生长。随着对V E G F 生物学功能认识的不断深入, 其对毛囊生长周期机制调 控的研究也逐渐引起人们的重视。 近来, 我们应用博莱霉素( b l e o m y c i n,B LM) 注射于 B A L B/c小鼠皮下, 在较短时期内成功地诱导出小鼠硬 皮病 样 改 变, 建 立 了 硬 皮 病 动 物 模 型。本 研 究 通 过 V E G F基因导入硬皮病小鼠模型皮损, 观察其对毛发生 长的作用, 现报告如下。 1 材料与方法 1. 1 主要试剂 含有p c D NA 3. 1 - V E G F 1 6 5的E.c o

10、l iDH 5 由第四军医大学 基金项目: 国家自然科学基金资助项目(3 0 1 0 0 1 6 2) S u p p o r t e db yt h e N a t i o n a lN a t u r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no fC h i n a (3 0 1 0 0 1 6 2) 作者简介: 黎 智(1 9 7 3-) , 男, 重庆市璧山县人, 硕士研究生, 医师, 主要从事硬 皮病及基因转导方面的研究。电话: (0 2 3)6 8 7 5 5 6 2 9 通讯作者: 阎国富, 电话: (0 2 3)6 8 7 5 5 6 2 9 收稿

11、日期:2 0 0 5 - 0 3 - 0 2; 修回日期:2 0 0 5 - 0 4 - 2 0 口腔医学院组织病理学教研室陈希哲博士惠赠; 博莱霉素(B LM) 粉剂购自日本化学株式会社,1 5m g/支; 多聚甲醛购自S i g m a公 司; 敏感增强型原位杂交检测试剂盒(P O D) 购自武汉博士德公 司。 1. 2 仪器 光学显微镜及荧光倒置显微镜和目镜测微仪( 日本O l y m p u s 产品) ;B T XE CM8 3 0基因转染仪由第三军医大学新桥医院全军 呼吸内科研究所, 全军呼吸病研究重点实验室提供。 1. 3 实验动物 选用第三军医大学实验动物中心提 供 的 雌 性

12、6周 龄S P F B A L B/c小鼠共1 6只, 体质量约2 0g/只, 随机分A、B、C、D4组 (A组为博莱霉素注射及V E G F转染组,B组为博莱霉素注射及 空质粒转染组,C组为P B S注射及V E G F转染组,D组为P B S注 射及空质粒转染组) , 每组4只, 置于清洁级动物饲养室内(2 2 2 4) , 给予普通饲料和水饲养。实验前用电动剃毛剪将背部毛 发剃除。 1. 4 动物模型制备 用P B S将博莱霉素粉剂稀释成1m g/m l溶液, 过滤除菌后, 保存备用。A、B组鼠注射博莱霉素、C、D组鼠注射P B S液于小鼠 背部皮下, 1次/d,0 . 1m l/次,

13、共4周, 每日记录背部皮肤弹性、 外 观等大体变化, 在注射开始后第4周末备用 1。 3011 第2 7卷第1 1期 2 0 0 5年6月 第 三 军 医 大 学 学 报 A C TA A C A D EM I A E ME D I C I NA E M I L I TA R I S T E R T I A E V o l . 2 7,N o . 1 1 J u n . 2 0 0 5 1. 5 p h V E G F 1 6 5质粒的扩增和c D NA探针的标记 1. 5. 1 p h V E G F 1 6 5质 粒 的 扩 增 挑 取 含 有p c D NA 3. 1 - V E G F

14、 1 6 5的E.c o l iDH 5 菌种涂布于已加入Am p(1 0 0g/m l) 的L B琼脂平板上,3 7 培养过夜。取琼脂平板上的单一菌落, 接种于5 0 0m l含Am p(1 0 0g/m l) 的L B培养基中,3 7 摇床, 1 8 02 0 0r/m i n,5h, 以质粒提取试剂盒按说明提取质粒。取5l 进行2g/L的琼脂糖凝胶电泳检验质粒提取结果。置于-2 0 冰箱保存备用。 1. 5. 2 V E G F 1 6 5c D NA探针的制备及标记 将V E G F 1 6 5质 粒经E c oR和B a mH双酶切后,1 . 5%琼脂糖凝胶电泳(5 0V, 1 .

15、5h), 在紫外检测灯下取5 6 0b p处的V E G F 1 6 5c D NA片段, 经 “V” 型槽电泳(1 5 0V, 3 0m i n)回收c D NA片段, 经酚/氯仿抽提、 纯化、 异丙醇沉淀、 乙醇洗涤,-2 0 保存备用。用地高辛2 1 1 2 d UT P作为标记物, 随机引物法标记h V E G F 1 6 5c D NA探针, 标记 程序参照武汉博士德公司地高辛探针试剂盒操作手册进行。 1. 6 外源性V E G F 1 6 5基因的靶向导入 实验前1d将各组备用的实验鼠背部毛发剃光。实验时先将 实验鼠固定好后, 将1 2 0l浓度为2 0 8g/ l p h V E

16、 G F 1 6 5质粒注 射到实验鼠背部皮损区的真皮内, 形成直径约0 . 5c m大小皮丘, 立即用E CM8 3 0方波电击仪(B T X,S a nD i e g o)针形电极刺入隆 起皮丘内, 按2 0 0V/c m,2 0 0m s/p u l s e,1p u l s e设置电穿孔仪, 然 后电击。对照分2组,A、C组注射V E G F质粒并电击,B、C组注 射单纯不含质粒的T E液并电击。 1. 7 大体观察 每周观察各组实验鼠电击部位毛发生长情况并用目镜测微 仪测量生长毛发的长度。第4周处死4组中的实验小鼠, 取电击 区背部皮肤, 分别用液氮冻存。 1 . 8 组织病理观察

17、鼠皮肤组织取材后固定于用P B S配制的1 0%甲醛溶液中, 常 规石蜡包埋, 组织切片行HE染色, 光镜下观察。 1. 9 免疫组化 将皮肤标本用4%多聚甲醛固定2 4h(4 ) 后, 按常规行石 蜡包埋、 切片并脱蜡。切片厚5m, 采用S - P免疫组化法检测皮 肤中V E G F的表达。滴加V E G F抗体5 0l,4 过夜, 加生物素 标记的羊抗兔第二抗体5 0l, 室温孵育4 5m i n; 滴加新鲜配制的 D A B显色液1滴, 自来水冲洗, 苏木精复染; 二甲苯透明, 中性树 胶封片; 镜下观察结果。阴性对照以双蒸水代替第一抗体作为质 控标准; 结果判定标准 阳性反应呈棕黄色。

18、 1. 1 0 V E G F 1 6 5mR NA的原位杂交检测 将液氮冻存的标本切成81 0m的冰冻切片经预处理后, 4 2预杂交4h, 然后去除预杂交液, 分别加含标记探针浓度为 V E G F(1 2 5n g/m l) 的杂交液,4 2杂交1 6h。洗片, 免疫检测, 显 色, 清水终止反应, 脱水、 透明、 封片, 在光镜下观察结果, 阳性结 果为细胞内出现紫蓝色颗粒。设不加探针的预杂交液代替杂交 液为空白对照。 1. 1 1 统计学方法 采用配对t检验。 2 结果 2. 1 皮肤大体观察 每只实验鼠每周拔出1 0根电击区生长毛发在倒置显微镜下 通过目镜测微器测量鼠毛发的长度, 对

19、毛发生长速度进行检测, 计算出1 0个毛发生长长度的平均值( -xs) , 详见表1。 表1 各组实验鼠各周毛发长度测量值 ( l/mm, xs) T a b1 T h eh a i r l e n g t ho f t h es c l e r o d e r m am o u s ea n dc o n t r o lm o u s ea t d i f f e r e n tw e e k s(l/mm, xs) G r o u p 1 s tw e e k2 n dw e e k3 r dw e e k4 t hw e e k A0. 80. 11. 70. 42. 50. 33. 4

20、0. 2* B0000 C1. 10. 22. 30. 23. 20. 34. 10. 2 D0. 50. 21. 10. 31. 60. 32. 30. 1 *:P0. 0 5,v sBg r o u p;:P0. 0 5,v sDg r o u p 2. 2 常规病理 每张组织切片在显微镜下随机取5个视野进行毛囊记数, 发 现:博莱霉素注射及V E G F转染的A组小鼠注射区皮肤的毛囊 数较博莱霉素注射及未转染V E G F的B组鼠毛囊数明显增多A 组鼠组织切片毛囊数为(1 21 . 6) 个,B组鼠组织切片毛囊数为(6 1 . 3) 个,P0 . 0 5 ;P B S注射及V E G F

21、转染的C组和P B S注 射及空质粒转染的D组相比较毛囊数无明显差异C组鼠组织切 片毛囊数为(2 01. 4) 个,D组鼠组织切片毛囊数为(2 01 . 5) 个, P0 . 0 5 ( 图1) 。 图1 硬皮病V E G F转化组实验鼠背部皮肤常规病理 (HE1 0 0) F i g1 H i s t o l o g yo f t h es c l e r o t i cs k i nt r a n s f e c t e dw i t hV E G Fi ns c l e r o - d e r m am o u s e (HE1 0 0) 2. 3 皮肤免疫组化 V E G F转染的A及

22、C组小鼠皮肤切片中,V E G F在真皮成层 及毛囊区中有强的阳性表达( 图2) 。空质粒转染的B及C组小鼠 皮肤切片中,V E G F在真皮成层及毛囊区中有阳性表达较弱。 2. 4 原位杂交 V E G F转染的A及C组小鼠皮肤切片中,V E G F在真皮成层 及毛囊区细胞胞浆中有强的阳性表达( 图3) 。空质粒转染的B及 C组小鼠皮肤切片中,V E G F在真皮成层及毛囊区细胞胞浆中有 较弱阳性表达。 4011 第 三 军 医 大 学 学 报 第2 7卷 图2 硬皮病V E G F转化组实验鼠皮肤V E G F免疫组化 (S - P 2 0 0) F i g2 V E G Fp r o t

23、 e i ne x p r e s s i o ni nt h es c l e r o t i cs k i nt r a n s f e c t e dw i t h V E G Fi ns c l e r o d e r m am o u s e (S - P2 0 0) 图3 硬皮病V E G F转化组实验鼠皮肤V E G F原位杂交 (N B T 2 0 0) F i g3 V E G Fm R N Ae x p r e s s i o nd e t e c t e db yi n s i t uh y b r i d i z a t i o ni nt h e s c l e r

24、o t i cs k i nt r a n s f e c t e dw i t hV E G Fi ns c l e r o d e r m a m o u s e (N B T2 0 0) 3 讨论 V E G F是1 9 8 9年由F e r r a r a和G i s p h a r o w i z等从牛 脑垂体滤泡星状细胞体外培养液中分离、 提纯得来的一 种糖蛋白, 分子量为( 3 44 5)1 0 3。V E G F能特异性地 作用于血管内皮细胞, 具有维持血管正常状态和完整性、 提高血管通透性、 促血管生成的作用。近年来对V E G F 在毛囊周期性循环中的作用及其促进毛发生长机

25、制的研 究也逐渐引起人们的重视。 毛发生长周期变化的调控机制虽还不很清楚, 以往 的研究表明毛发的生长受到许多可溶性因子的影响, 如 雄激素、 b F G F、 干细胞生长因子和真皮乳头释放的其它 生长因子等。L a c h g a r等 2,3首先证实了毛乳头细胞分 泌V E G F, 并发现V E G F及其受体在生长期毛囊的毛乳 头细胞表达, 进入退行期后逐渐降低, 静止期降至最低, 说明V E G F参与了毛发生长周期的调控; 还发现体外培 养的人毛乳头细胞加入V E G F后促使毛乳头细胞分裂 增殖。故 推 测 毛 乳 头 细 胞 通 过 自 分 泌 的 方 式 产 生 V E G

26、F, 并作用于毛乳头细胞, 从而对毛囊生长的调控起 重要的作用 4。 Y a n o等 5以 V E G F转基因小鼠为动物模型。该鼠 动物模型脱毛后第1 2及1 5天的组织学检查显示毛囊周 围的血管体积较野生型小鼠增加了4 0%, 毛球的最大直 径和毛干的直径也增加3 0%, 所以K i i c h i r oY a n o认为 V E G F可能通过诱导毛囊周围的血管形成而调控毛囊周 期性循环和促进毛发生长。 国内范卫新等 6用 C 5 7 B 2 L/6 J小鼠触须毛囊体外 培养模型, 对V E G F促毛囊生长的生物学特性进行研 究。结果显示V E G F有明显促毛发生长作用。V E

27、G F 促毛囊生长 作 用 随 其 浓 度 增 高 而 增 强。实 验 还 显 示 V E G F在毛囊的生长期各阶段都有明显的表达, 而在退 行期、 休止期几乎没有表达。生长期的早期毛囊V E G F 表达较多。随着生长期毛囊不断生长发育成熟, 到生长 期中期和晚期V E G F表达逐渐减少。这进一步证实了 V E G F对毛囊生长周期和毛发生长正相调节的重要性。 研究表明, 在硬皮病的硬化期和萎缩期, 患者皮损皮 肤出现毛发脱落和毛发稀少, 从病理表现上看, 硬皮病的 附属器结构( 毛囊、 皮脂腺、 汗腺) 数量均减少, 真皮萎缩, 但其机制并不清楚。在本实验中, 我们通过建立的硬皮 病小

28、鼠模型, 通过将外源性V E G F 1 6 5基因的导入硬化 萎缩、 体毛脱落的皮肤组织, 结果显示, 在真皮血管增生 的基础上, 生长期毛囊的数量明显增加, 显著促进毛发的 生长, 整体真皮组织变得丰富, 改善了硬化萎缩的皮肤组 织。我们还观察到上述组织像的变化仅局限于V E G F 基因转染区, 而且在毛囊增生的区域皆有明显的血管增 生。本实验结果首先在活体组织中证明了V E G F的促 毛囊生长作用, 但其促毛囊生长作用的机制可能在于 V E G F对毛囊的直接作用, 也可能是通过促进血管增生, 进而改善了局部的微循环而发挥作用。 参考文献: 1黎 智,阎国富,胡美玲,等.局部注射博莱

29、霉素诱导小鼠硬皮病模 型J.重庆医学,2 0 0 4,3 3(1 2) :1 8 2 1-1 8 2 3. 2C a s t e x R i z z iN,L a c h g a rS,C h a r v e r o n M,e ta l.I m p l i c a t i o no f V E G F,s t e r o i dh o r m o n e s a n dn e u r o p e p t i d e s i nh a i r f o l l i c l e c e l l r e s p o n - s e sJ.A n nD e r m a t o lV e n e r e

30、 o l,2 0 0 2,1 2 9(5P t2) :7 8 3-7 8 6. 3L a c h g a rS,C h a r v e r o nM,S a r r a u t eJ,e t a l.I nv i t r om a i np a t h w a y s o fs t e r o i da c t i o n i nc u l t u r e dh a i r f o l l i c l e c e l l s:v a s c u l a r a p p r o a c hJ. J I n v e s t i gD e r m a t o lS y m pP r o c,1 9

31、9 9,4(3) :2 9 0-2 9 5. 4L a c h g a rS,C h a r v e r o nM,S a r r a u t eJ,e t a l.A n t i - a n d r o g e n sa n de s - t r o g e n s:m o d u l a t o r so fV E G Fe x p r e s s i o ni nc u l t u r e dh a i rd e r m a lp a - p i l l ac e l l sJ. E x pD e r m a t o l,1 9 9 9,8(4) :3 3 6-3 3 8. 5Y a n

32、 oK,B r o w nLF,D e t m a rM. C o n t r o lo fh a i rg r o w t ha n df o l l i c l es i z e b yV E G F - m e d i a t e da n g i o g e n e s i sJ. JC l i nI n v e s t,2 0 0 1,1 0 7(4) :4 0 9- 4 1 7 . 6范卫新,朱文元.血管内皮细胞生长因子对小鼠触须毛囊体外培养的 研究J.临床皮肤科杂志,1 9 9 9,2 8(2) :8 0-8 3. ( 编辑 王 红) 5011 第1 1期 黎 智, 等. P h V E G F 1 6 5基因导入促进硬皮病小鼠模型毛发生长及再生