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1、 遗传免疫学 PCR-SBT 法分析内蒙古地区鄂温克族人群 HLA-DPB1 等位基因型别 海荣毕力夫徐安龙苏秀兰 （内蒙古医学院分子生物学研究中心， 呼和浩特 010059） 中国图书分类号R394.5文献标识码A文章编号1000-484X （2005） 08-0602-03 摘要 目的： 调查内蒙古鄂温克族人群人类白细胞抗原 （Human leukocyte antigen， HLA） DPB1 基因多态性。方法： 采用 SBT （sequecing-based-typing） 法。结果： 在所检测的 DPB1 等位基因中， 共检出 20 个等位基因， 其中频率最高的是 DPB1*0201
2、2 （24.4%） ， 其次是 DPB1*0402 （22.6%） ， DPB1*0401 （20.2%） ， DPB1*0501 （10.7%） ， 其余等位基因频率均低于 5%。结论： 内蒙 古地区鄂温克族人群中 HLA-DPB1 分布特征有独特性， 为本民族的人类学及疾病相关性研究提供依据。 关键词 遗传多态性； HLA-DPB1 基因； 鄂温克族； PCR-SBT The study of HLA-DPB1 allele polymorphism in Ewenki from Inner Mongolian HAI Rong， BI Li-Fu， XU An-Long， SU Xiu-
3、Lan . Molecular Biology Research Center of Inner Mongolia Medical College， Huhehaote 010059， China Abstract Objective： To study the HLA-DPB1 allele polymorphism in Ewenki from Inner Mongolian. Methods： HLA-DPB1 allele polymorphism in normal Ewenki were determined by PCR with sequencing-based-typing
4、（SBT） . Results： 20 HLA-DPB1 alleles were observed and compared with other ethnic groups， the allele frequency of HLA-DPB1*02012 （24.4%）and DPB1*0402 （22.6%） ， DPB1*0401 （20.2%） ， DPB1*0501 （10.7%）are highest， while others are lower.Conclusion： The distributions of HLA-DPB1 alleles frequencies in no
5、rmal Ewenki from Inner Mongolia has a unique style.It is most important to further study anthropology and related to illness in Ewenki nationality. Key words Genetic polymorphism； HLA-DPB1 gene； Ewenki ethnic； PCR-SBT HLA-DP 是表达于 B 细胞、 抗原提呈细胞和激 活的 T 细胞表面的糖蛋白。DP 分子是异二聚体， 由 一条链和链组成， 后者具有高度多态性。链和 链分别由人
6、第 6 号染色体上 DPA1 和 DPB1 基因编 码。疾病关联研究发现， 某些 HLA-DP 等位基因与 自身免疫病相关， HLA-DPB1 基因遗传多态性具有 显著的群体和地区差异， 故可被用于移植配型、 分析 正常群体和疾病群体间疾病易感， 或用于研究不同 地区人群进化关系。本文采用精确度极高的基于测 序 （sequencing-based-typing， PCR-SBT） 法分析内蒙古 鄂温克族人群 HLA-DPB1 基因多态性。 1材料与方法 1.1内蒙古呼伦贝尔市鄂温克族自治区健康无血 缘关系的个体 84 例， 年龄 15 20 岁。每人抽取 2 ml 静脉血， 采用枸橼酸钠抗凝。
7、 1.2主要设备及试剂均由中山大学医药分子生 物学实验室提供。 1.3基因组 DNA 的制备采用北京天为时代科技 有限公司试剂盒提取， 操作按说明进行。 本课题受内蒙古医学院重大项目 （ZY2003ZD010） 资助 中山大学生命科学学院医药分子生物学实验室， 广州 510275 作者简介： 海荣 （1974 年 - ） ， 在读研究生， E-mail： xlsu 。 1.4PCR 扩增 1.4.1扩增引物及测序引物见表 1。 1.4.2PCR 扩增条件及反应体系反应产物检测 反应体系 （总体积 50l） ： 10 PCR Buffer 5l， dNTP （2.5 mmol/ L each）
8、1.5l， Primer 1.5l （10P DPBE2F + DPBE2R）（2 U/l） Taq DNA polymerase 0.3 l， 模板 DNA 0.5l， ddH2O 40.9l。反应条件： 95预变性 3 分钟， 94 50 秒， 69 50 秒， 40 个循环， 72 60 秒， 72 10 分钟， 12保存。 1.4.3反应产物检测反应完毕， 每样品取 5 l 用 2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况以及产物浓度。 剩余样品 - 20冻存待测序。 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果， 并 DNA marker DL2000 做对照， 得到与第 3 条带 500 bp 相近的条 带， 见
9、图 1。 表 1 扩增引物及测序引物 Tab.1Amplification primer and sequencing primer Primers namePrimers sequence DPBE2FTGA TCA CTC AGT GCC CCT GAG CTC DPBE2RGCC CAA AGC CCT CAC TCA CCT DPSEQTGC GTG GTG AGA AAA CAG GC 1.4.4PCR-SBT 分型将阳性产物荧光标记双脱 206中国免疫学杂志 2005 年第 21 卷 氧 法 测 序，以 ABI 公 司 的 DNA Sequencing Kit （BigDyeTMT
10、erminator V3.0 Cycle Sequencing） 进行 PCR 产物测序， ABI3700 自动遗传分析仪跑毛细管电泳 并读取核酸序列。测序结果利用中山大学分子医药 中心编写的配套的分型软件 AGP （Automatic Genotyp- ing Program） ， 比较 IHWG 组织最新公布的已知 HLA- DPB1 等位基因， 确定其对应、 相一致的等位基因， 从 而得到高分辨率测序分型结果， 对不明确杂合子克 隆测序。平行碱基判读的方法根据国际化学学会统 一命名的规则进行。基本原则是： 同时出现 A、 C 时 记为 M； A、 G 时记为 R； A、 T 记为 W；
11、C、 G 记为 S； C、 T 记 Y； 98 号样品的测序图见图 2。 1.5统计学处理运用直接计数法计 DPB1 位点 的等位基因频率， 并使用 Arlequin v2.000 软件包对 结果进行纯合度检验、 Harkdy-Weinberg 平衡分析 1。 图 1 98 号样品琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1Agarose gel electrophoresis of No.98 sample 图 2 98 号样品测序图 Fig.2The sequencing map of No.98 sample 2结果 2.1DPB1 基因频率分析结果见表 2。 2.2纯合度检验、 Hardy-Weinb
12、erg 平衡分析结果 见表 3、 表 4。 根据 Ewens-Watterson 检验的结果， DPB1 的观测 值与期望值相比没有显著差异 （ P = 0.756 0.05） ， 而且 DPB1 观察值大于期望值， 有一定的定向选择 倾向， 对此位点的 Hardy-Weinberg 平衡分析结果显 示， 此位点处于 Hardy-Weinberg 不平衡状态。 表 2 DPB1 位点的等位基因频率 Tab.2HLA-DPB1 alleles frequency Allelesn = 168Gene frequencies DPB1*02012410.244 DPB1*0301150.029 8
13、 DPB1*0401340.202 DPB1*0402380.226 DPB1*0501170.107 DPB1*060110.005 95 DPB1*090120.011 9 DPB1*1101110.005 95 DPB1*140110.005 95 DPB1*160110.005 95 DPB1*170120.011 9 DPB1*190110.005 95 DPB1*2001140.023 8 DPB1*210110.005 95 DPB1*220130.017 85 DPB1*230140.023 8 DPB1*410170.041 7 DPB1*450120.011 9 DPB1*
14、510120.011 9 DPB1*730110.005 95 Total1681.00 表 3 Hardy-Weinberg 平衡分析 Tab.3Hardy-Weinberg equilibrium Observed HerterExpected HeterPsd 0.781 610.867 320.000 000.000 00 表 4 纯合度检验 Tab.4Ewens-Watterson tests Observed FExpected FP 0.167 220.146 240.756 00 306海荣等PCR-SBT 法分析内蒙古地区鄂温克族人群 HLA-DPB1 等位基因型别第 8 期
15、 3讨论 我国内蒙古地区鄂温克族人群中高频率 DPB1 等位基因是 DPB1*02012 （24.4%） 、*0402 （22.6%） 、 *0401 （20.2%） 和*0501 （10.7%） ， 其余等位基因频率 均低于 5%。分析国内外相关资料， 我们发现 DPB1 *0501 分布大致表现为由西向东逐渐递增的趋势。 在大多数东亚群体中， 包括我国大部分人群、 日本 人、 东南亚人群等， 都检出 DPB1*0501 高频分布， 一 般在 30%以上 （占第一位） ， 有的甚至超过 50% 如 布依 族 （52.1%） 2 。中 亚、 高 加 索 地 区 DPB1 * 0501 降至 1
16、0% 左右， 如维吾尔族 （7.0%） 3。而鄂 温克族人群 （10.7%） 与高加索地区 DPB1*0501 频 率分布接近， 提示鄂温克族可能由贝加尔湖地方起 源 4。而我国南方群体该等位基因频率较北方群体 为高 5， 6。在西欧， DPB1*0501 属稀有等位基因。 另一方面， DPB1*04 （DPB1*0401 和*0402） 分布却 呈由西向东逐渐递减的趋势。西欧人群 DPB1*04 基因分布一般在 60% 以上， 中亚地区维吾尔族、 哈 萨克族 DPB1*04 均为 40.4% 6， 而东亚人群一般 仅为 15% 20%。DPB1*04 基因在北方少数民族 分布多于南方少数民族
17、 5， 6， 某些西南民族中频率 更低 （拉 祜族 为 6.5%， 布依 族 甚 至 只 有 2.8%） 。 DPB1*0201 在全世界都有较均匀分布， 约 10% 20%之间。但是， 该等位基因在鄂温克族人群中达 24.4%， 这可能与该民族与其他北方群体有广泛的 基因交流有关。根据我国历史学及考古学研究， 关 于鄂温克族的民族来源， 目前有两种不同观点：鄂 温克族起源于贝加尔湖沿岸及以东地区的北室韦， 他们与鄂伦春、 赫哲等通古斯民族有共同的渊源关 系；鄂温克族起源于乌苏里江流域黑水 4。鄂温 克族人群 DPB1 等位基因频率规律提示， 鄂温克族 属北方人群。 由于 DP 糖蛋白在细胞表
18、面表达水平低， DP 是 类分子中最后一个被发现的分子， 开展对 DPB1 基因多态性研究有助于了解与鄂温克族的族源， 同 时也为鄂温克族 HLA 疾病相关性研究提供正常对 照， 为研究本地区人群免疫遗传学背景以及在全国 范围内进行群体比较提供了有价值的资料， 同时也 添补了国内鄂温克族 HLA-DPB1 研究的空白点。 4参考文献 1Schneider S， Roessli D， Excoffier L.A software for population genetics da- ta analysisJ .Genetics and Biometry Laboratory， Universi
19、ty of Geneva， Switzerland， 2000. 2徐星培， 汪超英， 曹剑峰 et al . 中国布依族 HLA-类基因的 DNA 分型研究J .中华微生物学和免疫学杂志， 1992； 12： 285. 3Mizuki N， Ohno S， Ando H et al . Major histocompatibility complex class alleles in an Uygur population in the Silk Route of Northwest China J .Tissue Antigens， 1998； 51： 287. 4鄂温克族简史编写组 .
20、鄂温克族简史M . 内蒙古人民出版社， 1983： 5. 5Yonggui F， Zehuan L， Jianghai L et al . HLA-DRB1， DQB1 and DPB1 polymorphism in the Naxi ethnic group of Southwestern ChinaJ .Tissue Antigens， 2003； 61 （2） ： 179-183. 6Gene L， Imanishi T， Tokunaga K et al .Determination of HLA classal- leles by genotyping in a Manchu po
21、pulation in the northern part of China and its relationship with Han and Japanese populationsJ . Tissue Anti- gens， 1995； 46： 111-116. 收稿 2005-03-10 （编辑徐杰） 征订启事 欢迎订阅 中国免疫学杂志 中国免疫学杂志 是中国免疫学会会刊， 是国内外公开发行的国家级学术期刊， 为基础医学、 生物学的核心期刊， 是美国 化学文摘 （CA） 的源期刊， 被科学引文索引 （SCI） 摘录， 为中国科学引文数据库、 中国学术期刊文摘、 中国生物医学文摘的来源
22、期刊。曾获第二届国家期刊奖百种重点期刊、 中国首批期刊方阵 “双效” 期刊、 首届北方优秀期刊奖。本刊主要栏目有分子与 细胞免疫学、 遗传免疫学、 免疫药理学、 神经内分泌与免疫、 肿瘤免疫学、 SARS 与免疫、 临床免疫学、 生殖免疫学、 免疫学技术与 方法、 中医中药与免疫、 兽医免疫学、 教学园地、 述评、 专题综述等， 并开设了国内外免疫学研究的重点、 热点、 前沿课题等专题 讲座专栏， 增设了实用临床免疫学栏目。不仅内容更新更快， 而且信息量更大。 本刊为月刊， 国际大 16 开， 2006 年增至 96 页， 定价 10.00 元， 全年 120.00 元， 邮发代号 12-89， 全国邮局均可订阅。为减轻 自费读者负担， 对自费个人订户实行八折优惠， 每本 8.00 元 （含邮费） ， 如错过订阅时间可直接汇款到 中国免疫学杂志 编辑 部， 请注明所购卷期、 册数及 “自费” 字样。同时欢迎医药、 生物制剂、 医疗器械厂家刊登广告及作者网上投稿。 地址： 长春市建政路 971 号 中国免疫学杂志 编辑部邮编： 130061 电话： 04318925027传真： 04318925027 E-mail： zhmizazh ， 中国免疫学杂志 编辑部 406中国免疫学杂志 2005 年第 21 卷